СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕПАРИНОВ С НИЗКОЙ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССОЙ

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для создания эффективного средства профилактики и лечения тромботических состояний (инфаркты, инсульты различной локализации).

В последнее десятилетие низкомолекулярные гепарины (НМГ) с более узким молекулярно-массовым распределением 4-6 кДа начали вытеснять нефракционированный гепарин как лекарственный препарат. Главное преимущество НМГ следует из их фармакокинетических свойств: в 2-4 раза большее время полувыведения из организма, заметно лучшая биодоступность при подкожном введении и более стабильная дозовая реакция (доза может быть рассчитана только исходя из веса пациента, без дополнительного лабораторного исследования). Меньший токсический эффект связан с вызываемой нефракционированным гепарином тромбоцитопенией, что в свою очередь обусловлено меньшим взаимодействием НМГ с тромбоцитами.

Известны разные способы получения НМГ с низким выходом путем фракционирования природного препарата или с высоким выходом контролируемой деполимеризацией [1]. Возможно получение НМГ путем частичной деполимеризации α-гликозидных связей гепарина с помощью гепариназы. Используемый в этом процессе фермент продуцируется Flavobacterium heparinum [2]. Получение НМГ ферментативным путем, минимально затрагивающим структуру молекулы гепарина, на основе этого процесса получают препарат Логипарин [1].

Мы исследовали возможность получения НМГ под влиянием гидролитических ферментов, никогда с этой целью не использовавшихся. Цель изобретения - получение НМГ действием иммобилизованных гидролаз.

Данная цель достигается тем, что для гидролиза используются папаин, химотрипсин, «протеза С» или целловиридин.

Описан гидролиз такого полисахарида, как хитозан, действием различных гидролаз: гемицеллюлаз, лизоцима, папаин, липазы, глюканазы, протеазы и других ферментов [3, 4]. Мы предположили, что гепарин, возможно, тоже будет подвергаться неспецифическому действию гидролитических ферментов. Нами были выбраны такие протеолитические ферментные препараты, как препарат «Протеаза С», папаин и химотрипсин, также ферментный препарат целловиридин - промышленный ферментный препарат гидролаз на основе штамма Trichoderma viride. Целловиридин Г20Х содержит целлюлазы, ксилоназы, β-глюканазы и гемицеллюлазы, кислую протеазу и др. Препарат активен в диапазоне рН от 3 до 6 при температурах 30-55°С и используется в ветеринарии в качестве кормовой добавки. Препарат «Протеаза С» представляет собой смесь экзопротеиназ. В состав препарата входят: сериновая протеиназа I, сериновая протеиназа II, нейтральная протеиназа, арбоксипептидаза, аминопептидаза. Препарат активен в диапазоне рН от 5 до 10,5 при температурах 30-50°С и представляет собой медицинскую субстанцию на основе штамма Acremonium chrysogenum, предназначенную для изготовления на ее основе лекарственных средств, используемых в различных направлениях медицины, а также в пищевой промышленности. Папаин - это тиоловая цистеиновая эндопротеаза из подкласса КФ 3.4.22, имеющая в активном центре SH-группу цистерна. По характеру ферментативного действия ее называют «растительным пепсином». Но в отличие от пепсина папаин активен не только в кислых, но и в нейтральных и щелочных средах (диапазон рН 3-12, оптимум рН 5). Он сохраняет активность в широком температурном диапазоне. Папаин обладает широкой специфичностью и сохраняет активность в широком температурном диапазоне. Для проявления максимальной активности при его использовании необходима предварительная активация с помощью мягких восстановителей, например добавление 5 мМ L-цистеина и 2 мМ этилендиаминтетраацетата натрия. Путь катализируемой папаином реакции сходен с таковым для химотрипсина, но в случае папаина в качестве интермедиата образуется тиоацилфермент. Папаин имеет меньшую специфичность, чем химотрипсин.

Папаин используется в иммобилизованном состоянии для гидролиза хитозана с целью получения олигомеров [5]. Химотрипсин кристаллический - ферментный препарат протеолитического действия, получаемый из поджелудочной железы крупного рогатого скота. В некоторых случаях химотрипсин производит более глубокий гидролиз белка, чем трипсин. Более стоек трипсин, и медленнее инактивируется. Молекулярная масса от 21600 до 27000 Да, рН оптимум 7,0-9,0, температурный оптимум 50°С, pI - 8,1-8,2.

Наиболее близким по технической сущности является способ получения НМГ путем частичной деполимеризации α-гликозидных связей гепарина с помощью гепариназы. Используемый в этом процессе фермент продуцируется Flavobacterium heparinum [6, 7]. Получение НМГ ферментативным путем, минимально затрагивающим структуру молекулы.

Нами предложен способ получения низкомолекулярного гепарина с помощью ферментативной деполимеризации, характеризующийся тем, что папаин, химотрипсин или комплексы гидролаз, содержащиеся в препаратах «протезы С» и целловиридина, иммобилизуют на силохроме или на поливиниловом спирте, и при ведении ферментативной деполимнризации иммобилизованные ферменты перемешивают с раствором гепарина при 45-50°С 1,5-3 ч, отделяют иммобилизованный препарат центрифугированием, промывают 0,5 М раствором поваренной соли и водой, присоединяют к супернатанту и обессоливают на колонке с сефадексом и лиофильно высушивают. В случае использования иммобилизованного папаина раствор гепарина в ацетатном буфере рН 6,0 перемешивали с иммобилизованным ферментом при температуре 45°С в течение 1,5 часов. Иммобилизованный фермент отделяли либо на стеклянном пористом фильтре, либо с помощью центрифуги, промывали 0,5 М NaCl и водой. Промывки присоединяли к супернатанту и обессоливали на колонке с сефадексом G-10. Высушивали лиофильно. С выходом около 70-80% получали гепарины с молекулярной массой на 40-65% ниже, чем у исходного гепарина.

В случае использования иммобилизованного химотрипсина раствор гепарина в ацетоном буфере рН 6,0 перемешивали с иммобилизованным ферментом при температуре 45°С в течение 3 часов. Иммобилизованный фермент отделяли либо на стеклянном пористом фильтре, либо с помощью центрифуги, промывали 0,5 М NaCl и водой. Промывки присоединяли к супернатанту и обессоливали на колонке с сефадексом G-10. Высушивали лиофильно. С выходом около 70-80% получали гепарины с молекулярной массой на 30-35% ниже, чем у исходного гепарина.

В случае иммобилизованного препарата «Протеаза С» раствор гепарина в фосфатном буфере рН 8,0 перемешивали с иммобилизованным ферментом при температуре 50°С в течение 3 часов. Иммобилизованный фермент отделяли либо на стеклянном пористом фильтре, либо с помощью центрифуги, промывали 0,5 М NaCl и водой. Промывки присоединяли к супернатанту и обессоливали на колонке с сефадексом G-10. Высушивали лиофильно. С выходом около 70-80% получали гепарины с молекулярной массой в 4 раза ниже, чем у исходного гепарина.

В случае использования иммобилизованного целловиридина раствор гепарина в ацетатном буфере рН 4,5 перемешивали с иммобилизованным ферментом при температуре 50°С в течение 3 часов. Иммобилизованный фермент отделяли либо на стеклянном пористом фильтре, либо с помощью центрифуги, промывали 0,5 М NaCl и водой. Промывки присоединяли к супернатанту и обессоливали на колонке с сефадексом G-10. Высушивали лиофильно. С выходом около 70-80% получали гепарины с молекулярной массой на 40-60% ниже, чем у исходного гепарина.

Иммобилизованные ферменты папаин, химотрипсин, препараты «протеазы С» и целловиридина с целью деполимеризации гепарина использованы нами впервые. При этом установлено, что анти Xa-активность целевого продукта составляет 160-290 ед./мг, что соответствует удельной активности такого препарата НМГ как фраксипарин (160-280 ед./мг).

Иммобилизацию папаина, химотрипсина, целловиридина и препарата «протеазы С» на силохроме осуществляли, используя глутаровый альдегид.

К 1 г аминосилохрома добавляли 8 мл 12,5% раствора глутарового альдегида в 0,1 М натрий фосфатном буфере, рН 7,2. Перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем сорбент отмывали от избытка глутарового альдегида водой и 0.1 М натрий фосфатным буфером, рН 7,2, и добавляли раствор фермента (10-15 мл) с концентрацией 1 мг/мл в этом же буфере, перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре и оставляли при охлаждении 4°С еще на 16 ч. Промывали на стеклянном пористом фильтре водой (200 мл), 1М NaCl (200 мл) и вновь водой. Количество иммобилизованного белка определяли по разности его содержания в исходном растворе фермента и в промывных растворах. Иммобилизованные ферменты хранили в холодильнике в воде. В случае папаина исходный раствор фермента готовили в 0,1 М натрий фосфатном буфере, рН 7,2, содержащем 5 мМ L-цистерна и 2 мМ ЭДТА.

Иммобилизацию папаина, химотрипсина, целловиридина и препарата «протеазы С» на органическом сорбенте поливиниловом спирте, содержащем альдегидные группы (150-200 мкмоль/г сырого сорбента) осуществляли по следующей методике: к 4 г «сырого» (отжатого на стеклянном пористом фильтре) сорбента добавляли 55 мл раствора фермента в 0,1 М фосфатном буфере с рН 7,1 с концентрацией белка 0 75 мг/мл перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре и оставляли при охлаждении 4°С еще на 16 ч. Промывали на стеклянном пористом фильтре водой (200 мл), 1М NaCl (200 мл) и вновь водой. Количество иммобилизованного белка определяли по разности его содержания в исходном растворе фермента и в промывных растворах. Блокирование непрореагировавших альдегидных групп на сорбенте после ковалентного связывания ферментом осуществляли обработкой 0,1 М Трис-HCl буфером с рН 7,5 при перемешивании в течение 2 часов

Иммобилизованные ферменты хранили в холодильнике в воде.

Пример 1. К 6 мл 1% раствора гепарина (мукозный свиной, молекулярная масса 7,5 кДа) в 0,05 М ацетатном буфере рН 4,5 добавляли 25 мг иммобилизованного на силохроме папаина (содержание белка 8,5 мг/г). Весовое отношение фермента к навеске гепарина 1:1000. Суспензию перемешивали при 45°С в течение 1,5 часов. Иммобилизованный препарат отделяли центрифугированием, промывали 0,5 М NaCl и водой. Промывки присоединяли к супернатанту и обессоливали на колонке с сефадексом G-10 (2,5×42 см), элюент вода, скорость элюции 80 мл/ч, высушивали лиофильно. Получали 42 мг (70% от исходного) с молекулярной массой 4,7 кДа.

Пример 2. К 6 мл 1% раствора гепарина (из крупного рогатого скота, молекулярная масса 13,8 кДа) в 0,05 М ацетатном буфере рН 4,5 добавляли 0,055 г иммобилизованного на силохроме папаина (содержание белка 11,8 мг/г). Весовое отношение фермента к навеске гепарина 1:100. Суспензию перемешивали при 45°С в течение 3 часов. Иммобилизованный препарат отделяли центрифугированием, промывали 0,5 М NaCl и водой. Промывки присоединяли к супернатанту и обессоливали на колонке с сефадексом G-10 (2,5×42 см), элюент вода, скорость элюции 80 мл/ч, высушивали лиофильно. Получали 49,7 мг (82,8% от исходного) с молекулярной массой 5,8 кДа.

Пример 3. К 6 мл 1% раствора гепарина (из крупного рогатого скота, молекулярная масса 13,8 кДа) в 0,05 М ацетатном буфере рН 4,5 добавляли 0,18 г иммобилизованного на ПВС папаина (содержание белка 3,3 мг/г). Весовое отношение фермента к навеске гепарина 1:50. Суспензию перемешивали при 45°С в течение 3 часов. Иммобилизованный препарат отделяли центрифугированием, промывали 0,5 М NaCl и водой. Промывки присоединяли к супернатанту и обессоливали на колонке с сефадексом G-10 (2,5×42 см), элюент вода, скорость элюции 80 мл/ч, высушивали лиофильно. Получали 50 мг (83% от исходного) с молекулярной массой 6,1 кДа.

Пример 4. К 6 мл 1% раствора гепарина (из крупного рогатого скота, молекулярная масса 13,8 кДа) в 0,05 М фосфатном буфере рН 8,0 добавляли 0,15 г иммобилизованного на ПВС препарата «Протеазы С» (содержание белка 8,0 мг/г). Весовое отношение фермента к навеске гепарина 1:50. Суспензию перемешивали при 50°С в течение 3 часов. Иммобилизованный препарат отделяли центрифугированием, промывали 0,5 М NaCl и водой. Промывки присоединяли к супернатанту и обессоливали на колонке с сефадексом G-10 (2,5×42 см), элюент вода, скорость элюции 80 мл/ч, высушивали лиофильно. Получали 247 мг (82% от исходного) с молекулярной массой 3,4 кДа.

Пример 5. К 6 мл 1% раствора гепарина (из крупного рогатого скота, молекулярная масса 13,8 кДа) в 0,05 М фосфатном буфере рН 6,0 добавляли 0,67 г иммобилизованного на силохроме препарата «Протеазы С» (содержание белка 0,9 мг/г). Весовое отношение фермента к навеске гепарина 1:100. Суспензию перемешивали при 50°С в течение 3 часов. Иммобилизованный препарат отделяли центрифугированием, промывали 0,5 М NaCl и водой. Промывки присоединяли к супернатанту и обессоливали на колонке с сефадексом G-10 (2,5×42 см), элюент вода, скорость элюции 80 мл/ч, высушивали лиофильно. Получали 46 мг (77% от исходного) с молекулярной массой 4 кДа.

Пример 6. К 6 мл 1% раствора гепарина (из крупного рогатого скота, молекулярная масса 13,8 кДа) в 0,05 М ацетатном буфере рН 4,5 добавляли 0,15 г иммобилизованного на ПВС препарата целловиридин (содержание белка 9,4 мг/г). Весовое отношение фермента к навеске гепарина 1:50. Суспензию перемешивали при 50°С в течение 3 часов. Иммобилизованный препарат отделяли центрифугированием, промывали 0,5 М NaCl и водой. Промывки присоединяли к супернатанту и обессоливали на колонке с сефадексом G-10 (2,5×42 см), элюент вода, скорость элюции 80 мл/ч, высушивали лиофильно. Получали 52 мг (87% от исходного) с молекулярной массой 5,8 кДа.

Пример 7. К 6 мл 1% раствора гепарина (из крупного рогатого скота, молекулярная масса 13,8 кДа) в 0,05 М ацетатном буфере рН 4,5 добавляли 0,065 г иммобилизованного на силохроме препарата целловиридин (содержание белка 9,3 мг/г). Весовое отношение фермента к навеске гепарина 1:100. Суспензию перемешивали при 50°С в течение 3 часов. Иммобилизованный препарат отделяли центрифугированием, промывали 0,5 М NaCl и водой. Промывки присоединяли к супернатанту и обессоливали на колонке с сефадексом G-10 (2,5×42 см), элюент вода, скорость элюции 80 мл/ч, высушивали лиофильно. Получали 46,8 мг (78% от исходного) с молекулярной массой 6 кДа.

Пример 8. К 6 мл 1% раствора гепарина (мукозный свиной, молекулярная масса 75 кДа) в 0,05 М ацетатном буфере рН 4,5 добавляли 25 мг иммобилизованного на силохроме химотрипсина (содержание белка 4,9 мг/г). Весовое отношение фермента к навеске гепарина 200. Суспензию перемешивают при 45°С в течение 3 часов. Иммобилизованный препарат отделяли центрифугированием, промывали 0,5 М NaCl и водой. Промывки присоединяли к супернатанту и обессоливали на колонке с сефадексом G-10 (2,5×42 см), элюент вода, скорость элюции 80 мл/ч, высушивали лиофильно. Получали 42 мг (70% от исходного) с молекулярной массой 5,0 кДа.

Источники информации

1. Linhardt R, Loganathan В, Al-Hakim A et al., J. Med. Chem., 33(6), 1639-1645, 1990.

2. Linhardt R, Grant F, Cooney С et al., J. Biol. Chem., 257, 7310-7313, 1982.

3. Muzzarelli R.A.A., Chitin Handbook, Eds. Muzzatelli R.A.A., Peter M.G. European Chitin Society, Atec, Grottammare, Italy, 153-163, 1997.

4. Pantaleone D. Yalpani M., Scollas M., Carbohydrates and Carbohydrate Polymers, Analysis, Biotechnology, Modification, Antiviral, Biomedical and Other Aplications, Ed, Yalpani M. Shrewsbury (USA): ALT Press, 44-51, 1993.

5. Hong Lin, Haiying Wang, Changhu Xue, Mei Ye, Enzyme Microbial Technology, 31, 588-592, 2002.

6. Linhardt R, Grant F, Cooney С et al., J. Biol. Chem., 257, 7310-7313, 1982.

7. ЕР 0244235 b1, 04.11.1987.