СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИМЕРНЫХ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ЧАСТИЦ В ПРОТОЧНОМ МИКРОРЕАКТОРЕ И ЛИОФИЛИЗАТА НА ИХ ОСНОВЕ

Область техники

Изобретение относится к области фармацевтической технологии и медицине, а именно способу получения в проточном микрореакторе полимерных частиц на основе трудно растворимого лекарственного вещества доцетаксела и сополимера молочной и гликолевой кислот, которые могут быть использованы в виде лиофилизата как лекарственной формы для инъекционного введения, предназначенного для лечения онкологических заболеваний.

Уровень техники

В настоящее время около 40% одобренных - к применению лекарственных веществ характеризуются низкой растворимостью в воде и плохой биодоступностью. [1]. Кроме того, около 90% молекул, перспективных с точки зрения лекарств, имеют неоптимальные физико-химические характеристики, такие как значительную молекулярную массу, высокие липофильные свойства и низкую растворимость в воде [2]. В связи с этим разработка новых способов доставки и создание более эффективных лекарственных форм уже применявшихся ранее лекарственных веществ имеет не меньшее значение, чем открытие новых молекул.

Получение полимерных субмикронных и наночастиц является перспективным способом создания новых форм труднорастворимых лекарственных веществ. Использование полимерных частиц позволяет улучшить ряд биофармацевтических характеристик лекарственных веществ: повышение растворимости и биодоступности лекарственных веществ, защита биологически активного вещества от быстрой деградации, повышение стабильности, оптимизация характеристик высвобождения лекарственного вещества (создание пролонгированных форм или лекарственных форм с контролируемым высвобождением), снижение токсического воздействия на организм [3].

Применение таргетных полимерных частиц, поверхность которых функционализирована векторной молекулой, повышает избирательность доставки лекарственного вещества, что позволяет снизить эффективную дозу и уменьшить общую токсичность для организма. Ряд низкомолекулярных соединении, таких как витамины, некоторые углеводы и стероидные гормоны являются перспективными кандидатами на роль векторных молекул при разработке таргетных частиц. Эти соединения являются естественными участниками метаболизма, физиологичны и хорошо изучены. Кроме того, быстро пролиферирующие клетки имеют в них повышенную потребность и интернализуют эти молекулы более эффективно, чем клетки здоровых тканей, что позволяет достигнуть избирательности действия [4]. Фолиевая кислота (ФК) стала одним из первых низкомолекулярных соединений, рассматриваемых в качестве потенциальных векторов в, таргетной терапии опухолевых заболеваний. Раковые и эмбриональные клетки захватывают фолиевую кислоту путем рецептор-опосредованного эндоцитоза, при котором также интернализуются, как конъюгаты фолиевой кислоты с различными молекулами, так и более крупные комплексы [5]. Показано, что экспрессия рецепторов к фолиевой кислоте типа а (ФКР-α) существенно увеличена в клетках ряда опухолей: аденокарцинома яичника, молочной железы, кишечника, а также в некоторых глиобластомах и при раке легкого [6]. В то время, как уровень ФКР в нормальных тканях низок < 2,4 пмол/мг белка), его экспрессия в ткани опухолей превышает > 6-4 пмол/мг белка, что создает предпосылки для использования ФКР в качестве мишени при разработке таргетной терапии.

Наиболее широко применяемыми на практике биополимерами для получения полимерных частиц являются сополимеры молочной и гликолевой кислот (ПЛГА, PLGA). Данные полимеры одобрены для применения в составе лекарственных средств Food and Drug Administration (FDA), European Medicines Agency (EMA). Сополимеры молочной и гликолевой кислоты представляют собой сополимеры рацемической (D, L) молочной и гликолевой кислот с молярными отношениями соответствующих кислотных остатков от 15/85 до 85/15. При получении суспензий для парентерального применения одними из наиболее подходящих оказались сополимеры с молярным соотношением кислотных остатков 50/50. Основными способами получения полимерных частиц являются методы эмульгирования и нанопреципитации (осаждения) [7]. Применение этих способов получения подразумевает использование водных растворов неионогенных поверхностно-активных веществ (ПАВ) для стабилизации получаемых дисперсных систем (эмульсий или суспензий). В подавляющем большинстве случаев в качестве такого ПАВ применяются водные растворы поливинилового спирта (ПВС).

При получении полимерных частиц методом простых эмульсий сначала получают раствор полимера и активного ингредиента в несмешивающемся с водой легколетучем органическом растворителе, а затем полученный раствор вводят в водную фазу - раствор ПАВ. Полученную смесь гомогенизируют и получают эмульсию типа «масло в воде». При удалении органического растворителя формируется суспензия, содержащая субмикронные частицы. В отличие от эмульсионного метода, метод нанопреципитации или замены растворителя подразумевает практически мгновенное формирование частиц за счет того, что используется система растворителей, неограниченно смешивающихся между собой. В общем случае получения наночастиц на основе ПЛГА полимер и активный ингредиент растворяют в подходящем растворителе - обычно ацетоне или ацетонитриле, а затем вносят через капилляр в водный раствор ПАВ при постоянном перемешивании.

Перспективным подходом при получении полимерных частиц является использование микрофлюидных технологий. В данном случае нанопреципитация происходит в токе жидкости внутри капиллярного микрореактора (чипа); при этом достигается высокая однородность характеристик получаемых частиц по размеру и степени включения активного вещества в частицы [8]. Упрощение технологического процесса достигается путем одностадийного получения частиц в микрофлюидном чипе, что отличает данную технологию от метода прямых эмульсий, где формирование частиц идет в два этапа: получение эмульсии и формирование частиц в процессе удаления из эмульсии летучего растворителя. Преимущество микрофлюидной технологии заключается в управляемости технологического процесса при получении частиц, приводящей к высокой воспроизводимости результатов.

Получаемые описанными методами полимерные частицы после удаления растворителя можно лиофилизовать с образованием продукта в виде легко ресуспендируемой массы. Лиофилизат можно, использовать для создания лекарственных форм, предназначенных для различных способов введения, в том числе инъекционных. Для лиофилизатов, которые восстанавливаются в суспензию непосредственно перед введением, можно достичь приемлемого срока хранения, что немаловажно с практической точки зрения. При получении препаратов в виде лиофилизатов, которые восстанавливаются в суспензию, используются криопротекторы [9]. Применяют в основном сахара, например, маннитол.

При использовании полимерных частиц для создания, инъекционных лекарственных форм, с практической точки зрения оптимальным диапазоном размеров частиц является субмикронный диапазон 50-400 нм, при этом, наибольшая эффективность при обеспечении высоких значений соотношения «эффективность/безопасность» достигается для частиц, средний размер которых находится около 250 нм [10]. Для частиц с указанным размером достижимо включение достаточного количества активного ингредиента в полимерную матрицу. Важным требованием к образцам частиц, предназначенным для инъекционного введения,, является их монодисперстность. Для описания этого показателя обычно пользуются значением индекса полидисперсности (polydispersity index, PDI). В случае использования микрофлюидной технологии, диапазон значений PDI лежит в пределах 0,05-0,10. Образец можно считать монодисперсным при значении PDI не превышающем 0,15.

Активные ингредиенты, которые вводятся в состав полимерных частиц, в большинстве случаев представляют собой гидрофобные вещества природного или полусинтетического происхождения. Одними из наиболее часто вводимых в состав полимерных форм противоопухолевых препаратов являются доксорубицин, этопозид, таксаны [11].

Таксаны - группа лекарственных противоопухолевых препаратов, характеризующихся крайне низкой растворимостью, одним из представителей которой является доцетаксел. Механизм действия доцетаксела состоит в нарушении процесса деления клеток путем стабилизации микротрубочек. Данный препарат является одним из наиболее эффективных противоопухолевых препаратов, однако при этом имеет множество серьезных побочных эффектов, в связи, с чем наиболее актуальной задачей представляется разработка новых более безопасных лекарственных форм доцетаксела. Включение доцетаксела в полимерные частицы, позволяет не только решить проблему его плохой растворимости в воде и низкой биодоступности, но также снизить вводимую дозу и уменьшить побочные эффекты; следующим шагом повышения эффективности является создание систем адресной доставки и пролонгированного высвобождения. При разработке инъекционных полимерных форм доцетаксела первостепенное значение имеет достижение оптимальных значений основных характеристик полимерных частиц: размера, индекса полидисперстности и содержания доцетаксела. Оптимальное значение среднего размера частиц лежит в диапазоне 200-250 нм с предпочтительным значением индекса полидисперстности 0,05-0,10. При этом должно обеспечиваться высокое содержание доцетаксела в частицах, не менее 3-5%, что удовлетворяет условиям, практического применения инъекционных полимерных форм доцетаксела.

В заявке США № US 20060188566 A1 [12] описана композиция, содержащая частицы доцетаксела или его аналога, характеризующиеся средним гидродинамическим диаметром от 50 до 2000 нм, и по меньшей мере один стабилизатор поверхности частиц. Допустимыми способами введения композиции являются оральный, ректальный, парентеральный, внутрисуставной и другие. Массовая доля поверхностного стабилизатора в композиции может составлять от 0,5% до примерно 99,99%, по отношению к общей сухой массе доцетаксела или его аналога. В качестве поверхностного стабилизатора могут использоваться анионные, катионные, цвиттерионные или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как альбумин, декстран, глицерин, полиэтиленгликоль, додецилсульфат натрия, поливиниловый спирт, полоксамеры, лаурилсульфат натрия и другие. В данной заявке получаемые частицы состоят из действующего вещества доцетаксела и стабилизатора поверхности, однако не имеют в своем составе полимера-носителя и представляют собой мицеллы, поэтому описанная композиция не может быть использована в качестве системы доставки или системы пролонгированного действия, что ограничивает;, в£змржнс;сти их применения.

В заявке США № US 2010216804 [13] описывается биосовместимая композиция наночастиц, содержащих терапевтический агент. В качестве биосовместимого полимера для формирования может применяться производное PLA-PEG. Терапевтический агент, включенный в состав биосовместимых наночастиц, может представлять собой противоопухолевый препарат: доцетаксел, винкристин, метотрексат, паклитаксел или сиролимус. Описанные биосовместимые композиции наночастиц пригодны для лечения солидных опухолей. Описанная заявка не содержит данных о размере частиц, степени их полидисперстности и содержания в них терапевтического агента.

В заявке США № US 2002041898 [14] описана фармацевтическая композиция, состоящая из частиц полимерной матрицы и биологически активного агента (в том числе плохо или ограниченно растворимого в воде), гомогенно распределенного в объеме матрицы. В качестве материала полимерной матрицы может использоваться, в частности, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, поливинилпирролидон, полилактид, поли (лактид-гликолид), поливиниловый спирт, их производные, смеси и сополимеры. В качестве биологически активного агента могут использоваться противоопухолевые препараты паклитаксел, доцетаксел, камптотецин, их производные и аналоги. Размер частиц полимерной матрицы описанной композиции составляет от 1 до 1000 нм. В данной заявке не представлено сведений о количественном содержании терапевтического агента в частицах. Кроме того, указан широкий диапазон размеров частиц, без указания степени их полидисперсности.

Таким образом, в изобретениях, описанных выше, представлены частицы, содержащие в том числе, доцетаксел, но имеющие широкий диапазон значений размеров (от нанометрового до микронного) и поэтому демонстрирующие принципиально разные профили биораспределения, что ограничивает возможность применения таких частиц в медицине.

Для получения терапевтических полимерных частиц с оптимальными размерами и индексом полидисперсности могут быть применены микрофлюидные технологии. Система микрофлюидного синтеза представляет собой компактное устройство, оперирующее объемами жидкости порядка нано- и микролитров, подавая ее в канал с ₍сечением от десятков до нескольких сотен микрон. Принципиальным отличием микроструктурированных реакторов от традиционных объемных является ламинарность движения потоков, что почти полностью исключает образование градиентов концентраций и температуры в объеме и времени. Преимущества микрофлюидного метода обусловлены ламинарным течением потоков реагентов в микрореакторе и высокой скоростью диффузии, что обеспечивает стабильность условий протекания процессов и высокую воспроизводимость результатов [15]. За счет возможности управления процессом в микрореакторе удается добиваться мономодального узкого распределения частиц по размерам нужной фракции [16].

В патенте США № US 9381477 [17] описана микрофлюидная система для получения полимерных частиц методом замены растворителя, имеющая каналы круглого или эллиптического поперечного сечения; ширина и высота каждого канала составляют от 1 до 1000 мкм. Каналы микрофлюидной системы могут быть изготовлены из металла, полимера, фотоотверждаемой эпоксидной смолы, полидиметилсилоксана, стекла, кремния и их комбинаций. В качестве полимера для получения частиц могут использоваться полиэтиленгликоль, поли (лактид-гликолид), полигликолевая кислота, поли-D, L-молочная кислота, поли(капролактон), полиангидриды, поли (L-лактид-со-L-лизин), их аналоги, производные, комбинации и сополимеры. В качестве растворителя для полимера могут быть использованы тетрагидрофуран, ацетон, ацетонитрил, диметилсульфоксид, диметилформамид, кислоты и спирты. В качестве жидкости для осаждения полимера с образованием полимерных частиц может быть использована вода или водные растворы. Раствор полимера также содержит по крайней мере один терапевтический агент, инкапсулируемый в формируемую частицу. Получаемые частицы имеют диаметр менее 100 мкм, в большинстве случаев от 100 до 900 нм. Не более 25% частиц имеют диаметр, отличающийся от среднего менее чем на 150%. Описанная микрофлюидная система позволяет синтезировать частицы с требуемыми свойствами (состав, размер, поверхностный заряд) путем изменения скоростей потоков, концентрации растворов, температуры и времени реакции. В данной заявке не представлено сведений о количественном содержании терапевтического агента в частицах, получаемых с использованием микрофлюидной системы.

В патенте США № US 9592198 [18] описывается способ непрерывного поточного синтеза и активной загрузки липосом с применением микрофлюидного устройства, имеющего область формирования липосом, область создания трансмембранного ионного градиента и область загрузки действующего вещества. В качестве основного действующего вещества может применяться антрациклин, амфотерицин, цитарабин, хлорпромазин, а также амфифильные пептиды или белки. Полученные таким способом липосомы имеют приблизительный средний диаметр от 20 до 500 нм и процент полидисперсности не более 10%.

В патенте РФ №2637653 [19] описан способ получения фармацевтических композиций на основе полимерных наночастиц методом микрофлюидной технологии, заключающийся в. протыкании, через проточный микрореактор выполненный из боросиликатного; стекла водной фазы - водного раствора, содержащего поливиниловый спирт и органической (неводной) - раствора в ацетоне или ацетонитриле противоопухолевых агентов (этопозида или никлозамида) и сополимера молочной и гликолевой кислот с молярным соотношением мономерных звеньев от 25 и 75 до 75 и 25% или его смесь с полиметилметакрилатом для медицинского применения Eudragit. При этом предварительно стенки проточного микрореактора обрабатывают водным раствором поливинилового спирта с концентрацией от 0,5 до 1%. Авторы изобретения показали, что полученные частицы демонстрируют стабильность распределения размеров частиц относительно среднего значения и исключение возможности агрегации частиц в процессе их образования. Полученные в соответствии с описанной в данном патенте технологией частицы имели средний диаметр от 200 до 400 нм и индекс полидисперсности от 0,04 до 0,18. Также данный патент не имеет информации о содержании противоопухолевых агентов (этопозида или никлозамида) в полученных частицах, что является важным параметром с точки зрения их практического использования.

Таким образом, применение микрофлюидной технологи позволяет получать частицы с оптимизированными характеристиками по показателям среднего размера и полидисперсности. Для описанный, '-выше частиц характерен диапазон значений размера частиц в субмикронном интервале и мономодальное распределение частиц по размеру. Однако в представленных изобретениях, касающихся получения частиц с использованием микрофлюидных систем, не описано способа получения частиц с включением доцетаксела и подходов к увеличению его содержания.

Следовательно, существует необходимость в разработке способа получения в микрофлюидном реакторе полимерных частиц с высоким (по сравнению с известными композициями) содержанием доцетаксела, и обладающих оптимальными значениями среднего размера частиц и индексом полидисперсности, которые могут быть использованы для создания эффективных лекарственных форм для инъекционного введения, предназначенных для лечения онкологических заболеваний.

Раскрытие изобретения

Технической проблемой, решаемой изобретением является получение полимерных частиц с повышенным содержанием труднорастворимого противоопухолевого лекарственного препарата доцетаксел, характеризующихся средним размером от 200 до 250 нм, при минимально возможном значении индекса полидисперсности, и создание, на основе полученных частиц лиофилизата, предназначенного для приготовления эффективной лекарственной формы для парентерального введения.

Техническим результатом заявленного изобретения является повышение содержания в полимерных частицах гидрофобного лекарственного вещества доцетаксел при достижении оптимальных физикохимических характеристик частиц, что позволяет создавать эффективные лекарства для терапии онкологических заболеваний.

Для достижения технического результата предложен способ получения полимерных противоопухолевых частиц в проточном микрореакторе и лиофилизата на их основе, заключающийся в пропускании через проточный микрореактор водной фазы, состоящей из поливинилового спирта с объемным соотношением 0,5% водного раствора поливинилового спирта и этанола равным 1:3, и неводной фазы, состоящей из раствора доцетаксела с концентрацией 0,75 мг/мл и сополимера молочной и гликолевой кислот PLGA 50/50 с концентрацией 5 мг/мл в ацетоне, при этом соотношение доцетаксела и сополимера молочной и гликолевой кислот к объему ацетона находится в интервале 1:150 - 1:200, с последующем смешением водной и неводной фаз с образованием суспензии полимерных частиц, удалением из суспензии этанола и ацетона упариванием их под вакуумом, удалением избыточного поливинилового спирта путем центрифугирования, смешиванием суспензии с водным раствором D-маннитола, замораживанием и последующей лиофилизацией в течение суток.

Кроме того, в неводную фазу вводят раствор производного фолиевой кислоты для придания полимерным противоопухолевым частицам адресных свойств.

Совокупность приведенных выше существенных, признаков приводит к тому, что:

- в качестве водной фазы выступает двухкомпонентная система, представленная водным раствором поливинилового спирта 0,5% мае, в состав которой введен этиловый спирт с объемным соотношением этанола и водного раствора ПВС 1:3. Использование такой сложной водной фазы препятствует диффузии доцетаксела из объема формируемой частицы и приводит к увеличению содержания доцетаксела;

- снижается пенообразование в водно-этанольных растворах ПВС, что в свою очередь уменьшает вероятность образования пузырьков в каналах проточного микрореактора, поддерживает ламинарность потоков реагентов и стабильность условий формирования частиц. Таким образом, достигается снижение среднего размера частиц и большая однородность по размерам (снижение индекса полидисперсности).

Для повышения избирательности (адресности) доставки в состав получаемых полимерных частиц возможно введение производной фолиевой кислоты в виде амида.

На основе полученных частиц был получен лиофилизат, предназначенный для приготовления суспензии для парентерального применения. Полученный лиофилизат содержит доцетаксел не менее 4% мас., а при добавлении к лиофилизату физиологического раствора образуется суспензия частиц со средним размером 220±30 нм и индексом полидисперсности не более 0,05.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлено распределение по размерам частиц образца суспензии. По оси абсцисс - диаметр частиц, нм; по оси ординат - относительные содержания фракций, %. ₍

На фиг. 2 представлена фотография частиц, полученная методом просвечивающей криоэлектронной микроскопии.

Осуществление и примеры реализации изобретения

Получение частиц осуществляется путем нанопреципитации в коммерчески доступном микрофлюидном реакторе из боросиликатного стекла, в который подаются водная фаза и органическая, фаза, в составе которой присутствует полимер и доцетаксел. На результат технологического процесса в микрореакторе влияют состав и соотношение водной и органической фаз, соотношения компонентов в реакционной смеси.

В ходе экспериментальных исследований был разработан способ получения полимерных частиц в микрореакторе с использованием в составе водной фазы двухкомпонентного стабилизатора суспензии частиц, содержащего водный раствор поливинилового спирта и этанол. Присутствие этанола повышает скорость образования полимерных частиц, что привело к увеличению содержания доцетаксела в частицах. Было установлено, что наибольшее содержание доцетаксела в частицах достигается при использовании водно-этанольного раствора поливинилового спирта с объемным соотношением 0,5% водного раствора поливинилового спирта и этанола равным 1:3.

В качестве органического растворителя использовался ацетон, являющийся полярным растворителем, в котором при комнатной температуре хорошо растворяются компоненты органической фазы, подаваемой в микрореактор - доцетаксел и полимер. Получаемые частицы не склонны к агрегации между собой, что может быть объяснено, сокращением срока формирования частиц при контакте водной фазы и раствора полимеров, так как ацетон в любых отношениях смешивается с водой и поэтому не имеет предельных значений растворимости в воде. Важным преимуществом использования ацетона в качестве органического растворителя является то, что он относится к растворителям 3 класса (растворители низкой токсичности), содержание которых до 0,5% не требует подтверждения (ГФ XIII ОФС.1.1.0008.15).

Для получения частиц использовали готовый сополимер молочной и гликолевой кислот с соотношением мономерных звеньев 50:50 (PLGA50/50). Массовая доля доцетаксела по отношению к полимеру в исходном растворе органической фазы варьировалась в диапазоне 5-15%. При массовой доле доцетаксела по отношению к полимеру, равной 15%, было достигнуто максимальное содержание доцетаксела в полученных частицах более 4%.

В случае полимерных частиц, функционализированных векторной молекулой, в органическую фазу также вносился раствор производного фолиевой кислоты (амид).

Соотношение скоростей потоков водной и органической фазы, подаваемых в проточный микрореактор 4-5: 1. Параметры потоков выбирались с учетом конкретной конструкции реактора и рассчитываются в каждом конкретном случае. Оптимальные скорости потоков водной и органической фазы, подаваемых в проточный микрореактор, составляли 1,3 и 0,3 мл/мин соответственно. Скорость потока органической фазы, равная 0,3 мл/мин, обеспечивает оптимальное соотношение производительности установки и стабильности характеристик получаемых частиц. Выбор скорости потока водной фазы, равный 1,3 мл/мин обусловлен тем, что скорость менее 1 мл/мин ограничивает производительность установки, а скорость свыше 1,5 мл/мин приводит к резкому повышению давления в системе.

Оптимальное рабочее давление в системе при данных скоростях потоков составляет 3,7-3,8 бар; температура 25°С.

Полученная суспензия частиц подвергалась упариванию под вакуумом на роторном испарителе для удаления остаточного растворителя, центрифугированию с последующим ресуспендированием осадка для удаления избыточного поливинилового спирта, а также замораживание в жидком азоте и лиофилизации. Полученный лиофилизат является водорастворимым и при добавлении к нему физиологического раствора (стерильный 0.9% раствор натрия хлорида для инъекций) и последующем встряхивании образует суспензию частиц. Подобранные условия технологического процесса в проточном микрореакторе, позволяют стабильно получать суспензию частиц, характеризующихся средним размером 220±30 нм, индексом полидисперсности не более 0,05 и содержанием доцетаксела не менее 4%мас.Указанные характеристики лиофилизата в виде приготовленной суспензии позволяют его использовать для инъекционного введения.

Для образцов полученных частиц оценивался размер, индекс полидисперсности, морфология поверхности и содержание доцетаксела.

Размер частиц и индекс полидисперсности определяли на оборудовании Zetasizer Nano ZS ZEN 3600 (Malvern, Великобритания) методом динамического светорассеяния, который широко применяется для определения размеров частиц в суспензиях. Для анализа готовили суспензию образца частиц 0.2 мг/мл и проводили измерения при 25°С троекратно для каждого образца.

Форма и морфология частиц определялись методом просвечивающей криоэлектронной микроскопии на оборудовании Titan Krios ТЕМ FEI (Thermo Fisher Scientific, США). Образцы частиц разводились в 1 мл воды, перемешивались в течение 1 минуты и помещались на специализированные поддерживающие сетки. После витрификации в жидком этане образцы переносились в жидком азоте в станцию для запрессовки, после чего помещались в кассету-держатель при криогенных условиях. Изображения были получены при увеличениях 5000Х -18000Х в режиме малой дозы с использованием детектора электронов Falcon П.

Содержание доцетаксела в частицах определяли с помощью метода ВЭЖХ с использованием системы Agilent Technologies 1200 series (Agilent, США) с УФ-детектором. Образцы частиц растворяли в ДМСО и анализировали в трех повторах. Хроматографическое разделение, приводили на колонке Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18, 250×4,6 мм, 5 мкм при термостатировании при 30°С. Скорость потока: 1,2 мл/мин. Хроматография проводилась в градиентных условиях: фаза А - вода, фаза В - ацетонитрил. Градиент: изократический 72% А, 28% В (0-9 мин), затем линейный (9-39 мин) от 72% А, 28% В до 28% А, 72% В, затем линейный назад до 72% А, 28% В (39-50 мин). Условия детектирования: длина волны 232±4 нм. Время удерживания пика доцетаксела в этих условиях около 27 минут.

В таблице 1 приведены данные размера частиц (средний гидродинамический диаметр, нм) по трем образцам частиц,, полученных описанным способом. Образцы MF-FD-1, MF-FD-1 и MF-ED- были получены в соответствии с методикой, описанной в Примере 1. При этом образцы MF-FD-1 и MF-FD-2 имеют в своем составе векторную молекулу (производное фолиевой кислоты), а образец MF-0D-1 не имеет. Средний диаметр частиц представленных образцов находился в диапазоне от 215 до 219 нм. Индекс полидисперсности принимал значения от 0,036 до 0,50.

Среднее содержание доцетаксела в образцах составило 4,41±0,22%мас.

На фиг. 1 приведены данные о распределении частиц по размеру (для образца MF-FD-1). В соответствии с данными присутствует узкий пик распределения частиц.

На фиг. 2 представлена фотография (ТЕМ), демонстрирующая сферическую форму и гладкую поверхность полученных частиц.

Полученные результаты показали высокую воспроизводимость распределения частиц по размерам в полученных образцах и узкое распределение частиц по размерам (однородность фракционного состава). Было установлено постоянство содержания доцетакеедд,, в. частицах. Использование микрофлюидной технологии при получении полимерных частиц позволило добиться указанных характеристик благодаря ламинарному течению потоков реагентов в микрореакторе, высокой скорости диффузии и контролю параметров реакции (скорость потоков, давление, температура), что обеспечило стабильность условий протекания процессов и высокую воспроизводимость результатов. Кроме того, данная технология обладает рядом преимуществ, к главным из которых относятся высокая управляемость процессом и возможность его масштабирован.

Исследования противоопухолевой цитотоксической активности образцов полимерных частиц проводилось in vitro на опухолевых клетках карциномы шейки матки линии HeLa, для которых было подтверждено наличие фолатных рецепторов с помощью проточной цитометрии с применением антител фолатному рецептору. Подробное описание эксперимента представлено в примере 2. В таблице 2 приведены результаты исследования цитотоксической активности образцов полимерных частиц. В качестве препарата сравнения использовали субстанцию доцетаксела и «пустые» частицы, не содержащие доцетаксел. Обнаружена высокая цитотоксическая противоопухолевая активность исследованных образцов полимерных частиц, содержащих доцетаксел, которая превышала активность субстанции доцетаксела. Полимерные частицы без доцетаксела, в используемом диапазоне концентраций, активностью не обладали.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1 - получение полимерных частиц, содержащих доцетаксел, с использованием микрофлюидной технологии на установке Qmix (Wingflow AG, Швейцария).

Для работы на микрофлюидной установке использовали предварительно отфильтрованные и дегазированные растворы. В один из каналов проточного микрореактора подавалась водная фаза со скоростью 1,3 мл/мин, представляющая собой водно-спиртовой раствор (с объемным соотношением 0,5% водного раствора поливинилового спирта и этанола равным 1:3) общим объемом 100 мл. После стабилизации давления в системе в другой канал микрореактора со скоростью 0,3 мл/мин подавалась органическая фаза, в которой в 20 мл ацетона содержится 15 мг доцетаксела (концентрация 0,75 мг/мл) и 100 мг полимера PLGA 50/50 (концентрация 5 мг/мл).

Сбор суспензии наночастиц начинали после выхода мертвого объема из системы и осуществляли до израсходования растворов. Затем под вакуумом на роторном испарителе из основной фракции удалялся остаточный органический растворитель. Излишки поливинилового спирта удалялись центрифугированием (20 мин, 30000g, 4°С) с последующим удалением надосадочной жидкости и ресуспендированием осадка путем механического перемешивания и/или обработки на ультразвуковой бане в течение 20 минут без нагревания. Затем в полученную суспензию добавлялось 20 мг криопротектора D-маннитола (10% водный раствор).

После этого суспензия замораживалась в жидком азоте и подвергалась лиофильной сушке. В случае получения частиц, содержащих векторный фрагмент в виде производного фолиевой кислоты, раствор органической фазы также содержал 40 мкл раствора производного фолиевой кислоты (0,1 мг/мл) в подходящем растворителе.

Пример 2 - определение цитотоксической активности образцов полимерсодержащих композиций доцетаксела в опытах in vitro.

Для изучения цитотоксической активности образцов полимерных частиц in vitro в качестве модельной клеточной тест-системы были использованы клетки карциномы шейки матки линии. HeLa_. Клетки культивировали в полной культуральной среде DMEМ, содержащей 10% сыворотки плодов крупного рогатого скота («HуСlоnе», США) и, 50 мкг/мл гентамицина («ICN», США), в пластиковых культуральных флаконах («Corning-Costar», США) в СO₂-инкубаторе при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СO₂. Выживаемость опухолевых клеток после действия полимерных частиц оценивали с помощью МТТ-теста. В качестве вещества сравнения использовали субстанцию доцетаксела. За сутки до добавления препаратов клетки высевали в 96-луночные планшеты («Corning-Costar», США) по 2-2,5 тысяч клеток на лунку в среде. DMEM, не содержащей фолиевую кислоту. Исследуемые полимерные частицы, содержащие доцетаксел, и субстанцию доцетаксела вносили к клеткам в среде DMEM, не содержащей фолиевую кислоту, не менее чем в трех повторах для каждой исследуемой концентрации в диапазоне от 0,05 до 40 нМ по доцетакселу и культивировали в присутствии препаратов в течение 72 ч. При работе с полимерными частицами, содержащими доцетаксел, при приготовлении растворов концентрацию рассчитывали, исходя из процентной доли доцетаксела в частицах. За 2 часа до окончания инкубации в каждую лунку добавляли по 50 мкл раствора МТТ (бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия) в концентрации 1 мг/мл в среде для культивирования клеток. После развития окраски среду удаляли, выпавшие кристаллы формазана растворяли в 100 мкл ДМСО и измеряли интенсивность окраски по поглощению при 540 нм с помощью многоканального планшетного спектрофотометра. Выживаемость клеток оценивали в процентах от необработанного контроля и по кривым выживаемости рассчитывали значение 1С 50 - концентрацию препарата, при которой наблюдается гибель 50% клеток. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы OriginPro, («OriginLab», США), используя t-критерий Стьюдента. Данные представляли в виде средних значений и стандартной ошибки среднего. Достоверными считали различия при р<0,05.

Таким образом, по совокупности всех полученных результатов испытаний, предложенный способ получения полимерных частиц в микрофлюидном реакторе позволяет получать лиофилизат, содержащий доцетаксел не менее 4%мас, характеризующийся тем, что при добавлении к лиофилизату физиологического раствора и последующем, встряхивании образует суспензию частиц с оптимальными характеристиками.(средний размер частиц 220±30 нм, индекс полидисперсности не более 0,05) для последующего инъекционного введения, обладающих высокой цитотоксической активностью в отношении опухолевых клеток. Отличием от ранее известных способов является использование в составе водной фазы компонента (этанол), который является растворителем для активного ингредиента (доцетаксел) и одновременно осаждает полимерный компонент (PLGA) из неводной фазы. Неочевидным результатом применения этанола является получение полимерных частиц, содержащих большее количество доцетаксела по сравнению с известными способами их получения в микрофлюидном реакторе.

Источники информации, принятые во внимание:

1. Hodgson J. ADMET-turning chemicals into drugs. Nat Biotechnol. 2001;19:722-726

2. Loftsson T, Brewster ME. Pharmaceutical applications of cyclodextrins: basic science and product development. J Pharm Pharmacol. 2010;62:1607-1621

3. Chiellini, F.; Piras, A.M.; Errico, C; Chiellini, E. Micro/nanostructured polymeric systems for biomedical and pharmaceutical applications // Nanomedicine. - 2008. - Vol. 3(3). - P.367-393

4. Kydd J., Jadia R., Velpurisiva P., Gad A., Paliwal S., Rai P. Targeting Strategies for the Combination Treatment of Cancer Using Drug Delivery Systems // Pharmaceutics. 2017. V. 9. №4

5. Low P.S., Kularatne S.A. Folate-targeted therapeutic and imaging agents for cancer // Current opinion in chemical biology. 2009. V. 13. №3. P. 256-262

6. Elnakat H., Ratnam M. Distribution, functionality and gene regulation of folate receptor isoforms: implications in targeted therapy // Adv Drug Deliv Rev. 2004. V. 56. №8. P. 1067-1084

7. Dinarvand R., Sepehri N., Manoochehri S., Rouhani H., Atyabi F.

Polylactide-co-glycolide nanoparticles for controlled delivery of anticancer agents // International journal of nanomedicine. 2011. V.6. P. 877-895

8. Гербст А., Шудегов B.B., Яруллин Р.Ф., Наземцева Л. Нанотехнология и микрореакторы - параллели в развитии // Био- и нанотехнологии. 2012. №3 (16). С. 78-88.

9. Yasir Mehmood, Farooq U. Excipients Use in Parenteral and Lyophilized Formulation Development // Open Science Journal of Pharmacy and Pharmacology. 2015. V. 3. №3. P. 19-27

10. Stolnik S., Illum L., Davis S.S., Long Circulating Microparticulate Drug Carriers // Adv Drug Deliver Rev. 1995. V. 16. №2-3. P. 195-214

11. Prabhu R.H., Patravale V.B., Joshi M.D. Polymeric nanoparticles for targeted treatment in oncology: current insights // International journal of nanomedicine. 2015. V. 10. P. 1001-1018

12. Заявка США № US 20060188566 от 2006.08.24

13. Заявка США № US 2010216804 от 2010.08.26

14. Заявка США №US2002041898 от 2002.04.11

15. Полтавец Ю.И., Гроховский В.В., Гукасова Н.В., Заварзина В.В., Воронцов Е.А. Получение полимерных частиц, содержащих полусинтетическое производное подофиллотоксина, с помощью микрофлюидной технологии // Биофармацевтический журнал. 2017. V. 9. №3. Р. 14-21

16. Раимов Д.Р., Суслов В.В. Получение полимерных микронных и субмикронных частиц с использованием микрофлюидных проточных технологий // Успехи в химии и химической технологии. 2015. V. XXIX. №10. Р. 118-119

17. Патент США № US 9381477 от 2016.07.05

18. Патент США № US 9592198 от 2017.03.14

19. Патент РФ №2637653 от 2017.12.05