Способ оценки вазомоторной дисфункции эндотелия

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной патофизиологии и хирургии, и может быть использовано для диагностики вазомоторной дисфункции эндотелия. Эндотелиальная дисфункция, характеризующаяся нарушением структуры и функции эндотелиоцитов, является начальным этапом развития многих патологических процессов, а в ряде случаев, выступает ключевым фактором патогенеза. Поскольку эндотелий участвует в регуляции сосудистого тонуса, реализации про- и антикоагулянтных, иммунных, метаболических и других реакций организма, в узком смысле под дисфункцией эндотелия понимают, прежде всего, дисбаланс продукции вазоконстрикторов и вазодилятаторов. Данный дисбаланс проявляется преобладанием вазоконстрикторных реакций на фоне дефицита NO, простагландинов и других вазодилятаторов, и в литературе его обозначают термином "вазомоторная дисфункция эндотелия" (ВДЭ).

Известны способы функциональной диагностики ВДЭ, к которым относятся: изучение потокопосредованной вазодилятации с помощью ультразвукового исследования сосудов [1-3], оценка параметров пульсовой волны и периферического артериального тонуса при реактивной гиперемии методом плетизмографии [4] и сфигмографии при одновременной регистрации электрокардиограммы [5, 6], анализ микроциркуляции различными видами лазерной допплеровской флоуметрии [7].

Основным недостатком функциональных способов оценки ВДЭ является косвенный характер выявляемых изменений вазорективности, что существенно нивелирует их диагностическую ценность, и связано с наличием не только сосудистого компонента, обусловленного работой эндотелиального релаксирующего механизма, но и кардиального компонента, определяющегося силовыми и скоростными показателями сократительной функции миокарда и частотой сердечных сокращений, а также вегетативного компонента, проявляющегося в виде индивидуального баланса симпатических и парасимпатических влияний на сосудистый тонус. Кроме того, адекватная интерпретация результатов функциональных методов невозможна при наличии стенозирующих просвет артерии атеросклеротических бляшек проксимальнее точки исследования. Важно отметить, что проведение функциональной оценки ВДЭ требует наличия дорогостоящего ультразвукового оборудования экспертного класса, данные методы являются операторзависимыми и определяются квалификацией специалиста, проводящего исследование.

Биохимические методы оценки ВДЭ основаны на определении концентрации метаболитов цикла оксида азота - нитритов и нитратов. Однако трактовка результатов определения содержания нитритов в крови не может однозначно свидетельствовать о развитии ВДЭ, что обусловлено повышенной экспрессией индуцибельной NO-синтазы на фоне угнетения активности эндотелиальной изоформы фермента при ряде заболеваний [8]. Необходимость проведения сложных реакций для анализа уровня вазоактивных метаболитов определяют значительное неудобство использования биохимических методов для оценки ВДЭ [9].

Таким образом, существующие в настоящее время методы диагностики ВДЭ являются косвенными, поиск более объективных методов оценки вазореактивных свойств эндотелия продолжается.

Задачей изобретения является разработка способа непосредственной количественной оценки ВДЭ вне зависимости от нейро-гуморальных влияний организма.

Поставленная задача решена в экспериментах на белых беспородных крысах-самцах. Под ингаляционным эфирным наркозом после левосторонней торакотомии удаляют грудной отдел аорты, формируя из нее сегменты длиной 2 см, помещают их в охлажденный до 2-4°С раствор Кребса-Хензелайта. Состав раствора Кребса-Хензелайта был следующим (в ммоль/л): NaCl - 120; KCl - 4,8; MgSO₄ - 2,5; CaCl₂ - 2,5; KH₂PO₄ - 1,2; NaHCO₃ - 25,0; глюкоза - 5,5. Далее изолированный сосуд канюлируют катетером 20 G, помещают в установку для перфузии, сохраняя длину равную in vivo, осуществляют антеградную перфузию сосуда раствором Кребса-Хензелайта, насыщенным карбогеном (95% О₂ + 5% СО₂), в режиме постоянного давления 100 мм рт.ст. при температуре 37°С, поддерживаемой ультратермостатом VT-8 (ООО "Термекс-2", Россия), и рН=7,33-7,36. Схема установки для изолированного сосуда представлена на фиг. 1, где: 1 и 2 - емкости с перфузионными растворами; 3 и 4 - термостатируемые оксигенаторы; 5 - термостатируемая камера с изолированным сосудом; 6 - баллон с карбогеном; 7 - градуированная емкость для оценки объемной скорости перфузии.

Через 30 минут нормоксической перфузии, необходимой для стабилизации тонуса изолированного сосуда, вводят в перфузат норадреналин в концентрации 10^-6 М, регистрируют объемную скорость перфузии в течение 1 минуты с использованием градуированной емкости для сбора перфузата и секундомера. С целью исследования вазомоторной дисфункции эндотелия вводят в перфузат ацетилхолин в концентрации 10^-5 М, регистрируют объемную скорость перфузии в течение 1 минуты.

Выраженность вазомоторной дисфункции оценивают по величине степени вазодилятации предсокращенного сегмента сосуда, рассчитывая ее по предложенной нами формуле:

где Q_AX - объемная скорость перфузии после введения ацетилхолина,

Q_HA - объемная скорость перфузии после введения норадреналина.

При значении степени вазодилятации равной или большей 1,6 оценивают вазомоторную функцию эндотелия как нормальную; при значении равном или большем 0,8 и до 1,6 диагностируют умеренно выраженную ВДЭ; при значении равном или большем 0 и до 0,8 диагностируют выраженную ВДЭ; при отрицательных значениях диагностируют крайнюю степень выраженности ВДЭ и эффект парадоксального вазоспазма в ответ на введение ацетилхолина в перфузат.

Новым в предлагаемом изобретении является проведение исследований на изолированном из организма сосуде (аорте), применение специальной установки для перфузии изолированного сосуда, использование для количественной оценки выраженности ВДЭ величины степени вазодилятации, рассчитываемой по предложенной нами формуле.

Техническим результатом данного изобретения является улучшение диагностики ВДЭ вне регуляторных влияний целостного организма для последующей разработки селективных способов ее коррекции.

Отличительные признаки изобретения проявили в заявляемом способе оценки ВДЭ новые свойства, которые явным образом не вытекают из уровня техники в данной области и неочевидны для специалистов. В проанализированной патентной и научной медицинской литературе не было обнаружено идентичной совокупности признаков изобретения. Предлагаемый в качестве изобретения способ может быть использован в экспериментальной медицине для оптимизации исследования ВДЭ при различной патологии. Исходя из вышеизложенного, следует считать данное техническое решение соответствующим таким условиям патентоспособности, как "новизна", "изобретательский уровень", "промышленная применимость".

Способ осуществляется следующим образом: в эксперименте под наркозом производят торакотомию слева, удаляют грудной отдел аорты, формируют из нее сегменты длиной 2 см, помещают их в охлажденный до 2-4°С раствор Кребса-Хензелайта. Состав раствора Кребса-Хензелайта был следующим (в ммоль/л): NaCl - 120; KCl - 4,8; MgSO₄ - 2,5; CaCl₂ - 2,5; KH₂PO₄ - 1,2; NaHCO₃ - 25,0; глюкоза - 5,5. Далее изолированный сосуд канюлируют катетером 20 G, помещают в установку для перфузии, сохраняя длину равную in vivo, осуществляют антеградную перфузию сосуда раствором Кребса-Хензелайта, насыщенным карбогеном (95% O₂ + 5% CO₂), в режиме постоянного давления 100 мм рт.ст. при температуре 37°С, поддерживаемой ультратермостатом VT-8 (ООО "Термекс-2", Россия), и рН=7,33-7,36.

Через 30 минут нормоксической перфузии, необходимой для стабилизации тонуса изолированного сосуда, вводят в перфузат норадреналин в концентрации 10^-6 М, регистрируют объемную скорость перфузии в течение 1 минуты с помощью градуированной емкости для сбора перфузата и секундомера. С целью исследования вазомоторной дисфункции эндотелия вводят в перфузат ацетилхолин в концентрации 10^-5 М, регистрируют объемную скорость перфузии в течение 1 минуты. Выраженность вазомоторной дисфункции оценивают по величине степени вазодилятации предсокращенного сегмента сосуда, рассчитывая ее по предложенной нами формуле (1).

Пример конкретного выполнения.

Нами была выявлено развитие вазомоторной дисфункции эндотелия изолированной аорты у 70 беспородных белых крыс-самцов после проведения субтотальной атипичной 80%-ной резекции печени в сроке 1, 3, 6, 12 часов и 1, 3, 7 суток после операции (в каждой исследовательской точке n=10) в сравнении с интактными крысами контрольной группы, (n=10) [10].

Под наркозом проводили торакотомию слева, удаляли грудной отдел аорты, формировали из нее сегменты длиной 2 см, помещали их в охлажденный до 2-4°С раствор Кребса-Хензелайта. Состав раствора Кребса-Хензелайта был следующим (в ммоль/л): NaCl - 120; KCl - 4,8; MgSO₄ - 2,5; CaCl₂ - 2,5; KH₂PO₄ - 1,2; NaHCO₃ - 25,0; глюкоза - 5,5. Далее изолированный сосуд канюлировали катетером 20 G, помещали в установку для перфузии, сохраняя длину равную in vivo, осуществляли антеградную перфузию сосуда раствором Кребса-Хензелайта, насыщенным карбогеном (95% O₂ + 5% CO₂), в режиме постоянного давления 100 мм рт.ст. при температуре 37°С, поддерживаемой ультратермостатом VT-8 (ООО "Термекс-2", Россия), и рН=7,33-7,36.

Через 30 минут нормоксической перфузии, необходимой для стабилизации тонуса изолированного сосуда, вводили в перфузат норадреналин в концентрации 10^-6 М, регистрировали объемную скорость перфузии в течение 1 минуты с помощью градуированной емкости для сбора перфузата и секундомера (Q_HA, мл/мин). С целью исследования вазомоторной дисфункции эндотелия вводили в перфузат ацетилхолин в концентрации 10^-5 М, регистрировали объемную скорость перфузии в течение 1 минуты (Q_AX, мл/мин). Количественную оценку выраженности ВДЭ проводили по степени вазодилятации по формуле:

где Q_AX - объемная скорость перфузии после введения ацетилхолина,

Q_HA - объемная скорость перфузии после введения норадреналина.

Статистическую обработку результатов исследования выполняли с использованием пакета прикладных программ «STATISTICA 6.0». Результаты представлены в виде медианы (Me) с нижним (LQ) и верхним (HQ) квартилями. Определение значимости различий проведено с помощью критерия Манна-Уитни. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05.

Результаты исследования представлены в таблице 1.

Примечание: * - достоверность различий по сравнению с контролем

^{^} - достоверность различий по сравнению с предыдущим сроком.

При значении степени вазодилятации равной или большей 1,6 оценивали ВДЭ как нормальную; при значении равном или большем 0,8 и до 1,6 диагностировали умеренно выраженную ВДЭ; при значении равном или большем 0 и до 0,8 диагностировали выраженную ВДЭ; при отрицательных значениях диагностировали крайнюю степень выраженности ВДЭ и эффект парадоксального вазоспазма в ответ на введение ацетилхолина в перфузат.

Таким образом, в ходе проведенного исследования было установлено, что через 3 часа после субтотальной резекции печени у крыс регистрировалась умеренно выраженная ВДЭ изолированного сосуда (значение степени вазодилятации находилось в пределах от 0,8 до 1,6), в сроках от 6 часов до 3 суток послеоперационного периода диагностирована выраженная ВДЭ (значение степени вазодилятации находилось в пределах от 0 до 0,8), на 7-е сутки после операции показатели вазореактивности достоверно не отличались от контрольных значений, т.е. первоначальное угнетение вазореактивности сменялось постепенным восстановлением способности изолированного сосуда к эндотелий-зависимой вазодилятации.