Способ прогнозирования неблагоприятного течения новообразований слизистой оболочки полости рта

Изобретение относится к области медицины, а именно к онкостоматологии и лабораторной диагностике, и может быть использовано для прогнозирования неблагоприятного течения новообразований слизистой оболочки полости рта (СОПР), ассоциированных с вирусами, обладающими онкогенным потенциалом. Определение степени риска возникновения новообразований СОПР необходимо для разработки коррекционных мероприятий, направленных на факторы риска, в частности, на элиминацию вирусов, ассоциации которых снижают стабильность генетического аппарата клетки и приводят к опухолевой прогрессии.

Ежегодно в России выявляется 450 тысяч новых случаев рака. По данным ВОНЦ, число лиц с впервые установленным диагнозом рака в России за 20 лет увеличилось более чем на 40%. В структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями рак полости рта занимает 6 место в мире. В среднем по России этот показатель, составляет 6,2% в расчете на 100 тысяч населения, тогда как для Тверского региона он равен 10,6%). Показатели запущенности при раке полости рта по России составляют 63,4%, тогда как в Тверской области этот показатель еще выше и составляет 71,9%. Одним из приоритетных стратегических мероприятий по реформированию здравоохранения РФ является реализация национальной онкологической программы (2012-2020) [2, 4, 5].

Изучение пусковых факторов онкогенеза является ключевым моментом для понимания природы и неблагоприятного течения опухолей. Онкогенез (канцерогенез) - сложный многоэтапный процесс, ведущий к глубокой опухолевой реорганизации нормальных клеток организма. На протяжении последних двух столетий, исследователями был предложен ряд теорий канцерогенеза, каждая из которых освещает мультифакториальную природу этого феномена [10, 12, 18, 20, 23, 26].

Канцерогенез в области головы и шеи, так же, как и в области других локализаций, - это сложный многоэтапный процесс и роль инфекционных агентов в его прогрессии изучена не полностью. Главной проблемой подобных исследований является то, что роль многих инфекционных агентов недооценивается в связи с недостатком или противоречивостью информации. За последние десятилетия получено множество новых данных о значении ряда вирусов в развитии опухолей различной локализации: вируса папилломы человека высокого канцерогенного риска (ВПЧ ВКР) в развитии рака шейки матки и рака кожи гениталий; вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ) в этиологии африканской лимфомы Беркитта и назофарингеальной карциномы [1, 3, 5, 6, 8, 13-15, 17, 19, 21, 24].

Несмотря на достаточно хорошую информированность о значении химических, вирусных и эпигенетических факторов в канцерогенезе полости рта, все еще сохраняется много вопросов. Факторы риска и причинные факторы, которые являются триггерами и запускают процесс канцерогенеза в полости рта, молекулярные механизмы, объясняющие опухолевую прогрессию и метастазирование рака, изучены далеко не полностью. Изучение этих механизмов может внести вклад в понимание молекулярных основ канцерогенеза и прогрессирования опухолей полости рта и открыть новые терапевтические и исследовательские перспективы [7, 9, 11, 16, 22, 25].

В настоящее время описаны способы прогнозирования течения имеющегося у пациента опухолевого процесса некоторых анатомических локализаций, способы прогнозирования метастазирования опухоли после ее хирургического или других видов лечения.

Известен «Способ прогнозирования течения опухолевого процесса в головном мозге» (патент РФ №2635628), включающий получение парафинового блока из биоптата опухоли, полученный парафиновый блок микротомируют, полученный срез окрашивают, сканируют и сопоставляют его с парафиновым блоком, из которого затем выделяют опухолевую ткань, после чего ее депарафинизируют, гидротируют, ферментативно разрушают ют в ней оболочку клеток до получения суспензии клеточных ядер, суспензию окрашивают флюоресцентным красителем и проводят ДНК цитометрию. Если количество анеуплоидных ядер в полученной суспензии меньше или равно 21%, прогнозируют благоприятное течение опухолевого процесса, выше 21% - неблагоприятное. Недостатками метода является трудоемкость, необходимость специального оборудования, инвазивность (получения биоптата), временная и экономическая затратность.

Известен «Способ оценки и прогнозирования факторов риска злокачественных новообразований гортани» (патент РФ №2246894), включающий медико-генетическое обследование пациента и дополнительное исследование ряда факторов, включая возраст, длительность курения, стаж работы в условиях профессиональной вредности, регулярность употребления алкоголя, экологические факторы, срок проживания в загрязненном районе. Данные показатели оцениваются в баллах, затем вычисляют коэффициент прогнозирования по разработанной формуле. Недостатком представленного метода является его трудоемкость, временная и экономическая затратность при прогнозировании факторов риска только злокачественных новообразований гортани. Способ требует проведения объемных диагностических процедур, параметры полученных данных нуждаются в соответствующих измерениях и стандартизованной оценке, что ограничивает применение способа в практической медицине.

Известен «Способ прогнозирования рака шейки матки при доброкачественных и предраковых процессах шейки матки у женщин репродуктивного возраста» (патент РФ №2466392), включающий в себя определение клинических факторов риска развития рака шейки матки, в том числе наличия ВПЧ ВКР, а также метилирования генов MLH1, HIC1, RASSF1A, MGMT, N33, CDH1 в биоптате шейки матки и расчет коэффициента вероятности развития рака шейки матки р. При величине р>0,6 прогнозируют высокую вероятность риска развития рака шейки матки, при р=0,3-0,59, прогнозируют умеренную вероятность риска развития рака шейки матки, при р<0,29 прогнозируют низкую вероятность риска развития рака шейки матки. Недостатками способа являются другая локализация процесса, низкая доступность и высокая стоимость определения метилирования генов MLH1, HIC1, RASSF1A, MGMT, N33, CDH1, необходимость выполнять для этого инвазивное вмешательство (биопсию шейки матки).

Наиболее близким к заявленному авторами способу является «Способ прогнозирования риска развития новообразований слизистой оболочки полости рта у лиц старше 40 лет» (патент РФ №2611343). Способ заключается в том, что проводят молекулярно-генетическое исследование ротовой жидкости и оценивают степень риска развития новообразований в совокупности с длительным стажем курения; у лиц, имеющих только один из факторов риска - один вирус с онкогенным потенциалом или длительный стаж курения определяют низкую степень риска, среднюю степень - при наличии одного вируса у курящего человека или двух вирусов у некурящего, высокую степень -наличие ассоциации двух вирусов и курения, либо трех и более вирусов, независимо от стажа курения, а также при выявлении дезоксирибонуклеино-вой кислоты (ДНК) ВПЧ ВКР.

Недостатками прототипа являются, во-первых, то, что в данном способе ограничен возрастной контингент, это лица старше 40 лет, тогда как наблюдается развитие новообразований СОПР и в более молодом возрасте. Во-вторых, указанный способ, являясь, в целом, удачным подходом, ограничен прогнозированием риска возникновения новообразований данной локализации и не может быть использован для прогнозирования неблагоприятного течения уже имеющегося опухолевого процесса. В-третьих, риск развития новообразований сопряжен с определением в ротовой жидкости вирусов, обладающих онкогенным потенциалом и наличием длительного стажа курения, тогда как на течение опухолевого процесса влияют и другие факторы риска.

При изучении научно-технической патентной информации идентичная совокупность существенных признаков, заявленная в изобретении, позволяющих прогнозировать неблагоприятное течение опухолей СОПР, нами не обнаружена.

Заявляемый способ решает задачу прогнозирования неблагоприятного течения новообразований СОПР у лиц различного возрастного контингента и позволяет определить степень риска или вероятность для последующего выбора врачебной тактики, объема и режима диспансерного наблюдения, включая мероприятия по элиминации вирусов и устранению других значимых факторов риска.

Техническим результатом, на достижение которого направлено создание данного изобретения, является определение степени риска неблагоприятного течения новообразований СОПР в зависимости от наличия вирусов, обладающих онкогенным потенциалом, обнаруживаемых в ротовой жидкости, изъязвления ткани опухоли, наличие стажа работы в условиях профессиональной вредности.

Осуществление. Ротовая жидкость собирается в стерильные одноразовые пластиковые пробирки с реагентом для транспортировки и хранения клинического материала «Транспортная среда с муколитиком», утвержденным ФГУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора.

Процедура взятия и хранения клинического материала проводится в соответствии с методическими рекомендациями «Взятие, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦР-диагностики» ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, М., 2008 г. Ротовая жидкость доставляется в молекулярно-генетическую лабораторию в течение суток. Далее в лаборатории проводится исследование ротовой жидкости методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Для амплификации нуклеиновых кислот использовали комплекты реагентов "АмплиСенс® EBV/CMV/HHV6-скрин-FL» (набор реагентов для амплификации ДНК вируса Эпштейна-Барр, цитомега-ловируса и вируса герпеса человека 6 типа), "АмплиСенс® ВПЧ ВКР скрин-титр-FL" и «АмплиСенс® ВПЧ ВКР генотип-FL" (набор реагентов для амплификации генотипирования ДНК вирусов папилломы человека высокого канцерогенного риска 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 типов), «АмплиСенс® HSV-typing-FL» (набор реагентов для амплификации ДНК вирусов простого герпеса и генотипирования 1 и 2 типов) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» ФГУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора и амплификатор AppliedBioSystem.

Общие методы включали сбор анамнестических данных, которые заносили в диагностическую анкету, данные объективного обследования (осмотр, пальпация). Особое внимание уделяли наличию курения табака и стажу курения, длительности заболевания, наличию сопутствующих заболеваний.

При внешнем осмотре выявляли размер, цвет, границы и локализацию новообразования. Пальпаторно определяли консистенцию опухоли, спаянность с окружающими тканями, состояние лимфатических узлов. Для подготовки больных к оперативному вмешательству были проведены общеклинические исследования (клинический анализ крови, общий анализ мочи, глюкоза крови и др.). При наличии как доброкачественных, так и злокачественных опухолей челюстно-лицевой области, на дооперационном этапе производились цитологическое и гистологическое исследование (биопсия) с участием специалистов на базе ГБУЗ Областной клинический онкологический диспансер г. Твери по общепринятым методикам.

На базе молекулярно-диагностической лаборатории КДЛ КДЦ ТГМА было проведено комплексное обследование 90 пациентов с новообразованиями СОПР (среди них - 45 женщин и 45 мужчин в возрасте от 18 до 76 лет). Средний возраст больных составил 57,1 года. Все больные были разделены на две группы. В 1-ю группу исследуемых вошли 44 (48,9%) больных с впервые диагностированными злокачественными новообразования, а во 2-ю группу были включены 46 (51,1%) больных с первично выявленными доброкачественными новообразованиями.

В результате проведенного исследования в ротовой жидкости 75 человек (83,3%) лиц с новообразованиями СОПР, а также в ткани опухолей, была обнаружена ДНК представителей герпесвирусов: ЭБВ, вирусов простого герпеса первого типа (ВПГ 1), цитомегаловируса (ЦМВ), вируса герпеса 6 типа (ГВЧ 6) и их ассоциации. В 100% случаев из ткани злокачественных новообразований СОПР выделена ДНК различных вирусов, обладающих онкогенным потенциалом, что достоверно выше (р<0,05) чем в доброкачественных, где ДНК вирусов выявлена в 63% случаев. Наиболее часто встречался ЭБВ, он же преобладал среди ассоциаций вирусов у лиц с новообразованиями СОПР. ДНК ВЭБ выявлена в слюне и ткани опухоли у 80,4% пациентов с раком полости рта. Моноинфекция была выявлена в 46,6% вируспозитивных образцов у лиц с новообразованиями СОПР, в других случаях обнаружена ассоциация двух или трех вирусов, что составило 53.4% случаев. Ассоциации из трех вирусов, один из которых был всегда ВЭБ, найдены только в злокачественных опухолях. Кроме того, показано достоверное расширение спектра вирусов с онкогенным потенциалом в ткани злокачественных опухолей по сравнению с доброкачественными опухолями и с группой здоровых людей.

По результатам проведенного исследования была создана база данных, включающая клинико-анамнестические, молекулярно-генетические и морфологические (цито- и гистологические) показатели 90 больных с новообразованиями слизистой оболочки полости рта. Данные классифицированы в зависимости от наличия или отсутствия у пациентов вирусов с онкогенным потенциалом (ВПЧ высокого канцерогенного риска (ВКР), ЭБВ, ВПГ 1, ЦМВ, ГВЧ 6), а также морфологической (цито- и гистологической) картины опухоли.

При статистической обработке базы данных, в ходе которой были включены в анализ все возможные категориальные переменные для решения проблемы множественных сравнений, исключения пассажирских переменных, контроля потенциальных конфаундеров. Была построена бинарная логистическая регрессионная модель. В качестве зависимой переменной использовалось наличие или отсутствие рака. Расчеты проведены в программе IBM SPSS 23, методом одновременного включения. Переменные, оставшиеся в модели после завершения анализа независимо от других переменных, связаны с вероятностью получить рак СОПР и его неблагоприятное течение, предполагающее, возникновение рецидива, озлокачествление доброкачественных или предраковых новообразований, множественный характер доброкачественных и злокачественных новообразований.

По результатам проведенного исследования статистически значимыми факторами риска неблагоприятного течения СОПР являются изъязвление опухолевого образования, наличие вирусов ЭБВ и ВПГ 1 в ротовой жидкости, а также работа на производстве с вредными условиями труда и предложена формула для расчета риска неблагоприятного течения опухолей СОПР (обозначается латинской буквой у).

В формуле имеется четыре значимых независимых переменных, изъязвление ткани опухоли, наличие в ротовой жидкости ДНК вирусов ЭБВ и ВПГ 1 (EBV и HSV 1 соответственно), работа в условиях профессиональной вредности и константа -8,123.

Игрек может принимать значение от 0 до 1, на следующем этапе производится нормализация данного показателя в проценты. Чем больше значение игрек, тем выше вероятность неблагоприятного течения опухолей СОПР.

Для низкой степени риска характерно значение у от 1 до 30%, для средней степени значение y от 31-70%, высокая степень отмечается у пациентов со значением y более 70% (таблица 1).

Новыми, ранее не известными признаками заявленного способа прогнозирования неблагоприятного течения новообразований СОПР в зависимости от величины у, которая рассчитывается по формуле являются:

1) прогнозирование неблагоприятного течения новообразований СОПР при наличии у пациентов статистически значимых факторов риска, включая наличие в ротовой жидкости ДНК вирусов ЭБВ, ВПГ 1, обладающих онкогенным потенциалом, изъязвления ткани новообразования, вредное производство в трудовом анамнезе.

2) предложена формула для количественного определения риска неблагоприятного течения новообразований СОПР, что может быть использовано при формировании групп риска и выбора тактики ведения пациентов, имеющих опухоли данной локализации.

Сущность заявляемого способа поясняется следующими примерами:

Пример 1. Мужчина, 40 лет, обратился к врачу-стоматологу в связи с наличием на спинке языка небольшого новообразования размером 3x4 мм, в виде папилломы, без изъязвления. Трудовой анамнез без особенностей, вредных условий труда не выявлено. При осмотре был осуществлен забор ротовой жидкости и проведено ее молекулярно-генетическое исследование на наличие вирусов с онкогенным потенциалом. По результатам исследования ни одного из вышеперечисленных вирусов не обнаружено.

При расчете величины у получено значение 0,03%, что соответствует низкой вероятности неблагоприятного течения новообразования.

Рекомендации: произвести удаление новообразования в пределах здоровых тканей и дать общие рекомендации по гигиене полости рта.

После удаления новообразования проведено гистологическое исследование, по результатам которого выявлена морфологическая картина папилломы СОПР.

Пример 2. Женщина 62 лет, обратилась к врачу-онкологу в связи с наличием на слизистой щеки образования размеров до 2,5 см в диаметре, которое периодически травмировалось при приеме пищи. При осмотре поверхность новообразования была с наличием изъязвления, слабо кровоточила при дотрагивании. Трудовой анамнез без особенностей, вредных условий труда не выявлено. Был осуществлен забор ротовой жидкости и проведено ее молекулярно--генетическое исследование на наличие вирусов с онкогенным потенциалом. По результатам исследования обнаружены ДНК вируса Эпштейн-Барра и ВПГ 1 типа.

При расчете величины у получено значение 99,8%, что соответствует высокому риску неблагоприятного течения новообразования.

По результатам цитологического и гистологического исследований были выявлены признаки, характерные для плоскоклеточной карциномы.

Рекомендации: лечение и диспансерное наблюдение у онколога не реже 2 раз в год.

Пример 3. Мужчина 52 лет, обратился к врачу-стоматологу в связи с наличием на слизистой оболочке нижней губы плотного округлого новообразования до 7 мм в диаметре, без изъязвления. Трудится в условиях профессиональной вредности - технолог на производстве анилиновых красителей. При осмотре был осуществлен забор ротовой жидкости и проведено ее молекулярно-генетическое исследование на наличие вирусов с онкогенным потенциалом. По результатам исследования обнаружена ДНК вируса Эпштейн-Барр.

При расчете величины у получено значение 69,6%, что соответствует среднему риску неблагоприятного течения новообразования.

Рекомендации: хирургическое лечение с последующим диспансерным наблюдением не реже 1 раза в год, смена рода профессиональной деятельности.

По результатам цитологического и гистологического исследований были выявлены признаки, характерные для фибропапилломы.

Список используемой литературы

1. Афанасьева Т.А., Гурцевич В.Э. Молекулярно-биологические аспекты канцерогенеза, ассоциированного с вирусом Эпштейна-Барр. Мол. Биол. 1998; 32 (6), С. 940-947.

2. Богатов В.В., Червинец В.М., Самоукина A.M., Насонова М.В., Лебедев С.Н. Роль вирусов с онкогенным потенциалом и их ассоциаций в генезе новообразований челюстно-лицевой области. Стоматология, Том 94, №1,2015 г., С. 23-24.

3. Киселев Ф.Л. Вирус-ассоциированные опухоли человека: рак шейки матки и вирусы папиллом. Биохимия, 2000, (65), №1, С. 79-91.

4. Самоукина A.M., Насонова М.В., Михайлова Е.С., Алексеева Ю.А., Веселова Н.А. Бактериально-вирусные ассоциации полости рта у здоровых людей и при новообразованиях челюстно-лицевой области. Лечение и профилактика, выпуск «Инфекционные болезни», 2016, №4 (20), С. 29-34.

5. Уразова Л.Н., Кузнецова Т.Н., Севостьянова Н.В., Коломиец Л.А., Чердынцева Н.В. Маркеры онкогенных вирусов в ранней диагностике злокачественных опухолей. Сибирский онкологический журнал. 2004, №2, С. 111-116.

6. Ai-Di Gu, Mu-Sheng Zeng. The Criteria to Confirm the Role of Epstein-Barr Virus in Nasopharyngeal Carcinoma Initiation. Int J Mol Sci. 2012; 13(10): 13737-13747.

7. Alibek K., Irving S., Sautbayeva Z., Kakpenova A., Bekmurzayeva A., Baiken Y., Imangali N., Shaimerdenova M., Mektepbayeva D., Balabiyev A. and Chinybayeva A. Disruption of Bcl-2 and Bcl-xL by viral proteins as a possible cause of cancer. Infectious Agents and Cancer Dec, 2014, 9:44.

8. Alibek K., Kakpenova A., Baiken Y. Role of infectious agents in the carcinogenesis of brain and head and neck cancers. Infect Agent Cancer. 2013, Feb2;8(l):7.

9. Angadi P.V., Savitha J.K., Rao S.S., Sivaranjini Y. Oral field canceriza-tion: current evidence and future perspectives. Oral Maxillofac Surg. - Jun 2012;16(2):171-80.

10. Baron H.M., Bobrysheva I.V., Varshaver N.B. The activated human c-Ha-ras-1 oncogene as a mutagen. Cancer Genet. Cytogenet. - 1992, V. 62: 15-20.

11. Bottalico D, Chen Z, Dunne A, Ostoloza J, McKinney S, Sun C, Schlecht NF, Fatahzadeh M, Herrero R, Schiffman M, Burk RD. The oral cavity contains abundant known and novel human papillomaviruses from the Betapapil-lomavirus and Gammapapillomavirus genera. J Infect Dis. 2011, Sep 1; 204(5):787-92.

12. Chen Y., Williams V., Filippova M., Filippov V., Duerksen-Hughes P. Viral Carcinogenesis: Factors Inducing DNA Damage and Virus Integration. Cancers 2014, 6(4), 2155-2186.

13. Doorbar J, Egawa N, Griffin H, Kranjec C, Murakami I. Human papillomavirus molecular biology and disease association. Rev Med Virol. 2015 Mar; 25 Suppl(l):2-23.

14. Epstein M.A., Achong B.G., Barr Y.M. Virus particles in cultured lymphoblasts from Burkitt's lymphoma. Lancet. 1964; 1: 702-703.

15. Gillison ML, Koch WM, Capone RB, Spafford M, Westra WH, Wu L, Zahurak ML, Daniel RW, Viglione M, Symer DE, Shah KV, Sidransky D. Evidence for a causal association between human papillomavirus and a subset of head and neck cancers. J Natl Cancer Inst. 2000 May 3; 92(9):709-20.

16. Lucchese A. Viruses and oral cancer: crossreactivity as a potential Link. Anticancer Agents Med Chem, 2015; 15(10): 1224-9.

17. Ly M, Abeles SR, Boehm TK, Robles-Sikisaka R, Naidu M, Santiago-Rodriguez T, Pride DT. Altered oral viral ecology in association with periodontal disease. - MBio - January 1, 2014; 5 (3); 1133-14.

18. Masahiko Ajiro and Zhi-Ming Zheng. Oncogenes and RNA splicing of human tumor viruses Emerg Microbes. Infect. 2014, Sep; 3(9): e63.

19. McKaig RG, Baric RS, Olshan AF. Human papillomavirus and head and neck cancer: Epidemiology and Molecular Biology. Head Neck 1998; 20:250-65.44

20. McLaughlin-Druber ME, Munger L: Viruses associated with human cancer. Biochem Biophisica Acta 2008, 1782:127-150.

21. Pinheiro Rdos S, Ferreira Dde C, Nobrega F, Santos NS, Souza IP, Castro GF. Current status of herpesvirus identification in the oral cavity of HIV-infected children. - Rev. Soc. Bras. Med. Trop.- January 1, 2013; 46 (1); 15-9

22. Reichart PA. Identification of risk groups for oral precancer and cancer and preventive measures. Clin Oral Investig. 2001 Dec; 5(4):207-13.

23. Robles-Sikisaka R, Ly M, Boehm T, Naidu M, Salzman J, Pride DT. Association between living environment and human oral viral ecology. - ISME J -September 1, 2013; 7 (9); 1710-24

24. Scholnick SB, Richter TM. The role of CSMD1 in head and neck carcinogenesis. Genes Chromosomes Cancer, 2003 Nov; 38(3):281-3

25. Van der Waal I. Are we able to reduce the mortality and morbidity of oral cancer; some considerations. Med Oral Patol Oral Cir Bucal 2013; 18(1): 33-7.

26. Weiss R.A., Vogt P.K. 100 years of Rous sarcoma virus. J. Exp.Med. - 2011, Nov 21; 208(12): 2351-2355.

27. zur Hausen H. The search for infectious causes of human cancers: where and why (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 2009; 48(32):5798-808.