Результат интеллектуальной деятельности: Тест-система для прогнозирования развития метастазов у больных раком желудка на основании определения числа копий HV2 мтДНК

Изобретение относится к медицине, а именно к молекулярной биологии, онкологии, и может быть использовано для прогнозирования вероятности развития метастазов у пациентов с диагнозом рак желудка.

Рак желудка занимает одно из ведущих мест в общей структуре онкологических заболеваний в РФ: 7,9% у мужчин и 5,2% у женщин (показатели заболеваемости). В структуре смертности населения России от злокачественных новообразований рак желудка занимает второе место с показателем 10,3% или 30409 человек в 2015 году (см. Под редакцией А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой // Злокачественные новообразования в России в 2015 году (см. заболеваемость и смертность), Москва, 2017).

Метастазы возникают у 80-90% больных раком желудка, при этом выживаемость составляет 65% в случае ранней диагностики заболевания и менее 15% на поздних стадиях развития онкологического процесса (см. Takuji G., Yanagisawa A., Sasako М. Ono Н, Nakanishi Y., Shimoda Т., Kato Y. Incidence in lymph node metastasis from early gastric cancer: estimation with a large number of cases at two large centers. // Gastric Cancer. - 2000. - V. 3. - P. 219-225). Поэтому поиск потенциальных молекулярных маркеров, пригодных для ранней диагностики и прогнозирования тяжести течения этого заболевания является актуальной задачей.

Изменение копийности генов (Copy Number Variation или CNV) является одним из основных механизмов контроля раковой клеткой ключевых для выживания и малигнизации экспрессии генов. Копийность генов - вид генетического полиморфизма, возникающий в результате несбалансированных хромосомных перестроек, таких как делеции и дупликации. Результатом вариации может явиться снижение или повышение числа копий определенного гена, и, следовательно, пониженная или повышенная экспрессия продукта гена - белка или не кодирующей РНК. CNV представляют собой критические генетические события, которые способствуют развитию и прогрессированию злокачественных новообразований у человека (см. Кит О.И., Водолажский Д.И., Кутилин Д.С., Гудуева Е.Н. Изменение копийности генетических локусов при раке желудка // Молекулярная биология. - 2015. - Т. 49, №4. - С. 658-666.).

Изменение числа копий митохондриальной ДНК (определяемое по копийности локуса HV2), характерное для раковых клеток, отражает состояние окислительного фосфорилирования малигнизированных клеток (см. Scatena R. Mitochondria and cancer: a growing role in apoptosis, cancer cell metabolism and dedifferentiation. // Adv Exp Med Biol. - 2012. - V. 942. - P. 287-308). HV2 - гипервариабельный участок с 33 по 160 нуклеотид D-петли митохондриальной ДНК (мтДНК), относящийся к регуляторным не кодирующим элементам, поэтому он обладает высокой изменчивостью. Копийность мтДНК в лейкоцитах крови определяли во многих исследованиях при различных видах рака, хотя вопрос о ценности показателя копийности мтДНК в лейкоцитах для диагностики и прогноза лечения опухолей желудка остается дискуссионным.

Так, в широкомасштабном исследовании, включавшем в себя группы пациентов с раком желудка на различных стадиях и условно здоровых доноров, не было обнаружено значимой ассоциации между числом копий мтДНК в лейкоцитах и риском развития рака желудка, но, была показана достоверная корреляция данного показателя и прогрессии заболевания (см. Liao L.M. et al. Mitochondrial DNA Copy Number and Risk of Gastric Cancer: a Report from the Shanghai Women's Health Study // Cancer Epidemiol Biomarkers Prev; 2011, 20(9); 1944-9).

Результаты другого исследования продемонстрировали достоверную ассоциацию копийности мтДНК с риском малигнизации тканей желудка (см. Fernfndes J. et al. Circulating Mitochondrial DNA Level, a Noninvasive

Biomarker for the Early Detection of Gastric Cancer // Cancer Epidemiol Biomarkers Prev; 2014. 23(11); 2430-8).

Поэтому, в качестве маркеров для прогнозирования вероятности развития метастазов в лимфоузлы у пациентов с диагнозом рак желудка адекватно использование показателя относительной копийности HV2.

Из патентных источников известно следующее:

«Способ прогнозирования метастазов у больных раком желудка» (см. патент RU №2445632 С1, опубл. 20.03.2012. Бюл. №8). Сущностью способа является то, у больных раком желудка определяют маркер пролиферативной активности Ki-67 и маркеры апоптоза р53 и bcl-2. Проводят иммуногистохимическое исследование и устанавливают, что при абсолютных значениях экспрессии при перстневидно-клеточном раке: р53 - 10%, bcl-2 - 10%, Ki-67 - 12%; при недифференцированном раке: р53 - 13%, bcl-2 - 11%, Ki-67 - 9%; при аденокарциноме: р53 - 10%, bcl-2 - 9%, Ki-67 - 12%) прогнозируют возникновение метастазов в лимфоузлах. При р53 - 6%, bcl-2 - 5%, Ki-67 - 10% прогнозируют отсутствие метастатического поражения лимфоузлов.

«Способ прогнозирования метастазирования опухолевого процесса у больных раком желудка» (см. патент RU 2455924 С1, опубл. 20.07.2012, Бюл. №20). В периферической венозной крови обследуемых лиц определяют абсолютное содержание моноцитов и концентрацию фактора некроза опухоли альфа (TNF-α). При содержании моноцитов менее 0,35×10⁹ кл/л и TNF-α более 55 пг/мл прогнозируют высокую вероятность метастазирования.

Способ позволяет сократить время и упростить методику прогнозирования, так как позволяет использовать материалы, реактивы и методы исследования, широко применяемые в стандартной клинико-лабораторной практике.

Однако эти способы принципиально отличаются от нашего, обладают меньшей чувствительностью или специфичностью, чем предлагаемая нами тест-система.

В патенте «Способ прогнозирования развития метастазов у больных раком желудка» (см. патент RU 2624505 С1, опубл. 04.07.2017, Бюл. №19) осуществляют амплификацию фрагментов генетических локусов В2М, HV2 и CFLAR методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с помощью набора высокоспецифичных праймеров на матрице выделенной ДНК, проводят количественную интерпретацию результатов амплификации и расчет относительной копийности генов по формуле rC=2^{-(Ct(ген мишень)-Ct(В2М))} (rc - относительная копийность гена в опухолевой ткани, Ct - среднее значение сигналов флюоресценции), сравнивают полученные значения относительной копийности генов с прогностическими, и при значениях rC_HV2<870 и rC_CFLAR>0,40 прогнозируют отсутствие метастазов, а при значениях rC_HV2>870 и rC_CFLAR<0,40 прогнозируют развитие метастазов.

Однако предлагаемая авторами система более сложна для клинической реализации, так как обладает большей сложностью в интерпретации полученных результатов, и имеет более высокую себестоимость проведения одного исследования в пересчете на одного пациента.

Анализ патентных источников (www.fips.ru) также показал отсутствие действующих патентов и заявок на изобретение «Тест-система для прогнозирования развития метастазов у больных раком желудка на основании определения числа копий HV2 мтДНК».

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание и внедрение новой, простой в исполнении, не дорогостоящей и точной тест-системы с уникальными высокоспецифичными последовательностями синтетических олигонуклеотидов (праймеров) для прогнозирования развития метастазов у больных раком желудка.

Технический результат достигается тем, что тест-система что содержит реагенты для амплификации ДНК в режиме реального времени (ПЦР-РВ) и контрольные смеси, смесь для ПЦР-РВ реакции, содержащую 0,57 мМ dNTPs, 7,1 мМ MgCl₂, 2,7-кратный ПЦР-буфер с 2,9-кратной концентрацией красителя EvaGreen Dye и 7,1% ДМСО, ДНК-полимеразу Thermus aquaticus 5 ед/мкл и высокоспецифичные праймеры для генов HV2 и В2М с концентрацией 1,8 мкМ каждого в водном растворе, праймеры для гена HV2: прямой , обратный ; для гена В2М: прямой , обратный .

Заявленный анализ основан на определении количества копий локуса HV2 относительно референсного локуса В2М (β-2 микроглобулин) в опухолевой ткани желудка, и последующем сравнении полученных значений с интервалом копийности rC_HV2 характерным для развития метастазов или их отсутствия.

Заявленная тест-система включает следующие приемы: выделение тотальной ДНК из тканевых проб или из парафиновых блоков с помощью метода фенол-хлороформной экстракции; определение относительной копийности генетических локусов методом ПЦР-РВ в присутствии красителя EVA-Green и специфичных праймеров на матрице выделенной ДНК; анализ первичных данных с помощью программного продукта амплификатора; расчет относительной копийности гена (rC) на основании соотношения сигналов, продуцируемых амплификатами изучаемой и референсной последовательностей, сравнением rC пробы с прогностическими значениями копийности rC _{стандарт}, определенными для больных раком желудка с метастазами или без метастазов в лимфоузлах.

Заявленная тест-система, рассчитанная на 50 определений, включает:

1. Смесь для ПЦР-РВ реакции (Mix_PCR) - 1500 мкл, содержащую 0,57 мМ dNTPs, 7,1 мМ MgCl₂, 2,7 кратный ПЦР-буфер с 2,9 кратной концентрацией красителя EvaGreen Dye и 7,1% ДМСО.

2. ДНК-полимеразу Thermus aquaticus 5 ед/мкл (Taq) - 50 мкл

3. Смесь прямого и обратного праймеров с концентрацией 1,8 мкМ каждого для локуса HV2 (HV2_Mix) - 500 мкл (смесь включает Milli-Q воду для ПЦР - реакции)

4. Смесь прямого и обратного праймеров с концентрацией 1,8 мкМ каждого для гена В2М (RefMix)) - 1500 мкл (смесь включает Milli-Q воду для ПЦР - реакции)

5. Контроль реакционной смеси (стандартная ДНК с концентрацией 2 нг/мкл) - 500 мкл

6. Отрицательный контроль (контроль без матрицы, Milli-Q вода обработанная DEPC) - 500 мкл.

Из расчета на одну ПЦР-РВ реакцию смесь должна содержать перечисленные выше компоненты в следующем соотношении:

7,0 мкл Mix_PCR+0,2 мкл Taq+6,8 мкл HV2_Mix (или Ref_Mix)+6 мкл матрицы*

* - ДНК нормализованная до концентрации 2 нг/мкл, отрицательный контроль или контроль реакционной смеси.

Для тест-системы были разработаны специфичные олигонуклеотидные прямые и обратные праймеры для локусов HV2 и В2М. Дизайн специфичных олигонуклеотидных праймеров (таблица 1) осуществлялся с использованием референсных последовательностей NCBI GenBank на основе следующих принципов: область отжига олигонуклеотидных праймеров должна быть в диапазоне 58-63°C; GC-состав в диапазоне 40-60%; в последовательности праймера должны отсутствовать стабильные вторичные структуры - шпильки и димеры, e-value последовательности праймера должно стремится к нулю и быть не больше 0,05, a query coverage (покрытие целевой последовательности) 100% (для версии BLASTN 2.3.1+), температуры отжига

праймеров (forward и reverse) не должны различаться друг от друга более чем на 0,5°.

Работу с тест-системой, содержащей разработанные специфичные олигонуклеотидные праймеры, осуществляют следующим образом.

На первом этапе отбираются образцы опухолевых тканей из операционного или биопсийного материала. Для транспортировки в лабораторию и хранения образцы замораживаются в жидком азоте.

Фрагменты ткани измельчаются скальпелем и/или ножницами, затем растираются в фарфоровых ступках в присутствии лизирующего SDS-содержащего буфера. К лизатам добавляется протеиназа К и инкубируется при t=56°C в течение 1 часа.

ДНК выделяется из прозрачного лизата тканей с использованием фенол-хлороформной экстракции (см. Корниенко И.В., Водолажский Д.И., Вейко В.П. и др. Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел. - Ростов-н/Д: ООО Ростиздат, 2001). Концентрация полученных препаратов ДНК измеряется на флюориметре. Для проведения ПЦР-РВ концентрацию ДНК в каждом образце нормализуют до 2 нг/мкл. Реагенты для выделения ДНК и определения концентрации ДНК не входят в состав тест-системы.

Анализируемые последовательности генетических локусов амплифицировали в 20 мкл ПЦР-смеси, содержащей 12 нг ДНК, 0,20 мМ

dNTPs, 2,5 мМ MgCl₂, ПЦР-буфер, краситель EvaGreen, 2,5% ДМСО и 0,05 е.а./мкл реакционной смеси ДНК-полимеразы Thermus aquaticus, и по 612 нМ прямого и обратного праймеров для референсного гена или гена-мишени.

Количественную ПЦР-РВ амплификацию проводили на термоциклере по следующей программе: t=95°C в течение 4 мин. 40 циклов: t=95°C в течение 10 с, t=58°C в течение 30 с, t=72°C в течение 30 с. Разработанные праймеры обеспечивали специфичную амплификацию необходимого количества продукта и не образовывали между собой высокоэнергетических внутренних структур: шпилек и дуплексов.

Для выполнения анализа необходимо провести две амплификации (реакции ПЦР-РВ). В первой проверяется качество ДНК и работоспособность тест системы. Реакция проводится с использование смеси праймеров для В2М. Дальнейшее использование ДНК в тест-системе и тест-системы возможно, если соблюдаются следующие условия:

1) Ct_B2M для образца ДНК не превышает 26 цикла.

2) Ct_B2M контроля реакционной смеси должно быть не выше 24 цикла

3) Ct_B2M для отрицательного контроля должен отсутствовать.

Во второй амплификации определяется уровень сигналов, продуцируемых амплификатами локусов HV2 и референсного В2М.

Относительную копийность локуса HV2 вычисляется следующим образом:

- рассчитывали медиану C_t по трем повторам для целевого локуса HV2 и референсного В2М,

- далее рассчитывали величину ΔC_t=C_t(HV2)-C_t(В2М)

- копийность генетического локуса относительно референсного гена (rC) рассчитывали по формуле 2^-ΔCt.

Далее сравнивают полученные значения rC с интервалом прогностического коэффициента копийности, и при значениях rC_HV2<800 прогнозируют отсутствие метастазов, а при значениях rC_HV2>1000 прогнозируют развитие метастазов, при значениях rC_HV2 между указанными интервалами считают полученный результат неопределенным.

Для доказательства прогностической ценности предлагаемой тест-системы приводится 2 выписки из историй болезни.

1) Больная Д., 1942 г.р., госпитализирована в отделении абдоминальной онкологии №1 РНИОИ 19.11.2014 г. с верифицированным диагнозом рак желудка, ФГС 09.10.2014 Cancer субкардиального отдела желудка. Атрофический анацидный (РН-5,0) Нр-не ассоциированный гастрит. Дуоденит.

При СРКТ органов грудной клетки, брюшной полости и малого таза 02.10.2014 г. перигастральных, периинтестинальных образований не выявлено. Легочная ткань - с обеих сторон в легких диффузный пневмосклероз, что позволило предположить до операции стадию II, T3NxM0. 19.11.2014 г. Лапаротомия, гастрэктомия с расширенной лимфаденкэктомией. При макроскопическом исследовании в удаленном желудке обнаружена опухоль до 6 см в диаметре по малой кривизне, инфильтративно язвенного типа, увеличенные лимфоузлы вдоль левых желудочных сосудов (до 10).

Результаты оценки копийности в биоптате у данной пациентки: rC_HV2=1021,2 (находится в границах прогностического интервала развития метастазов rC_{HV2(прогност)}>1000).

По данным патоморфологического исследования после операции: G2 аденокарцинома с изъязвлением инвазией всей толщи стенки желудка и подлежащей жировой ткани; в 1 из 10 лимфоузлов-метастаз аденокарциномы. Таким образом, степень распространения процесса, согласно классификации TNM соответствовала T3N1M0.

2) Больная Ш., 1940 г.р., госпитализирована в отделении абдоминальной онкологии №1 РНИОИ 30.06.2015 г. с верифицированным диагнозом рак желудка. ФГДС 17.06.2015 рак антрального отдела желудка, гистологическое исследование - малодифференцированная аденокарцинома.

КТ брюшной полости и забрюшинного пространства 23.06.2015 КТ-признаки диффузных изменений паренхимы печени по типу стеатоза, хронического холецистита, густой желчи в полости желчного пузыря, хронического панкреатита, признаков метастатического поражения не выявлено, что позволило предположить до операции стадию II, T3NxM0.

02.07.2015 была выполнена операция: дистальная субтотальная резекция желудка по Бильрот 2 с расширенной лимфаденэктомией.

При макроскопическом исследовании в удаленной части желудка обнаружена опухоль в выходном отделе до 6 см в диаметре, инфильтративно-язвенного типа, на разрезе - белесоватого цвета, в большом и малом сальнике увеличенных лимфоузлов не выявлено.

Результаты оценки копийности в биоптате у данной пациентки: rC_HV2=481,9 (находится в границах прогностического интервала отсутствия метастазов rC_{HV2(прогност)}<800).

По данным патоморфологического исследования после операции - G2-3 аденокарцинома с инвазией в клетчатку. Метастазов опухоли в лимфоузлах нет. Таким образом, степень распространения процесса, согласно классификации TNM соответствовала T4aN0M0.

Предлагаемым способом было осуществлено прогнозирование вероятности развития метастазов у 30 пациентов с диагностированным раком желудка.

Тест-система для прогнозирования развития метастазов у больных раком желудка на основании определения числа копий HV2 мтДНК позволяет с высокой точностью прогнозировать развитие такого заболевания как рак желудка, а именно развитие метастазов в лимфатические узлы.

Заявляемая тест-система, включает разработанные нами праймеры и является экономически оправданной для уточнения особенностей течения заболевания и дает возможность скорректировать тактику лечения, осуществляется в условиях стандартной лаборатории молекулярной биологии (ПЦР), без использования специального дорогостоящего оборудования; обладает высокой чувствительностью и специфичностью, осуществление анализа возможно с операционными биоптатами и парафиновыми блоками (FFPE-блоки), занимает не более 8 часов (с учетом подготовительных этапов), и не более 3 часов (при непосредственном использовании тест-системы).