Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО ДИУРЕТИЧЕСКОЙ И АНТИДЕПРЕССАНТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, в частности, к производству лекарственных средств в виде субстанций и индивидуальных биологически активных соединений и касается способа получения 2''-O-рамнозид витексина из листьев боярышника кроваво-красного (Crataegus sanguinea Pall).

Листья боярышника широко используются в отечественной и зарубежной медицине (1).

Известен способ выделения 2''-O-рамнозид витексина из листьев боярышника перистонадрезанного (Crataegus pinnatifida Bunge) (2). Согласно данной методики проводят: измельчение пробы сырья (2 кг) листьев боярышника перистонадрезанного, 2-х стадийное нагревание в колбе с обратным холодильником в течение 2 часов в присутствии 60% этилового спирта, концентрирование суммарного экстракта при пониженном давлении. Затем адсорбирование на колонке пористой полимерной смолы (АВ-8, Tianjin, Китай), удаление примесей водой, элюирование 30, 50 и 70% этанолом. Фракцию, элюированную 30%» этанолом, затем выпаривают при пониженном давлении с получением экстракта, который затем подвергается хроматографированию на колонке с силикагелем и элюированию смесью этилацетат-бутанон-муравьиная кислота-вода 3:3:1:1. На основе ТСХ-анализа (УФ проявление при 365 нм) объединяют фракции схожего состава, многократно подвергают колоночной хроматографии на силикагеле и элюируют смесью этилацетат-бутанон-муравьиная кислота-вода 5:3:1:1 до получения 1 г кристаллического 2''-O-рамнозид витексина (выход вещества составляет 0,05%). Чистота полученного вещества, определенная методом ВЭЖХ, составляет более 99%.

Данный метод взят нами в качестве прототипа. Недостатками этого метода являются низкий выход целевого вещества - 2''-O-рамнозид витексина (0,05%), многостадийность хроматографической очистки с использование различных сорбентов и элюента, представляющего собой смесь сложных систем растворителей.

Таким образом, целью изобретения является разработка способа получения вещества, обладающего диуретической и антидепрессантной активностью.

Техническим результатом является создание способа получения 2''-O-рамнозид витексина из листьев боярышника кроваво-красного методом колоночной хроматографии.

Технический результат достигается тем, что извлечение получают из листьев боярышника кроваво-красного с помощью 70% этилового спирта, целевое вещество элюируют смесью хлороформ-этиловый спирт в соотношении 85:15, дальнейшее выделение вещества осуществляют после смешивания упаренных под вакуумом элюатов, содержащих 2''-O-рамнозид витексина, с дистиллированной водой, нагревания, последующего охлаждения в течение 2 часов и промывания образовавшегося осадка ацетоном.

Способ реализуется следующим образом.

Измельченные воздушно-сухие листья боярышника кроваво-красного (100,0 г) экстрагируют 70% этиловым спиртом в соотношении 1:7 вначале при комнатной температуре в течение 6 ч, затем при нагревании в течение 1 ч. Полученное объединенное водно-спиртовое извлечение упаривают на роторной вакуумной установке до густого экстракта, который затем смешивают с 70 г силикагеля L 40/100, высушивают и вносят на колонку (8×10 см), заполненную силикагелем в виде взвеси в хлороформе. Хроматографическую колонку промывают хороформом (0,5 л) и смесью хлороформ - этиловый спирт в соотношении 90:10 (2 л). Целевое вещество элюируют смесью хлороформ-этиловый спирт в соотношении 85:15 (1,5 л). Контроль за разделением веществ осуществляют хроматографированием на пластинках "Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ-254" в системе растворителей: хлороформ-этиловый спирт-вода (26:16:3). Элюаты, содержащие 2''-O-рамнозид витексина, упаривают под вакуумом, остаток смешивают с дистиллированной водой, нагревают, а затем помещают в холодильник на 2 ч. По истечении этого времени производят отбор надосадочной жидкости, добавляют ацетон и промывают образовавшийся осадок, представляющий собой готовый продукт (2''-O-рамнозид витексина), имеющий степень чистоты 99,5%.

Предлагаемый способ поясняется следующим примером.

Пример 1.

Измельченные воздушно-сухие листьев боярышника кроваво-красного (100,0 г) экстрагируют 70% этиловым спиртом в соотношении 1:7 вначале при комнатной температуре в течение 6 ч, затем при нагревании в течение 1 ч. Полученное объединенное водно-спиртовое извлечение упаривают на роторной вакуумной установке до густого экстракта, который затем смешивают с 70 г силикагеля L 40/100, высушивают и вносят на колонку (8×10 см), заполненную силикагелем в виде взвеси в хлороформе. Хроматографическую колонку промывают хороформом (0,5 л) и смесью хлороформ-этиловый спирт в соотношении 90:10 (2 л). Целевое вещество элюируют смесью хлороформ-этиловый спирт в соотношении 85:15 (1,5 л). Контроль за разделением веществ осуществляют хроматографированием на пластинках "Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ-254" в системе растворителей: хлороформ-этиловый спирт-вода (26:16:3). Элюаты, содержащие 2''-O-рамнозид витексина, упаривают под вакуумом, остаток смешивают с дистиллированной водой, нагревают, а затем помещают в холодильник на 2 ч. По истечении этого времени производят отбор надосадочной жидкости, добавляют ацетон и промывают образовавшийся осадок (2''-O-рамнозид витексина). Получают 1,2 г целевого вещества с выходом 1,2% от массы воздушно-сухого сырья и степенью чистоты 99,5%.

Химическая структура 2''-O-рамнозид витексина представлена на фигуре 1.

Спектральные и физико-химические свойства 2''-O-рамнозид витексина. Светло-желтый кристаллический порошок состава С₂₇Н₃₀О₁₄ с т. пл. 213-215°С; УФ-спектр: λ_max^EtOH - 272 и 334 нм.

¹Н-ЯМР спектр (300 МГц, ДМСО-d₆, δ, м.д., J/Гц): 1.70 (3Н, с, СН₃ рамнозы), 3,2-5,25 (10Н сахаров), 5,22 (1Н, д, 7 Гц, Н-1¹¹ глюкопиранозы), 5,33 (1Н, уш. с, Н-1¹¹¹ рамнопиранозы), 6,25 (1Н, с, Н-6), 6,83 (1Н, с, Н-3), 6,92 (2Н, д, 9 Гц, Н-3¹ и Н-5¹), 8,21 (2Н, д, 9 Гц, Н-2¹ и Н-6¹), 10,37 (1Н, уш. с, ОН-группа при С-4¹), 11,03 (1Н, уш. с, ОН-группа при С-7), 13,21 (1Н, с, 5-ОН группы).

¹³С-ЯМР спектр (50 МГц, ДМСО-d₆, δ_С, м.д.): С-4 (182,05), С-2 (169,22), С-7 (164,05), С-4¹ (162,08, С-5 (161,23), С-9 (156,44), С-2¹ (129,04), С-6¹ (129,04), С-1¹ (121,58), С-3¹ (116,21), С-5¹ (115,80), С-1¹¹¹ рамнозы (103,98), C-1¹¹ глюкозы (102,47), С-5¹¹ (97,81), С-3¹¹¹ (82,02), С-3¹¹ (82,02), С-2¹¹ (75,68), С-2¹¹¹ (72,52), С-4¹¹ (70,93), С-5¹¹¹ (70,46), С-6¹¹ (60,99), СН₃ (20,44).

Масс-спектр (ESI-MS, 180°С, m/z): М⁺ 579 (578+Н), М⁺ 601 (578+Na), М⁺ 617 (578+K).

2''-O-рамнозид витексина, полученный разработанным способом, исследовали на наличие диуретической и антидепрессантной активности.

Исследования антидепрессантной активности проводили на белых беспородных крысах обоего пола массой 200-220 г. Животные содержались в условиях вивария на обычном рационе при свободном доступе к воде. Каждая группа состояла из десяти животных. Исследуемые препараты вводили внутрижелудочно через зонд в дозе 10 мг/кг. Контролем служила вода очищенная. В качестве синтетического препарата сравнения использовался амитриптилин в дозе 5 мг/кг. Все препараты вводили однократно на фоне аналогичной водной нагрузки, эксперимент проводили через 1 час после введения препарата. Исследование антидепрессантной активности проводили с использованием теста «Отчаяния» [3]. При этом в течение пяти минут фиксировали индивидуальное время активных попыток животных выбраться из воды. Полученные данные обрабатывали статистически по критерию Манна-Уитни. Результаты исследования влияния препаратов боярышника кроваво-красного и препарата сравнения амитриптилина на двигательную активность крыс в методике теста «Отчаяние» представлены в таблице 1.

Исходя из полученных результатов можно сделать вывод, что 2''-O-рамнозид витексина в дозе 10 мг/кг при однократном внутрижелудочном введении способствовал повышению двигательной активности животных в опытной группе на 24% по отношению к водному контролю, несколько уступая введенному внутрижелудочно амитриптилину в пороговой дозе 5 мг/кг, который способствовал повышению двигательной активности животных на 54% по отношению к контролю.

Наличие диуретической активности 2''-O-рамнозид витексина в дозе 10 мг/кг определяли в хронических экспериментах [4, 5, 6]. Препаратом сравнения для 4-х часовых экспериментов стал коротко действующий, с коротким латентным периодом, диуретик фуросемид в пороговой дозе 1 мг/кг, сравнения для 24-х часовых экспериментов стал длительно действующий, с длинным латентным периодом, диуретик гипотиазид в эффективной средней терапевтической дозе 20 мг/кг. Исследования проводили на белых беспородных крысах массой 200-220 г. Животные содержались в условиях вивария на обычном рационе при свободном доступе к воде. Каждая группа состояла из десяти животных. Препараты вводили внутрижелудочно через зонд. Контролем служила вода очищенная. В день эксперимента животным контрольной группы вводилась 3% водная нагрузка, а опытным - внутрижелудочно лекарственный препарат на фоне аналогичной водной нагрузки. Животные помещались в обменные клетки. Собирались соответственно 4-х и 24-х часовые порции мочи. Определялась почечная экскреция воды, регистрировалась концентрация натрия и калия методом пламенной фотометрии на пламенном анализаторе жидкости ПАЖ-1, креатинина-колориметрическим методом на фотоколориметре КФК-3.

Результаты оценки влияния 2''-O-рамнозид витексина в дозе 10 мг/кг на фоне 3% водной нагрузки на экскреторную функцию крыс за 4 ч эксперимента отражены в таблице 2.

Из представленных результатов видно, что за 4 ч эксперимента 2''-O-рамнозид витексина в дозе 10 мг/кг при однократном внутрижелудочном введении способствовало достоверному повышению диуреза (на 57%), натрийуреза (на 65%) и калийуреза (на 42%) в опытной группе по отношению к контролю, превосходя по силе диуреза и салуреза препарат сравнения фуросемид в пороговой дозе 1 мг/кг, введенный внутрижелудочно. При этом препарат сравнения Фуросемид в пороговой дозе 1 мг/кг при внутрижелудочном введении способствовал достоверному повышению диуреза (на 23%), натрийуреза (на 31%) в опытной группе по отношению к контролю за 4 часа опыта.

Результаты оценки влияния 2''-O-рамнозид витексина в дозе 10 мг/кг на фоне 3% водной нагрузки на экскреторную функцию крыс за 24 ч эксперимента отражены в таблице 3.

Из представленных результатов видно, что за 24 ч эксперимента 2''-O-рамнозид витексина в дозе 10 мг/кг при однократном внутрижелудочном введении способствовало достоверному изолированному повышению натрийуреза (на 38%) в опытной группе по отношению к контролю. При этом препарат сравнения Гипотиазид в средней терапевтической дозе 20 мг/кг при однократном внутрижелудочном введении способствовал достоверному повышению диуреза (на 40%), натрийуреза (на 54%), калийуреза (на 55%) в опытной группе по отношению к контролю за 24 часа опыта.

Таким образом, предлагаемый способ получения

2''-O-рамнозид витексина из листьев боярышника кроваво-красного методом колоночной хроматографии разработан впервые для данного вида сырья и обладает следующими преимуществами:

1. Разработанный способ позволяет получать более высокий выход вещества 2''-O-рамнозид витексина - 1,2% вместо 0,05% у прототипа, то есть в 24 раза выше по сравнению с прототипом.

2. Разработанный способ менее трудоемок, поскольку включает однократную хроматографическую очистку на силикагеле с использование элюента, представляющего собой смесь двух растворителей (хлороформ и этиловый спирт) вместо трехкратной хроматографической очистки в прототипе с использование различных сорбентов и элюента, представляющего собой смесь сложных систем растворителей.

3. Целевой продукт (2''-O-рамнозид витексина), полученный разработанным способом, обладает диуретической и антидепрессантной активностью.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ:

1. Куркин В.А. Основы фитотерапии: учебное пособие. - Самара: ООО «Офорт»; ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава», 2009. - 963 с.

2. Ye An, Chaoshen Zhang, Yang Du et all. Comparative excretion of vitexin-2''-O-rhamnoside in mice after oral and intravenous administration. African Journal of Pharmacy and Pharmacology. 2016, vol. 6(26), pp. 1927-1932.

3. Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под ред. Р.У. Хабриева. - 2-е изд., перераб. и доп. М.: ОАО Издательство «Медицина», 2005. - 832 с.

4. Берхин Е.Б. Методы экспериментального исследования почек и водно-солевого обмена. Барнаул.: Омская правда, 1972. 200 с.

5. Зайцева Е.Н., Зайцев А.Р., Дубищев А.В. Устройство для введения водной нагрузки лабораторным животным. Патент на ПМ 115651 Рос. Федерация. №2011138631/13; заявл. 20.09.11; опубл. 10.05.12, Бюл. №13. 2 с.

6. Зайцева Е.Н. Способ получения диуреза у лабораторных животных: патент на изобретение 2494703 Рос. Федерация. №2012104057/13; заявл. 06.02.12; опубл. 10.10.13, Бюл. №28. 11 с.