01.03.2019
219.016.cb4e

СПОСОБ ОЦЕНКИ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Свернуть Развернуть
Краткое описание РИД Свернуть Развернуть
Аннотация: Изобретение относится к экспериментальной и клинической медицине, в частности к медицинской биофизике, клинической фармакологии, биохимии, онкологии и иммунологии. Для оценки антиоксидантной активности вводят исследуемый антиоксидант в биологический объект, индуцируют свободнорадикальное окисление и оценивают антиоксидантную активность по оптической плотности образцов при их фотометрировании. В качестве биологического объекта используют цельную кровь, взятую на цитрате или гепарине. Исследуемый антиоксидант вводят в полученную из цельной крови 5% суспензию эритроцитов, инкубируют, вносят 10 µл взвеси клотримазола в концентрации 1 мМ и индуцируют окисление, добавляя 20 µл раствора третбутиловой гидроперекиси в концентрации 100 мМ. Повторно инкубируют образцы, после чего их центрифугируют и измеряют оптическую плотность надосадков. Использование способа позволяет повысить точность и эффективность определения антиоксидантной активности различных природных и химических соединений и биологических жидкостей. 5 з.п. ф-лы, 2 ил.
Реферат Свернуть Развернуть

Изобретение относится к экспериментальной и клинической медицине, в частности к медицинской биофизике, клинической фармакологии, биохимии, онкологии и иммунологии, и может быть использовано для медико-биологических исследований с целью определения антиоксидантной активности различных природных и химических соединений, а также биологических жидкостей.

Как известно, механизмы действия активных форм кислорода (АФК) достаточно сложны, разнообразны и до настоящего времени не вполне изучены. Учитывая эффективность применения антиоксидантных препаратов при коррекции состояний, связанных с действием окислительного стресса, актуальной становится задача оценки антиоксидантной активности (АОА) такого рода препаратов.

На сегодняшний день для оценки АОА отдельных соединений, их смесей или полной антиоксидантной активности биологических объектов разработано множество методов. Эти методы различаются по типу окислителя и окисляемого соединения (мишени), а также по способу измерения окисленного продукта. Они дают широкий спектр результатов, которые не имеют абсолютного значения, и должны интерпретироваться с учетом результатов, полученных другими методами. К такому выводу приходят авторы многочисленных публикаций, как отечественных, так и зарубежных. В частности, различные способы тестирования приведены в обзоре «Способы тестирования антиоксидантной активности» (Michael Antolovich et al., Журнал Королевского общества химиков ANALYST, август 2002, с.183-198).

В качестве прототипа нами рассмотрен способ оценки антиоксидантной активности образца (US 7132296, 2006), в котором описан способ определения показателя ORAC (oxygen radical absorbance capacity), который на сегодняшний день является стандартным показателем АОА в ряде стран, например США. Способ заключается в том, что антиоксидантную активность оценивают, вводя исследуемый антиоксидант в смесь натриевой соли флуоресцеина (F1) и 2,2'-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (ААРН). При температуре инкубации 37°С проводят измерение интенсивности флуоресценции смеси. Интенсивность снижается по мере окисления F1 пероксильными радикалами, образующимися при термической деградации ААРН. Присутствие антиоксидантов приводит к увеличению периода времени до момента начала снижения интенсивности флуоресценции. Способ требует наличия достаточно сложного оборудования и затратен в отношении используемых реактивов. Кроме того, условия проведения такого рода анализов далеки от физиологических.

Технический результат предлагаемого изобретения направлен на устранение перечисленных недостатков и заключается в физиологичности условий измерения, удобстве использования и минимальном расходовании реактивов.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что в методе оценки антиоксидантной активности путем введения исследуемого антиоксиданта в биологический объект, индукции свободнорадикального окисления и оценки антиоксидантной активности по оптической плотности образцов при их фотометрировании в качестве биологического объекта используют цельную кровь, взятую на цитрате или гепарине, преинкубируют полученную из цельной крови 5% суспензию эритроцитов с исследуемым антиоксидантом, добавляют взвесь клотримазола (конечная концентрация 10 µМ), после чего индуцируют окисление, внося раствор третбутиловой гидроперекиси (t-BHP) в конечной концентрации 2 мМ и инкубируют образцы, после чего образцы центрифугируют и измеряют оптическую плотность надосадков.

При этом инкубацию проводят в течение 3 часов при температуре 37°С.

Предпочтительно, чтобы оптическую плотность образцов измеряли на длине волны 490-540 нм.

Предпочтительно введение исследуемого антиоксиданта в суспензию эритроцитов в разных концентрациях, при этом инкубируют образцы 20 мин. После чего по оптической плотности образцов измеряют степень гемолиза, строят ее зависимость от концентрации исследуемого антиоксиданта и в качестве показателя антиоксидантной активности используют концентрацию антиоксиданта, приводящую к 50% снижению степени гемолиза.

Также в качестве показателя антиоксидантной активности может быть использовано отношение концентраций исследуемого антиоксиданта и стандартного антиоксиданта тролокса.

Ранее были предложены методы оценки АОА, в которых использовали эритроциты, подвергнутые действию азоинициаторов (ААРН или AMVN) как источников пероксильных радикалов (Kitagawa S, Sakamoto Н, Tano Н. Inhibitory effects of flavonoids on free radical-induced hemolysis and their oxidative effects on hemoglobin // Chem Pharm Bull (Tokyo). - 2004. - V.52, №8. - Pp.999-1001; Dai F, Miao Q, Zhou B, Yang L, Liu ZL. Protective effects of flavonols and their glycosides against free radical-induced oxidative hemolysis of red blood cells // Life Sci. - 2006. - V.78, №21. - Pp.2488-493; Abella A, Messaoudi C, Laurent D, Marot D, Chalas J, Breux J, Claise C, Lindenbaum A. A method for simultaneous determination of plasma and erythrocyte antioxidant status. Evaluation of the antioxidant activity of vitamin E in healthy volunteers // Br J Clin Pharmacol. - 1996. - V.42, №6. - Pp.737-741 и др.).

Показано, что присутствие азоинициаторов не вызывает внутриклеточного окисления гемоглобина и, соответственно, последующего высвобождения гемина (Lenfant F, Bureau A, Lahet JJ, Bouyer F, Chaillot B, Freysz M. Effects of an oxidative stress on human hemoglobin: a multiwavelength visible spectrometry study.// Biomed Pharmacother.- 2005.- V.59, №5, Pp.230-232).

Между тем окисление гемоглобина и последующая его деградация достаточно часто встречаются в условиях in vivo как в физиологических (старение эритроцитов), так и в патологических (малярия, ишемия - реперфузия, серповидно-клеточная анемия и др.) условиях. Таким образом, эритроциты, модифицированные окислителями, вызывающими образование метгемоглобина, в том числе третбутиловой гидроперекисью (t-BHP), представляются более адекватной и биологически значимой клеточной моделью для оценки антиоксидантной активности по сравнению с существующими моделями, основанными на использовании азо-соединений как экзогенных источников свободных радикалов.

Было показано, что клотримазол образует с экзогенным гемом (гемином) комплекс, обладающий значительно большим литическим эффектом, чем свободный гем (Huy NT, Kamei К, Yamamoto Т, Kondo Y, Kanaori К, Takano R, Tajima К, Hara S. Clotrimazole binds to heme and enhances heme-dependent hemolysis: proposed antimalarial mechanism of clotrimazole // J Biol Chem. - 2002. -V.277, №6, Pp.4152-4158).

В ходе нашей работы впервые было показано, что клотримазол в концентрации 10 µМ существенно усиливает как набухание, так и гемолиз эритроцитов под действием t-BHP, что свидетельствует о значительном усилении повреждения мембраны в присутствии этого соединения. Очевидно, что индуцированный перекисью гемолиз является, во всяком случае, частично, результатом литического эффекта гемина, высвобождаемого из гемихрома, образующегося в клетке при окислении гемоглобина. Степень гемолиза существенно возрастает, если в суспензию добавляется клотримазол, который образует с гемином комплекс, обладающий большей по сравнению со свободным гемином литической активностью.

Таким образом, можно рассматривать клотримазол как агент, усиливающий окислительный гемолиз эритроцитов под действием t-BHP.

Известно, что антиоксиданты снижают степень индуцированного гемином и t-BHP повреждения мембраны и последующего гемолиза.

Ингибирующее действие антиоксидантов, осуществляемое на начальных стадиях процесса, в дальнейшем подвергается усилению в присутствии клотримазола, что, вероятно, объясняет исключительно высокую чувствительность предлагаемой клеточной модели к действию различных антиоксидантов.

На фиг.1 приведена схема проведения способа оценки АОА.

На фиг.2 приведена зависимость степени гемолиза, индуцированного t-ВНР в присутствии клотримазола, от концентрации антиоксидантов.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Цельную кровь, взятую на цитрате или гепарине, отмывают физиологическим раствором (фиг.1) и ресуспендируют отмытые эритроциты в HEPES-буфере, содержащем в мМ 10 HEPES, 5 KCL, 0.8 MgSO4, 1.5 CaCl2, 5 глюкозы при рН 7,4, при гематокрите 5%.

70% водный раствор t-BHP разбавляют физиологическим раствором до концентрации 100 мМ.

Спиртовой раствор клотримазола 100 мМ хранят в холодильнике 1-2 месяца и непосредственно перед использованием разбавляют его физиологическим раствором до концентрации 1 мМ.

К 1 мл 5% суспензии эритроцитов добавляют исследуемый антиоксидант в разных концентрациях, преинкубируют 20 мин, после чего вносят 10 µл взвеси клотримазола, конечная концентрация клотримазола 10 µМ, после чего сразу вносят 20 µл 100 мМ раствора третбутиловой гидроперекиси (t-BHP), конечная концентрация 2 мМ.

Подготовленные образцы инкубируют 3 часа в термостате при температуре 37°С и непрерывном перемешивании. Затем образцы центрифугируют на центрифуге Eppendorf при 7000 об/мин в течение 5 мин.

По 100 мкл надосадка вносят в плоскодонные лунки планшета, содержащего по 200 мкл раствора Драбкина.

После чего измеряют степень гемолиза по оптической плотности образцов при λ=490 нм на планшетном спектрофотометрическом ридере (спектрофотометр) и строят кривые зависимости степени гемолиза от концентрации исследуемого антиоксиданта. АОА выражают как концентрацию антиоксиданта, соответствующую 50% ингибированию гемолиза (IC50). В качестве относительного показателя антиоксидантной активности используют отношение концентраций исследуемого антиоксиданта и стандартного антиоксиданта тролокса (IC50/IСтролокс50).

На фиг.2 представлена зависимость степени гемолиза, выраженной в % к максимальному (т.е. к гемолизу, наблюдаемому без присутствия антиоксидантов). Суспензию эритроцитов преинкубировали в течение 10 мин с разными концентрациями антиоксидантов, затем добавляли клотримазол, 10 µМ и третбутиловую гидроперекись, 2 mМ и инкубировали в течение 3 ч, n=5-20.

В качестве показателя АОА используется концентрация антиоксиданта, приводящая к 50% снижению степени гемолиза. Антиоксидантную активность также можно выразить как отношение концентраций исследуемого антиоксиданта и стандартного антиоксиданта тролокса.

С помощью предлагаемого способа можно определять АОА различных соединений как гидрофильных, так и гидрофобных. Мы изучали действие известных флавоноидов, а также некоторых антибиотиков тетрациклинового ряда, антиоксидантное действие которых в последние годы является предметом изучения разных групп исследователей.

Предложенный способ является высокочувствительным, прост и удобен в использовании, требует минимального количества цельной крови (~ 100 µл) и используемых реактивов.

Кроме того, способ дает возможность одновременного скрининга целого ряда соединений с предлагаемыми антиоксидантными свойствами.

Также предложенный способ целесообразно использовать в клинике, так как степень гемолиза эритроцитов под действием третбутиловой гидроперекиси у здоровых доноров может отличаться от больных, страдающих некоторыми заболеваниями, связанными с активацией свободнорадикальных процессов в организме. Таким образом, степень гемолиза эритроцитов, обработанных третбутиловой гидроперекисью, оказывается диагностически или прогностически значимым критерием или способом оценки эффективности лекарственной терапии.

Источник поступления информации: Роспатент

Показаны записи 1-10 из 13.
20.11.2013
№216.012.8165

Раствор стабилизированного дигидрокверцетина

Изобретение относится к раствору стабилизированного дигидрокверцетина, который включает дигидрокверцетин в количестве 0,1-30,0 мас.%, 2-гидроксипропил-бета-циклодекстрин в количестве 0,01-25,0 мас.%, пропиленгликоль и/или глицерин, и/или ПЭГ 400 в количестве 1,0-70,0 мас.%, пищевые органические...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002498801
Дата охранного документа: 20.11.2013
01.03.2019
№219.016.cc12

Средство, обладающее гипогликемической активностью

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии, к гипогликемическим средствам, влияющим на содержание глюкозы в крови при лечении заболеваний, связанных с нарушениями обменных процессов, таких как сахарный диабет. Средство, обладающее гипогликемической активностью, характеризующееся...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002385717
Дата охранного документа: 10.04.2010
11.03.2019
№219.016.d95c

Способ получения комплекса, обладающего общеукрепляющим действием

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к способу получения комплекса биологически активных веществ из растительного сырья, содержащего биологически активные вещества (БАВ), из низкомасличного растительного сырья, преимущественно из зародышей пшеницы. Способ...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002353381
Дата охранного документа: 27.04.2009
10.04.2019
№219.017.061b

Композиция для ухода за полостью рта и профилактики заболеваний зубов и мягких тканей полости рта и средство для ухода за полостью рта

Настоящая группа изобретений относится к созданию лечебно-профилактических и гигиенических средств обработки зубов, десен и языка. Предлагается композиция для ухода за полостью рта, представляющая собой суспензию, содержащую порошок политетрафторэтилена с размерами частиц в диапазоне от 0,1 до...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002413500
Дата охранного документа: 10.03.2011
10.04.2019
№219.017.0818

Средство для лечебно-профилактической и гигиенической обработки зубов, десен и языка

Изобретение относится к области создания средств ухода за полостью рта. Средство для лечебно-профилактической и гигиенической обработки зубов, десен и языка содержит низкоабразивный материал на основе порошка политетрафторэтилена (ПТФЭ) с размерами частиц порошка ПТФЭ от 0,1 до 500 микрон,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002400211
Дата охранного документа: 27.09.2010
10.04.2019
№219.017.081f

Средство для контроля уровня гликемии и профилактики сосудистых осложнений у больных с нарушениями углеводного обмена и сахарным диабетом типа 2

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к созданию средства для контроля уровня гликемии и профилактики сосудистых осложнений у больных с нарушениями углеводного обмена и сахарным диабетом типа 2. В качестве данного средства применяют БАД к пище «Блокатор...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002400245
Дата охранного документа: 27.09.2010
19.04.2019
№219.017.326a

Средство для профилактики гриппа и острых респираторных заболеваний

Изобретение относится к медицине и фармацевтике, а именно к созданию средства для профилактики гриппа и острых респираторных заболеваний. Средство содержит смесь дигидрокверцетина, арабиногалактана и аскорбиновой кислоты, взятых при массовом соотношении 1:(16-18):1 соответственно. Средство...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002401117
Дата охранного документа: 10.10.2010
29.04.2019
№219.017.42a5

Способ выделения биологически активных изомеров дигидрокверцетина

Изобретение относится к области химико-фармацевтической промышленности. Измельченную древесину лиственницы экстрагируют спиртом этиловым 90-95% при температуре 55-66°С в течение 1-2 часов, фильтруют экстракт, добавляют пропиленгликоль, упаривают смесь, полученный остаток обрабатывают 5%...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002308267
Дата охранного документа: 20.10.2007
29.04.2019
№219.017.42ca

Антиоксидантный и антигипоксантный комплекс на основе дигидрокверцетина для косметических изделий

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к созданию биологически активных комплексов на основе природного сырья, которое может найти применение в составе косметических изделий, используемых в косметической промышленности и лечебно-профилактической медицине....
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002367409
Дата охранного документа: 20.09.2009
29.04.2019
№219.017.43b4

Композиция с повышенной фармакологической активностью на основе дигидрокверцетина и растительных полисахаридов (варианты)

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности производства лекарственных средств и позволяет создать лекарственные средства с улучшенными фармакологическими и токсикологическими характеристиками, а также снизить их себестоимость. Предложены две водорастворимые лекарственные...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002421215
Дата охранного документа: 20.06.2011
Показаны записи 1-10 из 27.
10.06.2014
№216.012.ccfc

Способ определения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе, устройство для реализации указанного способа и способ диагностики нарушений системы гемостаза по изменению пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе

Настоящее изобретение относится к области биофизики. Предложены способы определения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе, в соответствии с которыми обеспечивают систему in vitro, которая содержит образец плазмы крови, цельной...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002518247
Дата охранного документа: 10.06.2014
27.06.2014
№216.012.d73a

Способ ликвидации пожара в галерейном помещении

Изобретение относится к способу ликвидации пожара в галерейном помещении, включает регистрацию возгорания датчиками, обработку этих сигналов, подачу командного сигнала на исполнительный орган с последующим инициированием и подачей огнетушащей жидкости в помещение с созданием поперечных и...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002520876
Дата охранного документа: 27.06.2014
10.07.2015
№216.013.5fff

Высокоселективный ингибитор контактной активации на основе инфестина 4

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, конкретно к получению мутантов инфестина 4, и может быть использовано для диагностических целей при определении характеристик свертывания крови и ее компонентов. Полипептид характеризуется последовательностью мутанта инфестина 4 MutB SEQ ID NO:...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002556116
Дата охранного документа: 10.07.2015
10.10.2015
№216.013.81b6

Лигатура для стали

Изобретение относится к области металлургии, в частности к производству жаростойких нейтронопоглощающих сталей, применяемых в атомной энергетике. Лигатура содержит, % мас.: гадолиний 41-74, алюминий 14,0-25,4, кремний 0,6-20, железо остальное. Изобретение позволяет уменьшить в стали...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002564803
Дата охранного документа: 10.10.2015
13.01.2017
№217.015.6e77

Способ оценки динамики и полноты ретракции (контракции) кровяного сгустка

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии. Производят взятие пробы крови пациента в содержащие цитрат натрия емкости, берут двухканальную измерительную кювету, внутреннюю поверхность кюветы ополаскивают детергентом - раствором Тритона X-100 на хлориде натрия. Затем удаляют остатки...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002596926
Дата охранного документа: 10.09.2016
24.07.2018
№218.016.73e2

Способ получения отливок из высокомарганцевой стали

Изобретение может быть использовано при получении отливок из высокомарганцевых маломагнитных сталей в металлических формах. На рабочую поверхность металлической формы наносят облицовочное защитное покрытие, заливают в литейную форму расплав высокомарганцевой стали с последующим его охлаждением....
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002661986
Дата охранного документа: 23.07.2018
01.03.2019
№219.016.cb01

Способ профилактики острых респираторных инфекций у детей с аллергическими заболеваниями респираторного тракта

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и касается профилактики острых респираторных инфекций у детей дошкольного возраста с аллергическими заболеваниями респираторного тракта. Для этого вводят арбидол в дозе 50 мг 2 раза в неделю в сочетании с селен-активом в дозе 25 мкг по...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002340340
Дата охранного документа: 10.12.2008
01.03.2019
№219.016.cc12

Средство, обладающее гипогликемической активностью

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии, к гипогликемическим средствам, влияющим на содержание глюкозы в крови при лечении заболеваний, связанных с нарушениями обменных процессов, таких как сахарный диабет. Средство, обладающее гипогликемической активностью, характеризующееся...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002385717
Дата охранного документа: 10.04.2010
11.03.2019
№219.016.d95c

Способ получения комплекса, обладающего общеукрепляющим действием

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к способу получения комплекса биологически активных веществ из растительного сырья, содержащего биологически активные вещества (БАВ), из низкомасличного растительного сырья, преимущественно из зародышей пшеницы. Способ...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002353381
Дата охранного документа: 27.04.2009
11.03.2019
№219.016.dcbd

Способ лечения бронхопневмонии незаразной этиологии у телят в раннем постнатальном онтогенезе

Изобретение относится к области ветеринарной медицины. Способ заключается в том, что телятам назначают биологически активную добавку «Бронходиол» в дозе 3 капсулы 2-3 раза в сутки, в течение 7-9 дней. Способ позволяет повысить эффективность лечения бронхопневмонии, не вызывает аллергических...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002432940
Дата охранного документа: 10.11.2011

Похожие РИД в системе

+ добавить свой РИД