Результат интеллектуальной деятельности: КОНСОРЦИУМ ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ОЧИСТКИ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ ОТ УГЛЕВОДОРОДОВ

Изобретение относится к биотехнологии, экологии и касается новой культуры микроорганизмов, которая может быть использована для утилизации углеводородов и очистки объектов окружающей среды, например воды и почвы, от углеводородов.

Известен консорциум дрожжей Candida maltosa ВКПМ У-2256 и Candida maltosa ВКПМ У-2257, используемый для биодеградации нефтезагрязнений (см. патент РФ №2114174, кл. С12Р 39/00, 1998). Соотношение штаммов в консорциуме может быть любым, предпочтительно 1:1. Диапазон очищаемых углеводородов достаточно широк. Консорциум утилизирует нефтезагрязнения при температуре до 41°С, может работать в засоленных экосистемах. При использовании консорциума для очистки почвы содержание углеводородов нефти на десятые сутки снижается на 30%, а при очистке воды - на 90%.

Наиболее близким аналогом является штамм Rhodococcus globerulus H-42 ВКПМ АС-1641 для разложения нефти и нефтепродуктов, которые являются единственными источниками углерода и энергии (см. патент РФ №2300561, кл. C12N 1/20, 2007). Данный штамм выделен при воздействии космических излучений на штамм Rhodococcus globerulus TCH-OK и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ АС-1641. Данный штамм имеет высокую скорость утилизации нефти и нефтепродуктов.

Недостатком наиболее близкого аналога по достигаемому результату является узкий диапазон применения биопрепарата по значениям рН загрязненной окружающей среды, подлежащей очистке.

Задачей предлагаемого изобретения является повышение эффективности очистки объектов окружающей среды, например воды и почвы, от углеводородов за счет расширения диапазона применения биопрепарата по значениям рН загрязненной окружающей среды, подлежащей очистке.

Поставленная задача решается с помощью консорциума штаммов микроорганизмов дрожжей Candida sp. ВСБ-616 и бактерий Rhodococcus sp. BKПM AC-1258 (вар.16-а) для очистки объектов окружающей среды от углеводородов.

Практические работы по устранению нефтезагрязненных объектов окружающей среды показывают, что консорциумы штаммов, состоящие как из прокариотических микроорганизмов (бактерии), так и эукариотических микроорганизмов (грибы, дрожжи) обладают широкими возможностями при очистке окружающей среды от углеводородов.

Предлагаемый консорциум штаммов создан на основе штамма микроорганизмов дрожжей Candida sp. BCB-616 и штамма микроорганизмов бактерий Rhodococcus sp. ВКПМ AC-1258 (вар.16-а). Преимуществом предлагаемого консорциума является объединение в одной ассоциации двух штаммов микроорганизмов, проявляющих неодинаковую активность по отношению к субстрату и условиям внешней среды (температура окружающей среды, рН загрязненной окружающей среды и источник азота), что повышает эффективность очистки объектов окружающей среды.

Штамм микроорганизмов дрожжей Candida sp. ВСБ-616

Культурально-морфологические признаки

Штамм микроорганизмов дрожжей Candida sp. ВСБ-616 выделен из образцов загрязненного грунта оренбургского филиала ООО «Газпромтранс» с помощью метода накопительных культур при многократном пассировании на минеральной среде следующего состава:

NaH₂PO₄×5H₂O - 10,4 г/л, К₂НР₄×5Н₂О - 10,0 г/л, (NH₄)₂ SO₄ - 5,7 г/л, MgSO₄×7H₂O - 0,7 г/л, FeSO₄ - 12,5 мг/л, ZnSO₄ - 12,5 мг/л, MnSO₄ - 12,5 мг/л, CuSO₄ - 12,5 мг/л, при этом устанавливали рН среды 5,5.

В качестве единственного источника углерода и энергии использовали жидкие н-парафины в количестве 0,5-1,0 об.%. Культивирование образцов данного штамма дрожжей проводили в колбах на круговых качалках при скорости ее вращения 220 об/мин и температуре окружающей среды 34°С. Получение чистой культуры вели на агаризованной среде сусла-агара. Культурально - морфологические особенности штамма микроорганизмов дрожжей оценивали с помощью фазово-контрастной микроскопии.

В результате проведенных исследований было установлено, что выделенный штамм дрожжей на агаризованной среде сусла-агара образует колонии кремового цвета, пастообразные, матовые, шероховатые с приподнятой серединой и неровными краями, диаметром 3-5 мм (на 4-ые сутки роста). Клетки данного штамма полиморфны: от удлиненно-овальной формы до сильно вытянутой, с поперечным диаметром 4,5-6,5 мкм. Почкование данного штамма полярное. Штамм образует псевдомицелий, состоящий из ветвящихся цепочек коротких псевдогиф.

Физиолого-морфологические признаки

Штамм хорошо сбраживает глюкозу и сахарозу, ассимилирует следующие сахара: глюкозу, сахарозу, мальтозу, целлобиозу, раффинозу, L-арабинозу, ксилозу, рибозу, растворимый крахмал, и не ассимилирует лактозу. Данный штамм микроорганизмов дрожжей активно растет при температуре 20°С-40°С и рН окружающей среды 3,5-6,5. Штамм микроорганизмов дрожжей Candida sp. ВСБ-616 не восстанавливает нитриты, уреазоположительный. Данный штамм использует в качестве единственного источника углерода и энергии н-парафины, в том числе циклические и ароматические углеводороды, дизельное топливо, отработанное машинное масло, мазут, сырую нефть, а также кислые гудроны. При росте на углеводородах в асептических условиях нуждается в факторах роста - биотине и тиамине. В качестве источника азота использует аммонийные формы азота. Нитратный азот усваивает значительно хуже.

Штамм непатогенный и нетоксичный. Культура хранится в пробирках на скошенном агаризованном сусле при температуре 4°С. Жизнеспособность штамма поддерживается регулярным пересевом (1 раз в 2 месяца) на агаризованную среду сусла-агара и на жидкую минеральную среду вышеописанного состава с н-парафинами в качестве единственного источника углерода и энергии.

Штамм микроорганизмов бактерий Rhodococcus sp. BKПM AC-1258 (вар.16-а).

Культурально-морфологические признаки.

Штамм микроорганизмов бактерий Rhodococcus sp. BKПM AC-1258 (вар.16-а) получен в результате автоселекции коллекционного штамма Rhodococcus sp. BKПM AC-1258, полученного из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ). Селекцию данного штамма вели в условиях длительной непрерывной ферментации на минеральной среде с жидкими н-парафинами в качестве единственного источника углерода и энергии при постепенном увеличении скорости протока от 0,05 до 0,2 час^-1. Ферментацию штамма вели на аппарате с рабочим объемом 1 л в асептических условиях. Минеральная среда имела следующий состав:

KNO₃ - 4,0 г/л, КН₂Р₄28×3Н₂О - 0,6 г/л, Na₂HPO₄×12Н₂О - 1,4 г/л, MgSO₄×7Н₂О - 0,8 г/л, при этом устанавливали рН среды 7,0.

Жидкие н-парафины были использованы в количестве 0,5-1,0 об.%. Расход воздуха при ферментации данного штамма в соответствующем устройстве составил 1 л на 1 л суспензии в мин, при этом скорость вращения мешалки данного устройства равнялась 1000 об/мин. Температура выращивания штамма составляла 30°С. Выделение и отбор данного штамма микроорганизмов бактерий вели на агаризованной среде (L-агаре). Штамм микроорганизмов бактерий Rhodococcus sp. ВКПМ AC-1258 (вар.16-а) отличается от родительского штамма более высокой скоростью роста на н-парафинах.

Физиолого-биохимические признаки

Штамм микроорганизмов бактерий Rhodococcus sp. BKПM AC-1258 (вар.16-а) образует на L-агаре колонии розоватого цвета, гладкие, блестящие с ровным краем, диаметром 3 мм (на 3-и сутки культивирования), при этом клетки имеют коротко-овальную форму размером 0,7-1,0×1,0-1,5 мкм. Данный штамм использует в качестве единственного источника углерода и энергии н-парафины, дизельное топливо, сырую нефть, ассимилирует легкие фракции нефти: газовый конденсат, керосин, бензин. В качестве источника азота штамм использует нитратный азот (NO₃ ^-). Данный штамм активно растет в широком диапазоне температур от 15°С до 34°С и рН окружающей среды 6,0-8,5.

Данный штамм непатогенный и нетоксичный, может храниться в пробирках на скошенной агаризованной среде (L-arape) при температуре 4°С. Жизнеспособность штамма поддерживается регулярным пересевом (1 раз в 2 месяца) на агаризованную среду L-arap и на жидкую минеральную среду вышеописанного состава с н-парафинами в качестве единственного источника углерода и энергии.

Каждую культуру консорциума штаммов микроорганизмов дрожжей Candida sp. ВСБ-616 и бактерий Rhodococcus sp. BKПM AC-1258 (вар.16-а) получают и хранят отдельно. Далее в зависимости от вида загрязнения и условий его применения (температура окружающей среды, рН окружающей среды и источник азота) из штаммов составляют консорциум в соотношении дрожжи:бактерии = (5-95):(95-5) соответственно.

Пример 1

В колбу заливают минеральную среду следующего состава: NaH₂PO₄×5Н₂О - 5,0 г/л, К₂НР₄×5Н₂О - 5,0 г/л, (NH₄)₂SO₄ - 3,0 г/л, KNO₃ - 2,0 г/л, MgSO₄×7Н₂О - 0,8 г/л. Устанавливают рН среды 3,5. В качестве единственного источника углерода добавляют нефть в количестве 1 об.%. Затем в колбу добавляют препарат - консорциум штаммов микроорганизмов дрожжей Candida sp. ВСБ-616 и бактерий Rhodococcus sp. BKIIM AC-125 (вар.16-а) в соотношении 95%: 5% соответственно. Общее количество вносимого биопрепарата составляет 0,1 г сухого вещества. Культивирование проводят в указанной выше колбе на круговой качалке при скорости ее вращения 220 об/мин и температуре 32-34°С. Содержание углеводородов в среде определяли методом газожидкостной хроматографии. Через 72 часа степень утилизации нефти в среде составила 95%.

Пример 2

В колбу заливают минеральную среду того же состава, что и в примере 1. Устанавливают рН среды 6,5. В качестве единственного источника углерода добавляют нефть в количестве 1 об.%. Затем в колбу добавляют препарат - консорциум штаммов микроорганизмов дрожжей Candida sp. ВСБ-616 и бактерий Rhodococcus sp. BKПM AC-1258 (вар.16-а) в соотношении 50%:50% соответственно. Общее количество вносимого биопрепарата составляет 0,1 г сухого вещества. Культивирование проводят в указанной выше колбе на круговой качалке при скорости ее вращения 220 об/мин и температуре 26-28°С. Через 72 часа степень утилизации нефти в среде составила 98%.

Пример 3.

В колбу заливают минеральную среду следующего состава: NaH₂PO₄×5Н₂О - 5,0 г/л, К₂НР₄×5Н₂О - 5,0 г/л, (NH₄)₂SO₄ - 2,0 г/л, KNO₃ - 3,0 г/л, MgSO₄×7H₂O - 0,8 г/л. Устанавливают рН среды 8,5. В качестве единственного источника углерода добавляют нефть в количестве 1 об.%. Затем в колбу добавляют препарат - консорциум штаммов микроорганизмов дрожжей Candida sp. ВСБ-616 и бактерий Rhodococcus вр. ВКПМ АС-1258 (вар.16-а) в соотношении 5%: 95% соответственно. Общее количество вносимого биопрепарата составляет 0,1 г сухого вещества. Культивирование проводят в указанной выше колбе на круговой качалке при скорости ее вращения 220 об/мин и температуре 16-18°С. Через 72 часа степень утилизации нефти в среде составила 93%.

Пример 4.

В кювету с землей, загрязненной нефтью (5%), вносили азот, фосфор и калий из расчета: (NH₄ ⁺+NO₃ ^-) - 200 мг/кг, P₂O₅ - 300 мг/кг, К₂О - 350 мг/кг. Площадь загрязнения составила 100 см², глубина загрязнения - 5 см. Влажность почвы поддерживалась периодическим орошением на уровне 60%. Аэрацию осуществляли путем периодического перемешивания почвы. Температура соответствовала температуре окружающей среды 18-22°С, рН почвенного раствора - 6,8.

В подготовленный образец почвы вносили препарат - консорциум штаммов микроорганизмов дрожжей Candida sp. ВСБ-616 и бактерий Rhodococcus sp. BKПM AC-1258 (вар.16-а) в соотношении 50%:50% соответственно. Общее количество вносимого биопрепарата составило 0,1 г сухого вещества. Степень утилизации нефти через 30 суток составила 96,5%. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что с помощью консорциума штаммов микроорганизмов дрожжей Candida sp. ВСБ-616 и бактерий Rhodococcus sp. BKПM AC-1258 (вар.16-а) может быть повышена эффективность очистки объектов окружающей среды, например воды и почвы, от углеводородов за счет расширения диапазона применения биопрепарата по значениям рН загрязненной окружающей среды, подлежащей очистке.

По данным гигиенической экспертизы НИИ Медицины труда РАМН ограничений для опытно-промышленного применения предлагаемого консорциума не выявлено.