СПОСОБ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ МИКРОБИОТЫ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНОГО ТРАКТА У ПОДРОСТКОВ 14-18 ЛЕТ ПО МИКРОФЛОРЕ РОТОВОЙ ЖИДКОСТИ

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для скрининговой оценки состояния микробиоты пищеварительного тракта у подростков 14-18 лет на этапе донозологической диагностики при проведении диспансеризации с последующим формированием групп риска и прогнозированием развития дисбиотических состояний.

В настоящее время доказано, что дисбиотические изменения в ЖКТ связаны с различными заболеваниями органов и систем и сами могут приводить к возникновению патологических изменений во всех отделах пищеварительного тракта от ротовой полости до кишечника. Следует отметить, что микробное сообщество различных биотопов пищеварительного тракта характеризуется сложной системой взаимосвязей и быстро реагирует на воздействие внешних и внутренних факторов качественными и количественными изменениями даже при отсутствии клинических симптомов и жалоб. Кроме того, при изучении роли микробиоценозов открытых полостей в формировании реактивности организма, отражающих состояние колонизационной резистентности, у лиц при респираторной патологии, инфекциях урогенитального тракта показали системный характер дисбиотических изменений [1, 2, 4, 5, 6, 7, 8].

Микроэкосистема полости рта, включающая 20% представителей нормофлоры (более 200 видов) и являющаяся начальным звеном пищеварительного конвейера, биотопом, через который происходит заселение пищеварительного тракта и дыхательных путей, практически не исследуется в прикладном здравоохранении. Между тем, исследование просветной микрофлоры полости рта, отражающей особенности микробиоценоза дистальных отделов пищеварительного тракта является доступным, неинвазивным методом и может быть использован как скрининг-тест для оценки состояния микробиоты пищеварительного тракта [2, 7, 9, 10].

Наиболее распространенным методом оценки микробиоты пищеварительного тракта является бактериологическое исследование кала, т.е. определение просветной микрофлоры толстого кишечника, которое проводится при обращении к врачу и наличии жалоб и/или клинических проявлений, тогда как на этапе диспансеризации здоровых детей и подростков состояние микробиоты пищеварительного тракта не оценивается.

Бактериологическое исследование кала на дисбактериоз проводится согласно различным нормативным документам (Методические рекомендации «Микробиологическая диагностика дисбактериоза кишечника», Бондаренко В.М., Лиходед В.Г. ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва, 2007; Информационное письмо «Совершенствование методов диагностики дисбактериоза толстого кишечника», Иванов В.П., Бойцов А.Г. и др. СПБГМА им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, 2002).

Но этот метод имеет ряд недостатков и издержек, включая их большую трудоемкость, низкую воспроизводимость, высокую стоимость питательных сред, длительность анализа, сложность сбора и своевременной доставки исследуемого материала в лабораторию, наличие квалифицированного персонала, владеющего методикой и др.

Кроме того, существуют способы косвенной оценки состояния микрофлоры по содержанию летучих жирных кислот. Известен «Газохроматографический способ оценки дисбиотических состояний ротоглотки у детей» (Брико Н.И., Бабин В.Н., Белоусов Ю.А., патент №2473902), при котором проводится газохроматографический анализ ротовой жидкости у детей. Для этого анализируемую пробу дополнительно подкисляют трифторметилсульфокислотой или фторсульфокислотой или 40% водным раствором хлорной кислоты до pH 1,9-2,1. Изобретение обеспечивает определение концентрации отдельных летучих жирных кислот в ротовой жидкости при их низкой общей концентрации и небольших объемах биопроб. Показатели, получаемые данным способом, можно использовать при мониторинге эффективности проводимых терапевтических мероприятий, изучении влияния на нормальную микрофлору новых лекарственных препаратов и пребиотиков.

Также известен «Способ определения микрофлоры полости рта и способ лечения заболеваний, сопровождающихся нарушениями микрофлоры в полости рта» (Семенов Э.К., Семенова Э.Э., Ардатская М.Д., патент №2229130). Проводят исследование ротовой жидкости и определяют количественное и качественное содержание короткоцепочечных жирных кислот. По их суммарному количеству на уровне 0,8-1,9 мг/г судят о нормальном состоянии микрофлоры полости рта. Выбирают фармакологический препарат в соответствии с изменениями микрофлоры. Способ позволяет установить качественный состав микроорганизмов для назначения фармакологического средства и оценить эффективность проводимого лечения.

Недостатками этих методов является то, что они требуют наличия специального оборудования, в большинстве случаев недоступного в прикладном здравоохранении.

Наиболее близким к заявленному способу является «Способ определения колонизационной резистентности экологической ниши тела человека» (Бухарин О.В., Забирова Т.М., патент №2175673). Способ может быть использован для ранней диагностики дисбиотических состояний. Способ осуществляют путем взятия исследуемого материала, посева его на селективные питательные среды, выделения чистых культур микроорганизмов и определения их видового и количественного состава. Далее выделенные штаммы автохтонной микрофлоры выращивают в жидкой питательной среде, обрабатывают хлороформом, отделяют супернатант и добавляют последний к взвеси патогенных и/или аллохтонных условно-патогенных микроорганизмов. Параллельно готовят контрольные пробы из взвесей патогенных и/или аллохтонных условно-патогенных микроорганизмов и жидкой питательной среды. Опытные и контрольные пробы инкубируют, затем добавляют во все пробы жидкую питательную среду, вновь инкубируют и замеряют оптические плотности опытных и контрольных проб. О колонизационной резистентности экологической ниши судят по изменению роста патогенных и/или аллохтонных условно-патогенных микроорганизмов в опытных пробах по сравнению с контрольными. Способ позволяет повысить достоверность определения колонизационной резистентности различных экологических ниш тела человека, что способствует повышению эффективности ранней диагностики дисбиотических состояний. Однако этот метод так же, как и бактериологический метод требует выделения широкого спектра чистых культур микроорганизмов, необходимых для последующего приготовления их супернатантов, что делает метод трудоемким, затратным, длительным.

Заявляемый авторами способ решает задачу скрининговой оценки микробиоты пищеварительного тракта по микрофлоре ротовой жидкости у здоровых подростков 14-18 лет, что, учитывая системность микроэкологических сдвигов, может быть использовано на этапе донозологической диагностики с последующим формированием групп риска и прогнозированием развития дисбиотических состояний.

Техническим результатом, на достижение которого направлено создание данного изобретения, является определение состояния микробиоты пищеварительного тракта по микрофлоре ротовой жидкости у здоровых подростков 14-18 лет. Микроэкологические изменения ротовой жидкости позволяют интегрально оценить микробиоту пищеварительного тракта и определить вариант микрофлоры с последующим выделением групп риска в данной возрастной категории.

Микрофлора полости рта и кишечника здоровых подростков 14-18 лет имеет ряд общих взаимосвязанных характеристик, определяющих состояние микробиоты всего пищеварительного тракта в целом. Для сравнительной оценки соотношения микробиоценоза полости рта и кишечника были выбраны такие доминирующие представители облигатной и факультативной микрофлоры, которые встречаются в начальном и конечном биотопах пищеварительного тракта и могут отражать состояние микроэкологии пищеварительного тракта: лактобациллы, бифидобактерии, стрептококки, стафилококки, кандиды, бациллы. Эти представители микрофлоры могут быть использованы как «микробные маркеры» микроэкологического неблагополучия.

Сравнительный анализ результатов исследования позволяет считать, что определение микрофлоры ротовой жидкости может использоваться как скрининг-тест для определения микробиоты полости рта и пищеварительного тракта в целом.

Анализ качественных и количественных параметров микробиоценоза в изучаемых биотопах позволил выделить три варианта микробиоты пищеварительного тракта у здоровых подростков 14-18 лет, различающихся особенностями сочетания доминирующей облигатной и факультативной микрофлоры. Определение варианта микробиоты при диспансеризации здоровых подростков позволит выделить группы риска в данной возрастной категории.

Осуществление изобретения.

Ротовая жидкость собиралась в стерильные одноразовые пластиковые контейнеры утром, натощак, перед проведением гигиенического ухода за полостью рта. Ротовую жидкость доставляли в бактериологическую лабораторию в течение 1 часа, где готовили разведения 10^-1, 10^-3 с последующим посевом на питательные среды. Для культивирования были использованы питательные среды: Endo Agar (Himedia), Sabouraud Dextrose Agar BBL, Lactobacillus MRS Agar (Himedia), Shaedler Agar BBL, Mannitol Salt Agar (Himedia), Columbia Blood Agar (Himedia). Посевы инкубировали при температуре 37°С в течение 24-48 часов в аэробных, микроаэрофильных и анаэробных условиях с использованием микроанаэростатов (BBL®) и газогенераторных пакетов Gas Pack Plus (BBL®). Количество бактерий определяли путем подсчета колониеобразующих единиц на 1 мл ротовой жидкости (lg КОЕ/мл).

В ротовой жидкости здоровых подростков 14-18 лет определялись микроорганизмы родов Streptococcus, Staphylococcus, Lactobacillus, Candida, Micrococcus, Neisseria, Bifidobacterium, Peptostreptococcus, Peptococcus, Bacillus, Actinomyces, Veillonella, Bacteroides, Leptotrichia, представители семейства Enterobactericeae и др. На основании выявленных различий и имеющихся в литературе данных о типах дисбиоза полости рта [2, 6] нами были выделены три варианта микробиоценоза ротовой полости у здоровых подростков 14-18 лет (табл. 1).

Для первого варианта характерно присутствие Streptococcus spp., не обладающих гемолитической активностью, в количестве 5 lg, Lactobacillus spp. 3-4 lg КОЕ/мл и отсутствие УПМ. Второй вариант характеризуется увеличением количества негемолитических Streptococcus spp. до 6 lg, снижением Lactobacillus spp. до 2 lg КОЕ/мл и появлением УПМ (Staphylococcus spp., Candida spp., Bacillus spp.) в количестве 1-2 lg КОЕ/мл. У лиц с третьим вариантом микробиоценоза полости рта наблюдается увеличение негемолитических Streptococcus spp. до 7 lg КОЕ/мл, более выраженное снижение Lactobacillus spp. до 1 lg КОЕ/мл или их полное отсутствие, повышение уровня УПМ, обладающей узким спектром ферментативной активности, коррелирующей с патогенностью в количестве до 4-5 lg КОЕ/мл.

Бактериологическое исследование кала проводилось с использованием классических методик, позволяющих выделить известных представителей индигенной, факультативной и транзиторной микрофлоры (Методические рекомендации «Микробиологическая диагностика дисбактериоза кишечника», Бондаренко В.М., Лиходед В.Г. ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва, 2007).

Установлено, что просветная микрофлора толстого кишечника также была представлена микроорганизмами родов Enterococcus, Staphylococcus, Lactobacillus, Candida, Micrococcus, Neisseria, Bifidobacterium, Peptostreptococcus, Peptococcus, Bacillus, Actinomyces, Clostridium, Veillonella, Bacteroides, Leptotrichia, представители семейства Enterobactericeae и др. При анализе качественных и количественных параметров микробиоценоза кишечника у подростков 14-18 лет, как и в полости рта, также были выделены три варианта микробиоты (табл. 2).

У лиц с первым вариантом микробиоценоза показатели полностью соответствовали возрастной норме биоценоза кишечника [3]. Для второго варианта было характерно снижение уровня индигенной микрофлоры (эшерихий, лактобацилл и бифидобактерий) на 1-2 порядка и наличие УПМ в количестве 2-3 lg КОЕ/г, а для третьего варианта - увеличение количества УПМ, обладающей факторами, коррелирующими с патогенностью в допустимом для возрастной нормы количестве на фоне снижения уровня индигенной микрофлоры.

Результаты исследования показали, что микрофлора полости рта и кишечника подростков 14-18 лет имеет ряд общих взаимосвязанных характеристик и эти изменения возникают на различных уровнях ЖКТ у одних и тех же детей, что отражает системность микроэкологических сдвигов и позволяет провести скрининговую оценку состояния пищеварительного тракта по «микробным маркерам» ротовой жидкости.

Новыми, ранее неизвестными признаками заявленного способа оценки микробиоты пищеварительного тракта по микрофлоре ротовой жидкости являются:

1) скрининговая оценка микробиоты пищеварительного тракта здоровых подростков 14-18 лет по микрофлоре ротовой жидкости;

2) описаны качественные и количественные параметры вариантов микрофлоры ротовой жидкости, отражающие микроэкологические сдвиги в пищеварительном тракте в целом, что может быть использовано на этапе донозологической диагностики при проведении диспансеризации с последующим формированием групп риска и прогнозирования развития дисбиотических состояний.

Сущность заявляемого способа поясняется следующими примерами.

Пример 1. У здорового подростка, 18 лет, при профилактическом осмотре был осуществлен забор ротовой жидкости и кала и проведено бактериологическое исследование микрофлоры данных биотопов с выделением чистых культур микроорганизмов, которые по совокупности морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических свойств были идентифицированы до рода и вида. После детального изучения качественных и количественных параметров микробиоты был определен третий вариант микробиоценоза ротовой жидкости по следующим микроэкологическим параметрам: Streptococcus spp. в количестве 6,37 lg КОЕ/мл, Staphylococcus spp. 4,66 lg КОЕ/мл (S. aureus 4,2 lg КОЕ/мл), Lactobacillus spp. не выделены.

При бактериологическом исследовании кала выявлены эшерихии с нормальной ферментативной активностью 6,4 lg КОЕ/г, гемолитические эшерихии 3,4 lg КОЕ/г, бифидобактерии 6,2 lg КОЕ/г, Staphylococcus spp. 3,5 lg КОЕ/г (S. aureus 3,15 lg КОЕ/г), Bacillus spp. 3,3 lg КОЕ/г, лактобациллы не выделены. Что также соответствовало третьему варианту микробиоты кишечника.

Варианты микробиоценоза кишечника и полости рта совпадают, а также определяется идентичный «микробный маркер» (S. aureus), что указывает на системность микроэкологических сдвигов и отражает состояние микроэкологии в пищеварительном тракте в целом.

Пример 2. У здорового подростка, 16 лет, при профилактическом осмотре был осуществлен забор ротовой жидкости и кала и проведено бактериологическое исследование микрофлоры данных биотопов. После детального изучения качественных и количественных параметров микробиоты был определен второй вариант микробиоценоза ротовой жидкости по следующим микроэкологическим параметрам: Streptococcus spp. в количестве 6,37 lg КОЕ/мл, Lactobacillus spp. 2,14 lg КОЕ/мл, С. albicans 3,25 lg КОЕ/мл.

При бактериологическом исследовании кала выявлены эшерихии с нормальной ферментативной активностью 7,3 lg КОЕ/г, бифидобактерии 7,18 lg КОЕ/г, Lactobacillus spp. 5,14 lg КОЕ/г, С. albicans 2,75 lg КОЕ/г. Что также соответствовало второму варианту микробиоты кишечника.

Варианты микробиоценоза кишечника и полости рта также совпадают, а также определяется идентичный «микробный маркер» (С. albicans), что указывает на системность микроэкологических сдвигов и отражает состояние микроэкологии в пищеварительном тракте в целом.

Пример 3. У здорового подростка, 14 лет при профилактическом осмотре был осуществлен забор ротовой жидкости и кала и проведено бактериологическое исследование микрофлоры данных биотопов. После детального изучения качественных и количественных параметров микробиоты был определен первый вариант микробиоценоза ротовой жидкости по следующим микроэкологическим параметрам: Streptococcus spp. в количестве 4,21 lg КОЕ/мл, Lactobacillus spp. 3,69 КОЕ/мл, условно-патогенной микрофлоры не обнаружено.

При бактериологическом исследовании кала выявлены: эшерихии с нормальной ферментативной активностью 8,23 lg КОЕ/г, бифидобактерии 8,16 lg КОЕ/г, Lactobacillus spp. 7,54 lg КОЕ/г), условно-патогенных микроорганизмов также не обнаружено, что соответствовало первому варианту микробиоты кишечника.

Выявление первого, второго или третьего вариантов микробиоценоза пищеварительного тракта у здоровых детей и подростков требует различного подхода при проведении диспансеризации с последующим определением группы риска и назначения коррекционных профилактических мероприятий.

Список литературы

1. Воропаева Е.А. Роль микробиоценозов открытых полостей в формировании реактивности организма: диагностические критерии дисбиозов для оценки состояния здоровья человека. Москва, 2013, 38 с. Автореф. дисс. д.б.н.

2. Гаврилова О.А., Червинец Ю.В., Бондаренко В.М., Червинец В.М., Самоукина A.M., Лебедев Д.В. Микробный пейзаж полости рта у здоровых подростков и больных хроническим гастродуоденитом. Журн. микробиол., 2008, №6, с. 59-63.

3. Отраслевой Стандарт «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника (ОСТ 91500.11.0004-2003, утвержден Приказом МЗ РФ №231 от 09.06.2003).

4. Соболева Ю.В., Усвяцов Б.Я., Хлопко Ю.А., Бухарин О.В. Динамика микросимбиоценозов верхних дыхательных путей в норме и при патологии. Журн. микробиол., 2012, №3, с. 55-61.

5. Чернин В.В., Бондаренко В.М., Червинец В.М., Базлов С.Н. Дисбактериоз мукозной микрофлоры эзофагогастродуоденальной зоны, его диагностика и лечение. - Москва: МИА, 2011.

6. Чернин В.В., Парфенов А.И., Бондаренко В.М., Рыбальченко О.В., Червинец В.М. Симбионтное пищеварение человека. Физиология. Клиника, диагностика и лечение его нарушений. - Тверь: «Триада», 2013.

7. Шендеров Б.А. Микробная экология человека и ее роль в поддержании здоровья. Метаморфозы, 2014, №5, с. 72-80.

8. Buccigrossi V., Nicastro Ε., Guarino Α. Functions of intestinal microflora in children. Curr. Opin. Gastroenterol, Jan 2013, vol. 29(1), pp. 31-39.

9. Chiappin S., Antonelli G., Gatti R., De Palo E.F. Saliva specimen: a new laboratory tool for diagnostic and basic investigation. Clin. Chim. Acta, Aug 2007, vol. 38, no 8, pp. 30-40.

10. Koni A.C., Scott R.A., Wang G., Bailey M.E., Peplies J., Bammann K. DNA yield and quality of saliva samples and suitability for large-scale epidemiological studies in children. Int J Obes, Apr 2011, vol. 35, Suppl (1), pp. 113-121.