ШТАММ LACTOBACILLUS BREVIS BA-13, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ И ПРОДУКТОВ ПИТАНИЯ

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине при изготовлении лечебных препаратов для нормализации микрофлоры кишечника и вагины при дисбиотических состояниях различной этиологии у детей и взрослых, а также в пищевой промышленности при производстве продуктов питания.

В настоящее время пробиотик - лактобактерин готовят из микробной массы живых, антагонистически-активных штаммов Lactobacillus plantarum 8P-A3 и Lactobacillus fermentum 90T-S4, Lactobacillus fermentum 39, Lactobacillus plantarum 38 (см. ФС 42-3241-95, Лактобактерин в таблетках).

Однако известно, что в реализации положительной роли нормофлоры человека принимают участие и другие виды лактобацилл, в частности, Lactobacillus brevis. К тому же механизм защитного действия отдельных видов лактобактерий отнюдь не одинаков, именно поэтому для производства лекарственного препарата из лактобактерина целесообразно использовать и другие виды лактобацилл, являющихся представителями нормофлоры.

Задачей изобретения является изыскание штамма микроорганизмов вида Lactobacillus brevis, обладающего высокими адгезивными свойствами к вагинальному и желудочному эпителию, высокой антибиотической и протеолитической активностью, а также необходимой активностью кислотообразования.

Новый штамм Lactobacillus brevis BA-13 выделен из соскоба слизистой желудка здорового взрослого человека.

Штамм депонирован в коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасовича под номером 261.

Культурально-морфологические признаки.

Полиморфные грамположительные палочки длиной от 3,5 до 6,0 мкм при толщине 1,2 мкм, утолщенные, прямые, короткие, иногда приближающиеся к кокковидной форме или слегка изогнутые с закругленными концами. Неподвижны, спор не образуют, могут располагаться парами или образовывать короткие цепочки.

Растет на жидкой среде Блаурокка, содержащей глюкозу, при 37^oС (инкубирование в течение 24 часов) в нижней половине столбика среды с образованием хлопьевидного осадка без газообразования.

На чашках с плотной питательной средой через 18-24 часа образует колонии выпуклые, слабоблестящие, диаметром 0,8-1,6 мм. При 15^oС наблюдается устойчивый рост колоний. При 45^oС рост колоний практически отсутствует. Оптимальная температура выращивания (37±1)^oС. Способ накопления биомассы: печеночная среда Блаурокка.

Среда высушивания - сахарозо-желатиновая.

Хранится в лиофилизированном виде при температуре 0-8^oС.

Физиолого-биохимические признаки.

Анаэроб (факультативный анаэроб).

Данные по ферментативной активности приведены в таблице 1.

Каталазу не образует, желатин не разжижает, индол и сероводород не образует.

Сбраживает молоко через 12 часов (при 37^oС) с образованием плотного ровного сгустка без синерезиса.

Активность кислотообразования штамма составляет 120^oТ.

Биотехнологические характеристики
Штамм продуцирует органические кислоты, (преимущественно молочная кислота) и вещества антибиокоподобного действия (бактериоцины), обеспечивающие проявления антагонистической активности по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. Выращивание штамма и лиофильное высушивание обеспечивает получение биомассы с концентрацией 1•10¹¹ микробных тел/г.

Антагонистические свойства.

Антагонистическая активность изучалась по отношению к стафилококкам, гемолизирующим кишечным палочкам, цитробактериям, сальмонеллам, хеликобактериям и грибам рода Candida. В качестве индикаторных штаммов использовали эталонные штаммы вышеуказанных условно-патогенных микроорганизмов, а также штаммы, выделенные от детей и взрослых при обследовании на дисбактериоз и от больных различной патологией желудочно-кишечного тракта.

Антагонистическая активность штамма лактобацилл Lactobacillus brevis BA-13 приведена в таблице 2.

Антибиотикоустойчивость штамма.

С помощью теста для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам АТВ ANA 14 260 фирмы Bio Merieux, содержащего 25 антибиотиков установлено, что штамм устойчив к цефокситину, цефотетану, тетрациклину, метронидазолу, тейкопланину, ванкомицину.

Острая и хроническая токсичность.

При исследовании острой и хронической токсичности на мышах массой 15-18 г показано, что штамм токсическими свойствами не обладает.

Лиофилизированная биомасса лактобактерий штамма Lactobacillus brevis BA-13 с титром 10⁶-10¹⁰ КОЕ/г использовалась в качестве препарата пробиотика для коррекции микробиоценоза вагины и лечения язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки.

Пример 1.

Больная Д., 58 лет, обратилась с жалобами на зуд, обильные выделения из половых органов. Считает себя больной в течение последних 3-х лет после наступления менопаузы. Несколько раз лечилась антибиотиками. При микроскопии мазка: лейкоциты до 60 в поле зрения, умеренное количество десквамированного эпителия, много кокковых форм. Диагноз: хронический кольпит. Назначены вагинальные свечи массой 1,5 г, содержащие каждая Lactobacillus brevis BA-13 в количестве не менее 1•10⁷ КОЕ, 3 раза в сутки в течение 2-х дней, затем - 2 раза в сутки в течение недели. На фоне проводимого лечения на 3 сутки исчезли явления зуда, уменьшились гиперемия и выделения. На 10 день в мазке: в поле зрения лейкоциты - единичные, эпителий - умеренное количество, лактобактерий - много. Рекомендовано с профилактической целью повторить курс через 2-3 месяца.

Пример 2.

Больная Г. , 23 года обратилась с жалобами на зуд в области влагалища, иногда очень интенсивный. Длительно принимала антибиотики по поводу воспалительного процесса в придаточных пазухах носа. При осмотре: на слизистых влагалища белый творожистый налет, легко снимающийся; выделения скудные. В мазке: обнаружены почкующиеся дрожжевые клетки. Диагноз: микотический вагинит. Назначено лечение: тампоны, пропитанные суспензией препарата Lactobacillus brevis штамма ВА-13 с титром 1•10⁷ КОЕ/мл, утром и вечером в течение недели. На 3 сутки лечения клинические симптомы регрессировали. На 7 сутки при микроскопии мазка дрожжевые клетки не обнаружены.

Пример 3.

Больной Л., возраст 62 года. Впервые диагноз "Язвенная болезнь 12-перстной кишки" (ЯБДК) поставлен в 1981 г. После консервативного стационарного лечения наблюдалась ремиссия в течение 12-13 лет. В последующем - ежегодные осенне-зимние обострения, купировавшиеся приемом фосфалюгеля (альмагель), реглана, викалина.

Осенью 1998 г обратился с жалобами на изжогу, отрыжку, резко выраженные болевые ощущения в эпигастральной области, отсутствие аппетита. Назначено лечение: пероральное введение препарата лактобактерий в дозе 0,9 г при содержании в этом количестве жизнеспособных клеток лактобактерий 5•10⁷. Свежеприготовленная суспензия из лиофильно высушенного штамма ВА-13 через 30-40 мин после еды 3 раза в день и бифидумбактерин по 3 пакета по 1 г 3 раза в день за 15 мин до еды. Уже через 3 часа после приема препаратов наблюдалось снижение интенсивности диспептических явлений, восстановление аппетита. Недельный прием препаратов полностью купировал обострение ЯБДК.

Пример 4.

Приготовление кисломолочного продукта лечебно-профилактического назначения с использованием предлагаемого штамма Lactobacillus brevis BA-13 в качестве монокультуры.

Для приготовления продукта была использована сухая биомасса Lactobacillus brevis штамма BA-13 с концентрацией 2•10⁸ КОЕ/г. В стерилизованное молоко с температурой 36-38^oС вносят 5% закваски данного штамма, смесь перемешивают и выдерживают при указанной температуре до образования сгустка. Сквашивание молока наступает через 12 часов с образованием сгустка кислотностью 75^oТ (рН=4,6 ед). После сквашивания продукт охлаждают до 20^oС, производят розлив, а затем доохлаждают до 6^oС. Готовый продукт имеет однородную, жидкую консистенцию, чистый приятный кисломолочный вкус с незначительным привкусом топленого молока, кислотность - 80^oТ, содержит в 1 см³ 5•10⁸ жизнеспособных клеток указанного штамма.

Производственную закваску на основе данного штамма готовят на стерилизованном молоке из сухой закваски. Доза иннокуля-ции сухой закваски составляет 1•10⁶ КОЕ/см³, температура приготовления закваски - 37-38^oС.

Пример 5.

Приготовление кисломолочного продукта лечебно-профилактического назначения с использованием предлагаемого штамма Lactobacillus brevis BA-13 в качестве компонента заквасочных культур.

В пастеризованное молоко при температуре 37-38^oС вносят 1% закваски штамма ВА-13, содержащей 8•10⁸ КОЕ/см³ и 4% активизированной суспензии бифидобактерий штамм 1 с концентрацией 5•10⁷ КОЕ/см³. Сквашивание молока наступает через 10 часов, кислотность сгустка в конце сквашивания 80^oТ (рН=4,5 ед). Продукт охлаждают до 20^oС, разливают в тару и доохлаждают до 6^oС. Готовый продукт имеет однородную консистенцию, чистый кисломолочный, слегка острый вкус, кислотность 85^oТ, содержит в 1 см³ 8•10⁸ КОЕ кисломолочных палочек и 5•l0⁷ KOE бифидобактерий.

Производственную закваску на основе штамма Lactobacillus brevis ВА-13 готовят, как указано в примере 1. Активизированную биомассу бифидобактерий готовят согласно ТУ 9222-006-16414608-00.

Таким образом, новый штамм можно рекомендовать для приготовления пробиотических препаратов в виде суппозиториев, порошка для приготовления суспензий, в капсульной и таблетированной формах и продуктов лечебно-профилактического назначения.