СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ РОЖИ

Изобретение относится к области медицины, а именно инфекционным болезням, терапии, медицинской генетике и может быть использовано для прогнозирования вероятности развития рожи.

Известно, что в структуре первичных форм стрептококкозов рожа занимает одно из доминирующих положений (4 место в структуре инфекционной патологии). Заболеваемость в России колеблется от 100 до 250 на 100 тыс.населения в год [3]. Эта нозология характеризуется стабильно высокой заболеваемостью, выраженной склонностью к рецидивированию (от 35 до 50%), частым нарушением лимфообращения, увеличением доли тяжелых геморрагических форм с замедленной репарацией в очаге воспаления, появлением трофических, долго незаживающих язв, развитием гнойно-воспалительных осложнений, слоновости, некрозов, абсцессов и др. [8, 14].

Таким образом, прогнозирование возможного развития данного заболевания является важным аспектом современной медицины [2].

Известен способ прогнозирования деструктивных форм рожи, в соответствии с которым проводят бактериоскопическое и цитоскопическое исследование экссудата пораженных мягких тканей, подсчитывают количество лейкоцитов и стрептококков в поле зрения, затем определяют соотношение их количества (коэффициент). При значении коэффициента<1 прогнозируют развитие флегмонозной формы рожи, при значении коэффициента>3 - некротическую форму заболевания [4].

Недостаток способа заключается в том, что его использование позволяет прогнозировать деструктивные формы рожи на фоне уже имеющегося заболевания.

Известен способ прогнозирования развития буллезной или геморрагической форм рожи, согласно которому у пациентов в начальном периоде заболевания определяют ряд показателей оксидантно-антиоксидантной системы крови: гидроперекиси липидов (ГПЛ) плазмы, малоновой диальдегид (МДА) сыворотки, общую пероксидазную активность сыворотки (ОПАС), сывороточную каталазу (К) и плазменную супероксидисмутазу (СОД) с последующим расчетом величины оксидантно-антиоксидантного коэффициента (OAK) по формуле:

где ГПЛ_Б, МДА_Б, ОПА_Б, СОД_Б, К_Б - значения исследованных биохимических показателей у больных рожей; ГПЛ_ЗД, МДА_ЗД, ОПА_ЗД, СОД_ЗД, К_ЗД - значения тех же показателей у здоровых людей.

При величине OAK более 2,0 у.е. прогнозируют развитие в ближайшие сутки буллезной или геморрагической рожи [6].

Способ позволяет прогнозировать только буллезную или геморрагическую формы рожи в момент состоявшегося заболевания и не может быть использован для больных с другими формами заболевания. Кроме этого, способ трудоемок и технически сложно выполним, так как связан с рядом сложных биохимических методик, увеличивающих себестоимость метода.

Известен способ прогнозирования течения рожи путем определения в сыворотке крови пациентов содержание фактора некроза опухолей альфа в разгар болезни и на фоне клинического выздоровления. При снижении уровня TNFα в сравнении с исходным в 4-5 раз прогнозируют стойкую ремиссию, а при его сохранении или повышении - рецидив заболевания и/или формирование хронического лимфостаза [5].

Способ в большей степени дает оценку характера течения уже возникшего процесса и не позволяет оценить вероятность развития заболевания до проявления клинических синдромов.

Известен способ прогнозирования риска развития инфекционного эндокардита, взятый в качестве прототипа. Для прогнозирования проводят генотипирование по полиморфному локусу I462V гена CYP1A1 и по полиморфному локусу I105V гена глутатион-S-трансферазы Пи1 GSTP1, и при выявлении носительства сочетания генотипов CYP1A1 I462I и GSTP1 I105V у их носителей прогнозируют риск развития инфекционного эндокардита [7].

Способ позволяет прогнозировать риск развития воспалительного процесса стрептококковой этиологии на основании комбинаций полиморфных вариантов генов. Ограничение использования способа-прототипа состоит в том, что он не может быть применим для прогнозирования риска развития рожи, т.к. разработан для прогноза воспалительных осложнений сердечно-сосудистой системы.

Для расширения диапазона прогнозирования инфекционных заболеваний определяют полиморфизм генов - IL-1β (G1473C), CD 14 (С159Т), TLR4 (Asp299Gly), и при наличии одной из комбинаций генотипов: -1473GC IL-1β / -159ТТ CD14 / -299AspAsp TLR4; -1473GC IL-1β / -159СС CD14 / -299AspAsp TLR4; -1473GC IL-1β / -159CC CD14 / -299AspGly TLR4; -1473CC IL-1β / -159TT CD14 / -299AspAsp TLR4; -1473CC IL-1β / -159CT CD14 / -299AspAsp TLR4; -1473GG IL-1β / -159TT CD14 / -299AspAsp TLR4; -1473GG IL-1β / -159CT CD14 / -299AspAsp TLR4; -1473GG IL-1β / -159CT CD 14 / -299AspGly TLR4 - прогнозируют риск развития рожи.

Способ осуществляют следующим образом:

Осуществляют выделение ДНК из образцов биологического материала (венозная кровь, буккальный эпителий) относительно здорового человека термокоагуляционным методом с использованием коммерческого набора реагентов «ДНК-Экспресс» (Литех, Россия) согласно инструкции производителя. Полученный супернатант используют в качестве исследуемого образца ДНК. Для исследования выбирают точковую мутацию IL-1β в позиции 1473 (G>C), мутацию CD 14 в позиции 159 (С>Т) и мутацию TLR4 в позиции 299 (Asp>Gly). Амплификацию фрагмента исследуемых генов проводят в термоциклере (модель «Бис»-М111, ООО «Бис-Н», Новосибирск) с использованием наборов реагентов SNP-экспресс (Литех, Россия) согласно инструкции производителя. Детекцию продуктов амплификации аллельных вариантов проводят методом горизонтального электрофореза в 3% агарозном геле с добавлением бромистого этидия в проходящем в ультрафиолетовом свете.

Выявление ассоциации сочетания генетических вариантов, связанных с развитием рожи, проводят методом MDR (Multifactor Dimensionality Reduction или многофакторное уменьшение размерности). Моделирование генетических взаимодействий высокого порядка позволяет оценить вклад каждого из исследуемых генотипов, учитывая как снижающие, так и усиливающие влияния отдельных маркеров на возникновение заболевания. Вклад каждого гена и/или их взаимодействия оценивается величиной энтропии Н (величиной информации, снятой неопределенности в терминах теории информации), выраженной в %, где 100% - генотип однозначно определяет, к какому классу (больных или здоровых) относится индивид, соответственно 0% - генотип не играет никакой роли в предрасположенности к заболеванию. Путем многократного перекрестного пересчета вводимых первичных данных в MDR выбирают оптимальную модель ген-генного взаимодействия, позволяющую с высокой точностью предсказать человеку наличие или отсутствие предрасположенности к определенному заболеванию. Для каждой из этих моделей определяют сбалансированную точность (Balanced Accuracy, Bal. Асе), исходя из специфичности (Specificity, Sp) и чувствительности (Sensitivity, Se), отражающую не только возможность предсказания того или иного события (в частности, наличия или отсутствия заболевания), но и вероятность (точность) развития данного события [14]. Для оценки вероятности развития события рассчитывают показатель отношения шансов (odds ratio - OR) с расчетом для него 95% доверительного интервала (CI). Статистически значимыми считают различия при р<0,05.

В анализе ассоциаций выявляют лучшие модели комбинаций генотипов для изучаемых SNP со значимыми показателями отношения шансов по критерию χ² при тестировании (р<0,05). Модель с максимальной сбалансированной точностью (Bal.Асс.=89%), чувствительностью (Se=84%), специфичностью (Sp=93%), воспроизводимостью результата 10/10 - комбинация полиморфных вариантов генов IL-1β (G1473C), CD 14 (С159Т), TLR4 (Asp299Gly) (χ²=12,11, р=0,0005, OR=38,7), увеличивающая риск развития рожи, в среднем, в 38,7 раза (таблица 1).

Результат моделирования взаимодействий исследуемых генов представлен в таблице 2. Выявленные комбинации генотипов отражают степень риска развития заболевания.

С риском развития рожи ассоциированы следующие сочетания полиморфных вариантов:

Аллельные варианты генов IL-1β (G1473C), CD14 (С159Т), TLR4 (Asp299Gly) были отобраны с учетом их патогенетического вклада в развитие инфекционных процессов бактериальной этиологии [11].

Известно, что для рожи характерен высокий уровень провоспалительного цитокина IL-1β, что, по-видимому, носит благоприятный характер, поскольку способствует развитию адаптивного клеточно-опосредованного иммунного ответа, в котором клеткам Лангерганса принадлежит ведущее значение [3]. Интерлейкин 1 продуцируется макрофагами в ответ на стимуляцию антигенами β-гемолитического стрептококка группы А. Он усиливает миграцию нейтрофилов в очаг воспаления, отвечающих за реализацию местной защитной реакции силами факторов врожденного иммунитета - фагоцитоза, высвобождения дефенсинов и др. В ответ на стимуляцию интерлейкина 1 макрофаги выделяют гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, который амплифицирует нейтрофильный ответ [8]. Молекулярный эффект клеток на действие IL-1β обуславливает разнообразие патогенетических механизмов, направленных на ограничение патологического очага и санацию [10]. Можно предположить, что качественное изменение структуры молекулы IL-1β приводит к снижению концентрации, что в свою очередь приводит к ослаблению местных клеточных и гуморальных механизмов защиты. Низкие значения концентрации интерлейкина 1 могут не обеспечивать достаточную реализацию саногенных механизмов [8]. Известно, что трансмембранные Toll-подобные рецепторы являются ключевыми сенсорами РАМР инфекционных агентов и DAMP макроорганизма, функционирование которых предопределяет развитие процесса воспаления и иммунного ответа. Бактериальный липополисахарид, реагируя с CD 14 и TLR4, индуцирует сигнальный путь активации, связанный с появлением фактора NF-κВ и митоген-активируемой протеинкиназы. Дендритные клетки продуцируют провоспалительные цитокины, в том числе IL-12, IL-6 и TNFα, а также экспрессируют поверхностные маркеры CD80/86, CD40 и молекулы МНС II [13]. Полиморфные варианты молекул TLR4 и связанные с ним молекулы CD 14 определяют разное сродство с антигеном ЛПС, что сказывается на результатах активации клеток [1]. Точечный полиморфизм Toll-подобного рецептора-4 также связан с восприимчивостью к инфекционному агенту и риском развития воспалительных процессов [2].

Прогностическая значимость исследования повышается при включении аллельных вариантов нескольких функциональных групп генов первичного звена иммунопатогенеза. Полиморфизмы таких генов образуют различные комбинации, усиливающие/ослабляющие эффект какого-либо отдельного генетического полиморфизма [9].

Способ прогнозирования развития рожи иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Донор К., русский, 52 года.

Для проведения анализа у относительно здорового донора была взята венозная кровь, выполнено генотипирование ДНК-маркеров по полиморфным локусам -1473GC гена IL-1β, -159СТ гена CD14, -299AspGly гена TLR4. В результате выявлено следующее сочетание исследуемых полиморфизмов генов: -1473GC IL-1β / -159ТТ CD14 / -299AspAsp TLR4. Наличие этой комбинации генотипов позволяет прогнозировать высокий риск развития рожи.

Данный мужчина включен в группу риска развития рожи, и ему назначен комплекс профилактических мероприятий (иммунокоррегирующая терапия, сезонная антибиотикопрофилактика). Катамнез прослежен в течение 3 лет, в период которого зарегистрирован случай рожи (первичная рожа левого колена и бедра, эритематозной формы, средней степени тяжести) в результате не соблюдения профилактических рекомендаций.

Пример 2.

Донор В., русская, 50 лет.

Для проведения анализа у донора был взят буккальный соскоб, выполнено генотипирование ДНК-маркеров по полиморфным локусам -1473GC гена IL-1β, -159СТ гена CD14, -299AspGly гена TLR4. В результате выявлено сочетание исследуемых полиморфизмов генов: -1473GC IL-1β / -159ТТ CD14 / -299AspGly TLR4. Наличие этой комбинации генотипов позволяет предполагать низкий риск развития рожи. Катамнез прослежен в течение 3 лет - эпизодов рожи не отмечалось.

Пример 3.

Пациентка Н., русская, 48 лет.

Для проведения анализа у пациентки была взята венозная кровь, выполнено генотипирование ДНК-маркеров по полиморфным локусам -1473G/C гена IL-1β, -159С/Т гена CD14, -299Asp/Gly гена TLR4. В результате выявлено следующее сочетание исследуемых полиморфизмов генов: -1473GC IL-1β / -159СС CD14 / -299AspAsp TLR4. Наличие этой комбинации генотипов позволяет прогнозировать высокий риск развития рожи. В дальнейшем на основании клинико-анамнестических данных согласно верификации В.Л. Черкасова установлен клинический диагноз: первичная рожа правой голени, эритематозно-буллезная форма, средней степени тяжести.

Использование данного способа для выявления сочетаний генотипов риска развития рожи на доклинической стадии заболевания повысит достоверность прогнозирования развития рожи, что положительно скажется на лечебно-профилактических и диагностических мероприятиях данного инфекционного процесса.

Источники информации

1. Генетический полиморфизм CD 14, TNFα и FCGR2A у больных гриппом A H1N1 в Забайкальском крае / А.А. Петров [и др.] // Медицинская иммунология. - 2011. - №1. - С. 83-86.

2. Генетический полиморфизм Toll-подобного рецептора-4 у больных рожей / А.С. Емельянов [и др.] // Молекулярная медицина. - 2017. - Т. 15. - №5. - С. 54-57.

3. Емельянова, А.Н. Рожа (патогенез, особенности течения) / А.Н. Емельянова, Ю.А. Витковский // Томск: Иван Федоров. - 2014. - 132 с.

4. Патент RU 2000113591, МПК G01N 33/48. Способ прогнозирования развития деструктивных форм рожи / А.П. Фролов, Л.Н. Воробьева; ФГБОУ ВО "Иркутский государственный медицинский университет" Минздрава РФ; Заявлено 26.05.2000; Опубликовано 20.05.2002.

5. Патент RU 2027189, МПК G01N 33/52. Способ прогнозирования течения рожи / А.В. Панютич, Е.А. Панютич, В.А. Крапивин, П.К. Зубрицкий, P.P. Давыдов, Р.Х. Чилингиров. Заявлено 28.11.1991. Опубликовано 20.01.1995.

6. Патент RU 2148258, МПК G01N 33/52. Способ прогноза развития буллезной и геморрагической форм рожи / Ю.М. Амбалов, В.П. Кузнецов. Заявлено 19.01.1999; Опубликовано 27.04.2000.

7. Патент RU 2617060, МПК G01N 33/53. Способ прогнозирования риска развития инфекционного эндокардита / Н.В. Мальцева, Т.А. Лапутенко, Я.А. Горбатовский, О.Ф. Лыкова, В.А. Панченко, М.Е. Батаева; ФГБОУ ДПО РМАНПО Минздрава России. Заявлено 03.12.2015; Опубликовано 19.04.2017.

8. Полиморфизм промотора гена IL1B (G1473C) и его влияние на содержание интерлейкина 1 в крови больных рожей / А.С. Емельянов [и др.] // Медицинская генетика. - 2017. -№8. - С. 32-35.

9. Симбирцев, А.С. Функциональный полиморфизм генов регуляторных молекул воспаления / А.С. Симбирцев, Ф.Ю. Громова // Цитокины и воспаление.-2005.-№1. - С. 3-10.

10. Bardoel, B.W. Molecular battle between host and bacterium: recognition in innate immunity / B.W. Bardoel, J.A. Strijp // J. Mol. Recognit. - 2011. - №6. - C. 1077-1086.

11. Differences in Toll-like receptor expression and cytokine production after stimulation with heat-killed Gram-positive and Gram-negative bacteria / O. Beran [et al.] // Folia Microbiologica. - 2011. - №3. - P. 283-287.

12. Hahn L.W., Ritchie M.D., Moore J.H. Multifactor dimensionality reduction software for detecting gene-gene and gene-environment interactions // Bioinformatics. - 2003. - Vol.19, №3. - P. 376-382.

13. Li, H. Streptococcus mutans wall-associated protein A promotes TLR4-induced dendritic cell maturation / H. Li, D. Wang // Scandinavian Journal Of Immunology. - 2014. - №2. - P. 121-126.

14. Recurrent erysipelas - risk factors and clinical presentation / M. Inghammar [et al.] // BMC Infectious Diseases. - 2014. -№14. - P. 1-6.