Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ РЕПАРАТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ ПРИ ИМПЛАНТАЦИИ СВЕРХЛЕГКОГО ПОЛИПРОПИЛЕНОВОГО ЭНДОПРОТЕЗА В БРЮШНУЮ СТЕНКУ

Изобретение относится к медицине, а именно к герниологии, и может быть использовано при лечении вентральных грыж.

Наиболее близким к предложенному способу является способ пластики грыж передней брюшной стенки легким сетчатым материалом (диаметр нити 0,09 мм) с белково-тромбоцитарным покрытием (заявка на патент РФ №2011129719). Данный способ предполагает использование методики покрытия сетчатых материалов белково-тромбоцитарной оболочкой. Цитратную кровь центрифугировали при 2000 об./мин. Полимеризация белков плазмы осуществлялась под воздействием ионов кальция. К полученной плазме добавляли 10% раствор кальция хлорида в соотношении 4 капли на 1 мл. Плазму размещали в стерильную емкость из расчета 0,5-1,0 мл на 1 см² сетчатого эндопротеза, после этого сетчатый эндопротез пропитывался плазмой, обогащенной тромбоцитами. Покрытая белком сетка помещалась в рану. Связанные с белком плазмы тромбоциты дегранулировали и выделяли факторы роста, стимулирующие процессы регенерации. Через 6-7 дней после имплантации сетка прорастала молодой рыхлой соединительной тканью, а через 2 недели в сетчатом эндопротезе начинала формироваться зрелая соединительная ткань. Основной целью данного способа являлось укрепление легкого сетчатого эндопротеза за счет прорастания его соединительной тканью.

Недостатком данного способа является то, что вышеописанная методика белково-тромбоцитарных покрытий легких сетчатых материалов используется только для укрепления структуры эндопротеза, но не стимулирует репаративные процессы в дегенеративно-измененных тканях в месте имплантации эндопротеза, что замедляет процессы его вживления в брюшную стенку и может способствовать отторжению имплантата. Особенно это важно при имплантации сверхлегких эндопротезов (диаметр нити 0,07 мм), которые при выраженных дегенеративных изменениях брюшной стенки легко отторгаются.

Технический результат изобретения - разработать способ стимуляции репаративных процессов в месте аллогерниопластики, позволяющий ускорить процесс вживления и предупредить отторжение трансплантата из тканей брюшной стенки.

Технический результат заключается в стимуляции репаративных процессов введением в зону имплантации эндопротеза аутоплазмы, обогащенной тромбоцитами, которые играют ключевую роль как промежуточное звено в процессе заживления поврежденной ткани посредством возможности выделять из своих α-гранул факторы роста. Факторы роста - это естественные полипептиды, обладающие широким спектром биологического локального воздействия на основные звенья регенераторного процесса: хемотаксис, клеточную пролиферацию, миграцию клеток, дифференцировку, реструктуризацию и ангиогенез.

Технический результат достигается тем, что при имплантации сверхлегкого (диаметр нити 0,07 мм) полипропиленового эндопротеза в ткани брюшной стенки в место его имплантации вводили обогащенную тромбоцитами аутоплазму, из расчета 0,5 мл плазмы на 1 см² эндопротеза (Фиг. 1). Кроме этого, на 3 сутки в зону имплантации эндопротеза дополнительно вводили обогащенную тромбоцитами аутоплазму, из того же расчета (Фиг. 2). Введение обогащенной тромбоцитами плазмы проводили в места, где наиболее часто возникает нагноение и отторжение трансплантата. Повторное введение обогащенной тромбоцитами аутоплазмы способствует быстрому протеканию стадии экссудации и наступлению стадии пролиферации, а также дальнейшей стимуляции репаративных процессов, что ведет к предупреждению отторжению эндопротеза из тканей брюшной стенки.

Изобретение поясняется фигурами:

Фиг. 1. Введение аутоплазмы, обогащенной тромбоцитами, в область имплантации эндопротеза.

Фиг. 2. Повторное введение по истечении 3-х суток аутоплазмы, обогащенной тромбоцитами, в область имплантации эндопротеза.

Фиг. 3. Микрофотография тканей, окружающих нити эндопротеза на 7-е сутки эксперимента без использования аутоплазмы обогащенной тромбоцитами. Окрашено по Ван-Гизонну. Ув. х400

Фиг. 4. Микрофотография тканей, окружающих нити эндопротеза на 7-е сутки эксперимента, с использованием обогащенной тромбоцитами аутоплазмы. Окрашено по Ван-Гизонну. Ув. Х400.

Фиг. 5. Микрофотография тканей, окружающих нити эндопротеза на 10-е сутки эксперимента без использования аутоплазмы, обогащенной тромбоцитами. Окрашено гематоксилином и эозином. Ув. х200.

Фиг. 6. Микрофотография тканей, окружающих нити эндопротеза на 10-е сутки эксперимента с использование аутоплазмы, обогащенной тромбоцитами. Окрашено гематоксилином и эозином. Ув. х200.

СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ СЛЕДУЮЩИМ ОБРАЗОМ

Способ стимуляции репаративных процессов в брюшной стенке выполняли на 50 кроликах - самцах породы «Шиншилла», массой 2500 г, без внешних признаков заболевания после двухнедельного карантина в условиях вивария Курского государственного медицинского университета.

Все эксперименты были выполнены с соблюдением правил асептики и антисептики. Перед операцией готовили аутоплазму, обогащенную тромбоцитами, по следующей методике: после удаления шерсти и обработки 70% раствором этилового спирта, из вены уха кролика аспирировали в стерильную вакуумную пробирку с 3,8% цитратом натрия (1:9) 5 мл крови. Выполняли однократное центрифугирование при 1500 оборотах в минуту в течение 15 минут. Шприцем с длинной иглой проводили забор осадка в объеме 3-х мл подготовленной плазмы, в которую добавляли 10% раствор хлорида кальция в объеме 0,1 мл для активации тромбоцитов. Под общим наркозом (внутривенно вводили препарат «Золетил 50» в дозе 5 мг/кг массы) выполняли фиксацию животного на спине с разведенными конечностями, двукратно обрабатывали операционное поле 1% раствором йодопирона и однократно - 95% раствором этилового спирта. Затем отграничивали операционное поле с 4-х сторон стерильным бельем, выполняли срединный разрез кожи, подкожной клетчатки длиной 7 см по белой линии живота отступив от мечевидного отростка 1-2 см в направлении к лобковому симфизу. Тупым и острым путем выполняли освобождение апоневроза прямых мышц живота на 4 см в стороны от срединного разреза. Лабораторному животному в асептических условиях, надапоневротически, по методике «on-lay» имплантировали полипропиленовый сетчатый сверхлегкий эндопротез» (диаметр нити 0,07 мм) размерами 3×2 см на апоневроз прямых мышц передней брюшной стенки. Фиксацию эндопротеза выполняли непрерывным швом полипропиленовой мононитью 3/0. После имплантации в ткани передней брюшной стенки вводили (в области 4 углов и по центру) под сетчатый эндопротез аутоплазму, обогащенную тромбоцитами, в объеме 0,5 мл (плазмы) на 1 см² (сетчатого эндопротеза). Гемостаз проводили по ходу операции. По окончанию оперативного вмешательства отдельными узловыми швами ушивали кожу и подкожную клетчатку.

По истечении 3-х суток после операции у кролика повторно выполняли забор крови из вены уха, по изложенной выше методике получали обогащенную тромбоцитами аутоплазму и повторно вводили ее в ткани передней брюшной стенки под имплантированный сетчатый эндопротез (в области 4 углов и по центру), в объеме 0,5 мл (плазмы) на 1 см² (сетчатого эндопротеза).

ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ

Экспериментальное исследование, проведенное в центральной научно-исследовательской лаборатории ФГБОУ ВО «Курский государственный медицинский университет» Минздрава России, было выполнено на 100 кроликах-самцах порода «Шиншилла», массой 2500 г, в возрасте от 1 до 1,5 лет. Выбор кроликов в качестве экспериментальных животных был обусловлен возможностью экстраполяции данных о реактивных изменениях тканей, окружающих эндопротез в условиях использования плазмы, обогащенной тромбоцитами.

Животных отбирали в эксперимент без внешних признаков заболевания после двухнедельного карантина в условиях вивария Курского государственного медицинского университета.

Все манипуляции с лабораторными животными осуществляли в соответствии с принципами биоэтики, правилами лабораторной практики (GLP) и соответствовали международным рекомендациям (этическому кодексу) по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (1985 г.), с соблюдением принципов, изложенных в законе «О защите животных от жестокого обращения» гл. V, ст. 104679 - ГД от 01.12.1999 г., и согласно приказу Минздрава России от 19.06.2003 г. №267 «Об утверждении правил лабораторной практики».

Экспериментальные животные были разделены на две группы (по 50 животных в каждой): животным 1-й группы (контрольной) имплантировали сверхлегкий эндопротез без введения в рану обогащенной тромбоцитами аутоплазмы, во 2-й (опытной) группе - с введением в рану обогащенной тромбоцитами аутоплазмы в асептических условиях по методике «on-lay».

Все эксперименты были выполнены с соблюдением правил асептики и антисептики. Животным в 1 группе (контрольной) под общим наркозом (внутривенно вводили препарат «Золетил 50» в дозе 5 мг/кг массы) выполняли фиксацию животного на спине с разведенными конечностями, двукратно обрабатывали операционное поле 1% раствором йодопирона и однократно - 95% раствором этилового спирта. Затем отграничивали операционное поле с 4-х сторон стерильным бельем, выполняли срединный разрез кожи, подкожной клетчатки длиной 7 см по белой линии живота отступив от мечевидного отростка 1-2 см в направлении к лобковому симфизу. Тупым и острым путем выполняли освобождение апоневроза прямых мышц живота на 4 см в стороны от срединного разреза. Животным после выполненной манипуляции надапоневротически, по методике «on-lay» имплантировали сетчатый полипропиленовый эндопротезы (диаметр нити 0,07 мм) размерами 3×2 см. Фиксацию сетчатого эндопротеза выполняли непрерывным швом полипропиленовой мононитью 3/0. Гемостаз проводили по ходу операции. После завершения оперативного вмешательства, отдельными узловыми швами ушивали кожу и подкожную клетчатка.

Животным во 2-й группе (опытной) перед операцией готовили аутоплазму, обогащенную тромбоцитами, по следующей методике: после удаления шерсти и обработки 70% раствором этилового спирта, из вены уха кролика аспирировали в стерильную вакуумную пробирку с 3,8% цитратом натрия (1:9) 5 мл крови. Выполняли однократное центрифугирование при 1500 оборотах в минуту в течение 15 минут. Шприцем с длинной иглой проводили забор осадка в объеме 3-х мл подготовленной плазмы, в которую добавляли 10% раствор хлорида кальция в объеме 0,1 мл для активации тромбоцитов. Под общим наркозом (внутривенно вводили препарат «Золетил 50» в дозе 5 мг/кг массы). Выполняли фиксацию животного на спине с разведенными конечностями, двукратно обрабатывали операционное поле 1% раствором йодопирона и однократно - 95% раствором этилового спирта. Затем отграничивали операционное поле с 4-х сторон стерильным бельем, выполняли срединный разрез кожи, подкожной клетчатки длиной 7 см по белой линии живота отступив от мечевидного отростка 1-2 см в направлении к лобковому симфизу. Тупым и острым путем выполняли освобождение апоневроза прямых мышц живота на 4 см в стороны от срединного разреза. Лабораторному животному в асептических условиях, надапоневротически, по методике «on-lay» имплантировали полипропиленовый сетчатый сверхлегкий эндопротез (диаметр нити 0,07 мм) размерами 3×2 см на апоневроз прямых мышц передней брюшной стенки. Фиксацию эндопротеза выполняли непрерывным швом полипропиленовой мононитью 3/0. После имплантации в ткани передней брюшной стенки вводили (в области 4 углов и по центру) под сетчатый эндопротез аутоплазму, обогащенную тромбоцитами, в объеме 0,5 мл (плазмы) на 1 см² (сетчатого эндопротеза). Гемостаз проводили по ходу операции. По окончанию оперативного вмешательства отдельными узловыми швами ушивали кожу и подкожную клетчатку. По истечении 3-х суток после операции у кролика повторно выполняли забор крови из вены уха, по изложенной выше методике получали обогащенную тромбоцитами аутоплазму и повторно вводили ее в ткани передней брюшной стенки под имплантированный сетчатый эндопротез (в области 4 углов и по центру), в объеме 0,5 мл (плазмы) на 1 см² (сетчатого эндопротеза).

На протяжении всего эксперимента проводили динамическое наблюдение за общим состоянием животных и заживлением послеоперационных ран. Из эксперимента животных выводили на 7 и 10 сутки после операции, путем передозировки средств для наркоза.

После выведения животных из эксперимента в указанные сроки проводили забор материала для морфологических исследований (изучение реакции тканей, окружающих эндопротез).

Для гистологического измерения реактивных изменений тканей, окружающих имплантированный эндопротез, иссекали единым блоком участок передней брюшной стенки кролика размерами 2×2 см, включая материал эндопротеза. Извлеченные фрагменты биологического материала растягивали на пластинах плотного картона для предупреждения их деформации во время фиксации, а затем, полностью погружали в 10% раствор забуференного нейтрального формалина на 2 недели с обязательной заменой раствора на 2-е сутки фиксации. После фиксации, из взятого блока иссекали кусочки размерами 1×1 см, включающие обязательно материал эндопротеза и заливали в парафин по стандартной методике. Далее, из одной части материала изготовляли гистологические срезы, толщиной 5-7 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином.

Изучение гистологических препаратов сверхлегкого эндопротеза (толщина нити 0,07 мм) на 7-е сутки исследования у животных в 1-й группе (контрольной) без применения обогащенной тромбоцитами аутоплазмы выявило, что вокруг нитей эндопротеза визуализируются тонкие, новообразованные коллагеновые волокна. Нити эндопротеза окружены слоем фибробластов, крупных размеров. Их форма варьирует от кубической до призматической, При этом, в большинстве случаев, фибробласты располагаются в два ряда. Между нитей эндопротеза новообразованная соединительная ткань не зрелая. Она образована хаотично переплетающимися тонкими волокнами (Фиг. 3).

Изучение гистологических препаратов на 7-е сутки во 2-й группе (опытной) сочетанного использования эндопротеза сверхлегкий (толщина нити 0,07 мм) и обогащенной тромбоцитами аутоплазмы выявлено, что процесс образования перипротезной капсулы находится на более поздней стадии развития. С внутренней стороны эндопротеза наблюдается широкая зона, содержащая зрелые коллагеновые волокна, расположенные, пока еще, не плотно и хаотично. С наружной стороны эндопротеза, также, происходит упорядочивание и структуризация волокон соединительной ткани. Плотность клеток высокая, в поле зрения преобладают клетки фибробластического ряда (Фиг. 4).

При изучении гистологических препаратов сверхлегкого эндопротеза в 1-й группе (контрольной) без применения обогащенной тромбоцитами аутоплазмы на 10-е сутки эксперимента осмотр раны выявил полную регенерацию кожного покрова. Эпидермис и подлежащая дерма восстановлены полностью. Сосочковый и сетчатый слои дермы без особенностей. Над апоневрозом визуализируются поперечно срезанные полипропиленовые эндопротезы, окруженные незрелой соединительнотканной капсулой, с хорошо визуализируемым разделением на внутренний и наружный слои. Во внутреннем, клеточном слое капсулы находятся единичные фибробласты мелких размеров и большое количество вытянутых, уплощенной формы фиброцитов (Фиг. 5).

При изучении гистологических препаратов сверхлегкого эндопротеза во 2-й группе (опытной) с применения обогащенной тромбоцитами аутоплазмы качественные структурные изменения перипротезной ткани начинаю визуализироваться на 10-е сутки эксперимента. Наблюдается толстая, хорошо сформированная перипротезная капсула, зрелые соединительнотканные волокна которой располагаются плотно, компактно и параллельно друг другу. Межволоконные промежутки слабо выражены, угол анастомоза между волокнами маленький. В перипротезной капсуле хорошо визуализируется подразделение на слои: внутренний клеточный и наружный волокнистый. Во внутреннем клеточном слое плотность клеток выше, чем в группе наблюдений без применения аутоплазмы обогащенной тромбоцитами. В поле зрения, в наружном слое капсулы на фоне преобладания волокнистого компонента визуализируются фиброциты. Во внутреннем слое капсулы преобладают клетки фибробластического ряда. Между нитей эндопротеза, также определяются зрелые коллагеновые волокна (Фиг. 6).

Таким образом, у животных во 2-й группе (опытной) исследования при использовании обогащенной тромбоцитами аутоплазмы выявленная картина реактивных изменений соединительной ткани свидетельствует о более быстро протекающих стадиях воспаления, их смене и наступлении в более ранние сроки пролиферативных процессов. Сформированная перипротезная капсула, состоящая из волокнистой соединительной ткани, образует прочный каркас и выполняет механическую функцию, обеспечивая, при этом, тесную связь с окружающими тканями.