Способ измерения концентрации аналита в плазме крови

Изобретение относится к области исследования и анализа материалов, а именно, к способам измерения параметров наночастиц, взвешенных в жидкости, оптическими методами и может быть использовано для определения концентрации аналита, в том числе маркеров различных заболеваний, в плазме крови.

В последнее время интенсивно разрабатываются средства медицинской диагностики, основанные на эффекте агрегации наночастиц, используемых в качестве зондов. Подобный зонд представляет собой наночастицу, во многих случаях золотую, функционализированную биологическими рецепторами, например, антителами к определенным маркерам заболеваний, зонды помещаются в биологическую жидкость, например, в плазму или сыворотку крови. При наличии в этой жидкости молекул аналита происходит их связывание с молекулами-рецепторами, находящимися на поверхности функционализированных наночастиц, что приводит к их агрегации. В результате существенно увеличивается средний гидродинамический диаметр частиц в коллоидной системе и меняется распределение частиц по размерам. Эти изменения измеряются оптическими методами - по спектрам плазмонного резонанса или с помощью динамического рассеяния света.

Из уровня техники известен способ измерения количества аналита в исходном растворе, заключающийся в добавлении в раствор металлических наночастиц-зондов, облучении полученного раствора лазерным излучением, измерении автокорреляционной функции (АКФ) интенсивности рассеянного излучения, из которой путем решения обратной задачи рассеяния получают средний гидродинамический радиус наночастиц и их распределение по размерам. На основе этого распределения рассчитывают концентрацию аналита в анализируемой жидкости (см. патент US 8883094, кл. G01N 15/02, опубл. 11.11.2010). При использовании указанного метода для измерений размеров наночастиц и последующих их распределений по размерам требуется, чтобы рассеяние на исследуемых объектах не менее чем на порядок превышало рассеяние на других нано- или микрообъектах, находящихся в образце. Для целей медицинской диагностики - определения содержание аналитов-маркеров заболеваний в плазме крови, с помощью указанного метода требуется либо существенного разбавлять плазму, либо увеличивать концентрацию добавляемых частиц. Такие подходы во многих случаях крайне нежелательны, поскольку эффекты образования белковых оболочек и агрегации существенно зависят как от свойств плазмы, которые изменяются при разбавлении, так и от концентрации наночастиц.

Возможны различные подходы к выделению вклада наночастиц в рассеяние света на фоне других рассеивающих объектов. Если требуется исследовать оптически анизотропные частицы на фоне оптически изотропных, то можно использовать эффекты, возникающие при рассеянии поляризованного лазерного излучения. Когда возбуждающее излучение имеет линейную поляризацию, например в вертикальной плоскости (V), то в излучении, рассеянном на оптически анизотропных частицах, можно выделить составляющую VV, поляризация которой совпадает с поляризацией возбуждающего излучения (кополяризационную), и перпендикулярную ей составляющую VH (кросс-поляризационную). Метод анализа, использующий VH, получил название деполяризованного динамичесого рассеяния света и до последнего времени применялся главным образом для измерения размерных параметров несферических наночастиц (см. Шмыткова Е.А., Возможности метода деполяризованного динамического рассеяния света для определения геометрических параметров несферических наночастиц // Метрология. 2013. №10. С. 16-21). У оптически изотропных частиц составляющая VH отсутствует, поэтому АКФ этой состаляющей g_VH(τ) содержит информацию только об анизотропных частицах. Таким образом, регистрация этой составляющей позволяет определить размерные параметры анизотропных частиц, минимизировав влияние рассеянного излучения изотропного фона. Такой подход, основанный на применении деполяризованного динамического рассеяния, был предложен в работе (Balog S., Rodriguez-Lorenzo L., Monnier С.A. Obiols-Rabasa M., Rothen-Rutishauser В., Schurtenberger P., Petri-Fink A., Characterizing nanoparticles in complex biological media and physiological fluids with depolarized dynamic light scattering // Nanoscale. 2015. V. 7. P. 5991-5997) и апробирован путем измерения размеров сферических золотых наночастиц, добавляемых в искусственно приготовленные смеси. Указанные смеси содержали частицы биологического происхождения - бычий сывороточный альбумин, клеточные культуры и др.

Технической проблемой является разработка способа измерения, позволяющего с высокой точностью определять концентрацию аналита даже в неразбавленной плазме крови. Поставленная проблема решается тем, что согласно способу измерения концентрации аналита в плазме крови, выполняют следующие последовательные операции: подготавливают исходный коллоидный раствор металлических вытянутых наночастиц-зондов, на поверхности которых закреплены молекулы-рецепторы, селективно связывающиеся с молекулами аналита, а длина наностержня превышает ширину не менее, чем в 3 раза; с помощью лазерного корреляционного спектрометра для исходного раствора измеряют АКФ g_VH0(τ) в диапазоне значений времен задержки τ от 1 мкс до 10 мс для компоненты рассеянного излучения, линейная поляризация которой перпендикулярна поляризации лазерного излучения, возбуждающего рассеяние; вычисляют исходный гидродинамический радиус R_H0 путем решения обратной задачи деполяризованного динамического рассеяния на основе уравнения

где β - фактор когерентности лазерного корреляционного спектрометра, k - постоянная Больцмана, Т - абсолютная температура, η - коэффициент вязкости, q=4πnsim(θ/2)/λ₀ - модуль волнового вектора рассеяния, n - показатель преломления, λ₀ - длина волны лазерного излучения в вакууме, θ - угол рассеяния;

затем добавляют к исходному раствору исследуемый образец плазмы крови и инкубируют полученный раствор при заданной температуре. Аналогичным образом измеряют автокорреляционную функцию g_VH1(τ) и вычисляют гидродинамический радиус R_H1 для полученного раствора; по разности значений R_H0 и R_H1 определяют концентрацию искомого аналита в плазме крови.

На чертеже приведены АКФ золотых наностержней, зарегистрированные в водном растворе (пунктирная линия) и в неразбавленной плазме крови (сплошная линия).

В ходе разработки предлагаемого способа были проведены эксперименты с наночастицами различной конфигурации, которые могут быть использованы в качестве зондов. В результате этих экспериментов было выявлено, что наиболее перспективными с точки зрения использования совместно с методом деполяризованного динамического рассеяния света являются металлические, в частности, золотые наночастицы-зонды, длина которых превышает ширину не менее, чем в 3 раза. Было показано, что именно такая геометрия позволяет обеспечить значительно более высокую анизотропию рассеяния, и, соответственно, более интенсивную составляющую VH, что, в конечном счете, положительным образом влияет на точность измерений.

При исследованиях использовали пулированную (смешенную) плазму крови, полученную от нескольких условно здоровых доноров. В качестве антикоагулянта применяли 3,8%-й раствор цитрата натрия. В плазму добавляли наночастицы-зонды золота, имеющие форму наностержней длиной 40-100 нм и диаметром 10-25 нм. АКФ g_VH(τ) в диапазоне значений времен задержки τ от 1 мкс до 10 мс измеряли с помощью лазерного корреляционного спектрометра АРН-2 (производства ФГУП «ВНИИОФИ»), для составляющих VV и VH рассеянного излучения при угле рассеяния 90°. В качестве источника линейно-поляризованного излучения был задействован гелий-неоновый лазер мощностью 21 мВт, выделение указанных составляющих осуществлялось с помощью призмы Глана-Томпсона в канале сбора рассеянного излучения. Для точного определения слабой составляющей VH были учтены темновой ток фотоприемника, а также фоновые засветки, обусловленные деполяризованным рассеянием на стенках кюветы, на жидкости, в которой взвешены частицы, и на элементах оптической схемы прибора. Коллоиды указанных наночастиц-зондов в количестве 600 мкл добавляли в 2400 мкл неразбавленной плазмы крови.

В таблице 1 приведены значения компонент VV и VH скорости счета фотонов, пропорциональной интенсивности рассеянного излучения, для чистой неразбавленной плазмы и плазмы с различными добавлениями золотых наносфер и золотых наностержней.

Все значения скоростей счета приведены в таблице после вычитания темнового тока фотоприемника (3300 импульсов в секунду).

Из данных, приведенных в таблице 1, следует:

- для ко-поляризационной компоненты VV, используемой в обычном ДРС, рассеяние добавляемыми в неразбавленную плазму наночастицами мало различимо на фоне рассеяния частицами плазмы;

- кросс-поляризационная компонента VH для чистой неразбавленной плазмы находится на уровне фоновых засветок, в то время, как для золотых наносфер и особенно золотых наностержней, добавляемых в такую плазму, получаются значимые значения скоростей счета.

Таким образом, для измерения размерных параметров золотых наночастиц в неразбавленной плазме крови целесообразно использовать кросс-поляризационную компоненту VH рассеянного излучения. У наносфер значение этой компоненты недостаточно для получения приемлемого качества АКФ, поэтому предпочтительнее проводить измерение с золотыми наностержнями, имеющими большую анизотропию рассеяния, и, соответственно, более интенсивную компоненту VH.

Вид АКФ, а, следовательно, и размера частиц изменяется в результате взаимодействия наностержней золота с плазмой (см. фиг.).

Нормированная АКФ кросс-поляризационной составляющей интенсивности рассеянного излучения g_VH(τ) связана с коэффициентами трансляционной и ротационной диффузии наночастиц (D_т и D_р соответственно) выражением

где β - фактор когерентности лазерного корреляционного спектрометра, т.е. коэффициент, зависящий от оптической схемы установки; q=4πnsin(θ/2)/λ₀ - модуль волнового вектора рассеяния, n - показатель преломления жидкости, в которой взвешены наночастицы, λ₀ - длина волны лазерного излучения в вакууме, θ - угол рассеяния.

Экспериментально зарегистрированная g_VH(τ) позволяет по формуле (1) определить эквивалентный гидродинамический радиус наночастиц R_н, т.е. радиус сферических частиц, имеющих такие же коэффициенты трансляционной и ротационной диффузии, что и исследуемые наностержни. Для этого необходимо использовать формулы для коэффициентов трансляционной и ротационной диффузии:

где k - постоянная Больцмана; Т - абсолютная температура; η - коэффициент вязкости раствора.

Окончательно гидродинамический радиус R_H может быть вычислен путем решения обратной задачи деполяризованного динамического рассеяния на основе уравнения

Определение концентрации аналита в плазме крови складывается из двух этапов. На первом этапе осуществляется построение градуировочного графика. С этой целью проводится измерение гидродинамических радиусов исходных наночастиц и наночастиц, прошедших взаимодействие с растворами аналитов известных концентраций c_i (i - номер раствора с данной концентрацией), по результатам этих измерений строится график зависимости [R_H1-R_Ho](c), где R_H0 - гидродинамический радиус наночастиц до взаимодействия с аналитом, R_H1 - после взаимодействия. Затем полученная зависимость аппроксимируется линейным или квадратичным полиномом. На втором этапе проводится измерение гидродинамического радиуса наночастиц R_H1x после взаимодействия с раствором с неизвестной концентрацией аналита С_х. По измеренному значению R_H1x определяют с помощью градуировочной зависимости, построение которой было описано выше, значение концентрации аналита в растворе.

Благодаря использованию наночастиц-зондов и вычислению гидродинамического радиуса по кросс-корреляционной компоненте рассеянного излучения с помощью указанного математического выражения, предлагаемый способ позволяет даже для образцов слабо разбавленной или неразбавленной плазмы крови получать максимально точные значения концентрации аналита.

Пример.

Предлагаемый способ был реализован путем выполнения следующих последовательных операций:

- подготовили исходный коллоидный раствор наностержней золота длиной 63-79 нм и диаметром 19-25 нм (коллоидный раствор производства фирмы Alfa Asear, Великобритания);

- с помощью спектрометра АРН-2 для исходного раствора измерили нормированную автокорреляционную функцию g_VH0(τ) для кросс-поляризованной компоненты рассеянного излучения;

- вычислили исходный гидродинамический радиус R_H0=18 нм… путем решения обратной задачи деполяризованного динамического рассеяния на основе вышеприведенного уравнения (3);

- добавили к исходному раствору исследуемый образец неразбавленной плазмы крови, встряхнули и выдерживали полученный раствор при комнатной температуре (25°С) в течение 10 минут;

- аналогичным образом измерили автокорреляционную функцию g_VH1(τ) и вычислили гидродинамический радиус R_H1=28 нм для раствора наночастиц, прошедшего выдержку в плазме;

Проведенные эксперименты показывают возможность определять изменение гидродинамических радиусов наночастиц - зондов в неразбавленной плазме крови. Такие измерения оказались возможными благодаря использованию отличительных признаков изобретения - наночастиц-зондов в форме наностержней, длина которых превышает ширину не менее, чем в 3 раза, и кросс-корреляционной компоненты VH интенсивности рассеянного излучения для определения изменений гидродинамического диаметра наночастиц, обусловленного взаимодействием с аналитами.