Результат интеллектуальной деятельности: ПРИМЕНЕНИЕ КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ МЕЛАНОМЫ КОЖИ ЧЕЛОВЕКА 388mel

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии, а именно, к применению полученной новой клеточной линии меланомы человека 388mel, используемой для клеточных технологий в медицине, среди которых создание противоопухолевых вакцин, диагностических наборов, тест-систем с целью разработки новых лекарственных средств и новых терапевтических подходов, тестирование эффективности различных фармацевтических препаратов.

Культивирование клеток и тканей животных к настоящему времени получило широкое распространение в клеточной, молекулярной биологии, биотехнологии и медицине. Метод культуры клеток имеет два основных преимущества: возможность очень точного контроля физико-химических свойств окружения и физиологических условий (Freshney R.I. Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications / R.I. Freswhney. - 6th ed., 2010. - John Wiley - Sons, Inc., Hoboken, New Jersey, USA. - 732p). Благодаря культивированию опухолевых клеток создаются возможности получать неограниченное количество клеток для любых исследований, это способствует снижению количества используемых в экспериментах животных. Кроме того, количественный анализ легко осуществим, так как существует высокая повторяемость и воспроизводимость результатов. Существование банков постоянных линий опухолевых клеток дает возможность проводить исследования на идентичном материале, что важно для выработки стандартных подходов к решению ряда проблем в биологии и медицине. Каждая полученная клеточная линия имеет индивидуальные неповторяющиеся свойства и характеристики, так как является продуктом, полученным из биологического материала конкретного индивидуума. Происхождение, история и чистота культуры клеток могут быть легко проверены на аутентичность и документированы. Опухолевые клеточные линии служат объектами для экспериментальных исследований и создания принципиально новых методов лечения.

В настоящее время проблема борьбы со злокачественными новообразованиями является одной из ведущих в медицине. Высокие уровни заболеваемости и смертности, трудности диагностики, недостаточно удовлетворительные непосредственные и отдаленные результаты лечения больных с некоторыми формами опухолей ставят сложные задачи по разработке новых диагностических и лечебных подходов. Последние десятилетия частота возникновения меланомы кожи значительно увеличилась и продолжает неуклонно возрастать. Среднегодовой темп прироста заболеваемости этой опухолью в мире составляет около 5% (в США - 4%, в России - 3,9%) и может считаться одним из самых высоких среди всех злокачественных опухолей после рака легкого. Согласно современным статистическим данным в России численность контингента больных меланомой кожи на 100000 населения увеличилась за последние 10 лет с 39,7 до 59,3 (Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой Состояние онкологической помощи населению России в 2016 году. - М.: МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России, 2017. - илл. - 236 с. ISBN 978-5-85502-231-5).

В последние годы благодаря успехам, достигнутым в области иммунологии и молекулярной генетики, и широкому использованию современных методов исследования эволюционировали представления о взаимоотношении опухоли и организма при меланоме. Применение принципиально новых методов лечения, основанных на клеточных технологиях, расширяет арсенал приемов воздействия на опухолевый процесс. Особенно активно разрабатываются методы биотерапии, направленные на активацию естественного противоопухолевого иммунитета, то есть методы активной специфической иммунотерапии, среди которых вакцинотерапии уделяют пристальное внимание (Martin-Liberal J., Ochoa de Olza M., Hierro C. et al. The expanding role of immunotherapy // Cancer Treat Rev. - 2017 - Vol. 54. - P. 74-86. doi: 10.1016/j.ctrv.2017.01.008).

Эффективность противоопухолевой вакцины зависит от точности определения возможных мишеней для иммунного ответа на молекулярном уровне, которыми могут являться опухолеассоциированные антигены (ОАА), выявляемые на клетках злокачественных опухолей человека и определяемые только у небольшого числа нормальных клеток. Меланома, особенно ее метастатические формы, характеризуется гистологическим разнообразием и способностью злокачественных меланоцитов менять уровень экспрессии ОАА, поэтому создание клеточных линий меланомы кожи, постоянно экспрессирующих уникальный спектр ОАА, является актуальным для разработки новых противоопухолевых вакцин (Papaioannou N.E., Beniata O.V., Vitsos P. et al. Harnessing the immune system toimprove cancer therapy // Ann Transl Med. - 2016. - Vol. 4(14). - P. 261. - doi: 10.21037/atm.2016.04.01.). В качестве активирующих агентов ОАА могут быть ассоциированы с мембранами аутологичных и аллогенных цельных, лизированных опухолевых клеток или могут быть выделены и использованы как самостоятельный продукт. В каждом случае расширение спектра клеточных линий позволяет создать более широкий пул данных антигенов, которые могут стать доступны для антигенпрезентирующих клеток (АПК), в частности для дендритных клеток (ДК) впроцессе создания противоопухолевых вакцин, что позволяет эффективно индуцировать противоопухолевый иммунитет (Tang Т., Eldabaje R., Yang L. Current Status of Biological Therapies for the Treatment of Metastatic Melanoma // Anticancer Res. - 2016. - Vol. 36(7). - P. 3229-3241)

В настоящее время уже созданы поливалентные цельноклеточные вакцины, вакцины на основе клеточных лизатов, на основе выделенных и очищенных ОАА, базирующихся на использовании нескольких клеточных линий меланомы кожи для лечения диссеминированных форм этого вида злокачественного новообразования, однако в результате проведения рандомизированных клинических испытаний их эффективность не признана достаточной (Srivatsan S., Patel J.M, Bozeman E.N. et al. Allogeneic tumor cell vaccines: the promise andlimitations in clinical trials // Hum Vaccin Immunother. - 2014. - Vol. 10(1). - P. 52-63. doi: 10.4161/hv. 26568). Поэтому по-прежнему остается актуальной проблема создания более эффективных противоопухолевых вакцин на основе ДК, активированных опухолевыми клеточными лизатами, богатыми ОАА. Для этого необходимо иметь разнообразный спектр характеризованных линий малигнизированных клеток опухолей разных локализаций. Кроме того, исследования последних лет убедительно показали, что такие ОАА, как раково-тестикулярные антигены (РТА) присутствуют в клетках многих опухолей и потенцируют противоопухолевый иммунный ответ, что дает основание к разработке универсальных подходов в клеточной иммунотерапии злокачественных новообразований (Gedye С., Quirk J., Browning J. et al. Cancer/testis antigens can be immunological targets in clonogenic CD133⁺ melanoma cells // Cancer Immunol Immunother. - 2009. - Vol. 58(10). - P. 1635-1646. doi: 10.1007/s00262-009-0672-0).

Техническим результатом изобретения является расширение арсенала клеточных линий, используемых для создания цельноклеточных и генноинженерных противоопухолевых вакцин, что дает возможность повысить эффективность лечения и увеличить продолжительность жизни при лечении злокачественных новообразований.

Кроме того, полученная новая клеточная линия может использоваться для тестирования активности различных фармацевтических препаратов, создания диагностических наборов и тест-систем для разработки новых лекарственных средств и новых терапевтических подходов.

Указанный технический результат достигается применением клеточной линии меланомы кожи человека 388mel, экспрессирующей раково-тестикулярные антигены, хранящейся в специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК (П) 728Д, для приготовления биомедицинских клеточных продуктов, тестирования противоопухолевых био- и химиопрепаратов.

Полученная клеточная линия 388mel обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками. Родословная клеточной линии 388mel представлена следующим образом.

Клеточная линия получена из метастаза опухоли в лимфатический узел больной М., 57 лет, проходившей лечение в специализированном онкологическом медицинском учреждении. Материал получен при хирургическом удалении метастатического образования. Получение клеточной линии 388mel осуществлено следующим образом.

Опухолевая ткань получена хирургическим путем. Измельченные стерильным скальпелем образцы опухоли (1-3 мм³) подвергали механической дезагрегации в автоматическом режиме в течение 30-60 сек, помещая их на стерильные ножи. Полученную суспензию клеток пропускали последовательно через стерильные нейлоновые фильтры 100 мкм, 70 мкм, 50 мкм, суспендировали в полной питательной среде и переносили в культуральную посуду, в которой осуществляли культивирование в течение длительного времени. Стабильно растущая клеточная линия была получена на 26 пассаже.

Морфологические признаки клеточной линии 388mel характеризуются следующим образом.

Культура представлена фибробластоподобными веретеновидными, полигональными и звездчатыми клетками, содержащими крупные ядра. Ядра 50% клеток дают окрашивание при постановке иммуноцитохимической реакции на маркер пролиферации Ki-67.

Маркерные признаки клеточной линии 388mel следующие.

Методом проточной цитометрии определена поверхностная экспрессия антигенов HLAA/B/C. Произведено типирование антигенов HLA I класса - А*02,32, В*38,25, С*12,03. На основании иммуноцитохимического исследования определена экспрессия дифференцировочных опухолеассоциированных антигенов - MelanA, MITF, gp100, S100, тирозиназа, TRP-1, 2.

Методом ПЦР определена экспрессия раково-тестикулярных антигенов: BAGE, GAGE 2, 3, 4, MAGE A1, А2, A3, А4, А6, А10, A12, B2, C1.

Культуральные свойства клеточной линии 388mel представлены следующим образом.

Клеточная линия культивируется в питательной среде DMEM/F12 с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки, глутамина (365 мг/л), инсулина (5 мкг/мл), трансферрина (5 мкг/мл), селена (5 нг/мл), антибиотиков (пенициллин со стрептомицином в концентрации: 100 ед/мл и 100 мкг/мл соответственно). Культивирование осуществляется при 37°С, 5% СО₂, 100% влажности. Культура имеет адгезионный монослойный тип роста. Во флаконы объемом 25 см² в 5 мл среды засевают 1×10⁶ клеток. При субкультивировании клетки снимают 1 раз в неделю в соотношении 1:1 с использованием стандартного раствора 0,25% трипсина.

Условия криоконсервации следующие.

Для длительного хранения клетки консервируют путем замораживания в жидком азоте. Криосреда: DMEM/F12 50%), эмбриональная телячья сыворотка 40%, DMSO 10%, 3×10⁶ клеток/мл на ампулу. Клетки клеточной линии ресуспендируют в среде для замораживания. Режим замораживания: жидкий азот, снижение температуры на 1°С в минуту до -25°С, затем быстрое замораживание до минус 70°С. Хранение в жидком азоте при температуре -196°С. Размораживание быстрое, при 37°С. Клетки разводят в 10 мл бессывороточной среды и осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды, содержащей 20% эмбриональной телячьей сыворотки, и переносят в культуральный флакон объемом 25 см². Жизнеспособность клеток оценивают по включению трипанового синего. Жизнеспособность клеток после криоконсервация составляет 87%. Контаминация исследована следующим образом.

При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Иммунофлуоресцентный тест на микоплазму отрицателен. Кариологическая характеристика клеточной линии 388mel следующая:

66, XX, +1, +2, +del (3)(q13.2), +4, +del (4)(q21), +t (4; 5); +6, +7, +8, -10, +t (4; 10), +11, +13, -14, +15, +16, -17, +18, +19, +t (9; 19), +t (14; 20), +21, +21p+, +22.

Использование клеточной линии 388mel представлено следующими примерами.

Пример 1. Использование клеточной линии 388mel для приготовления противоопухолевых вакцин на основе активированных дендритных клеток.

1. Клеточную линию 388mel культивировали в пластиковых флаконах в полной питательной среде DMEM/F12 с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки, глутамина (365 мг/л), инсулина (5 мкг/мл), трансферрина (5 мкг/мл), селена (5 нг/мл), пенициллина (100 ед/мл), стрептомицина (100 мкг/мл). Культивирование осуществляли при 37°С, 5% CO₂, 100% влажности в CO₂-инкубаторе «Heracel» (TermoElectronLTDGmbH, Германия).

2. При достижении конфлюэнтного монослоя производили пересев клеток и дальнейшее пассирование культуры с рассевом 1:1.

3. Из флакона удаляли культуральную среду, омывали поверхность флакона небольшим количеством ферментативного раствора (0,25% трипсина и 0,02% раствора версена в равных пропорциях) и затем к клеткам добавляли 1-3 мл этого раствора. Помещали флаконы в СО₂-инкубатор и проводили визуальный контроль состояния клеток.

4. Клетки собирали серологической пипеткой, отмывали двукратным центрифугированием в 10 мл 0,9% физиологического раствора при 1000 об/мин в течение 10 мин.

5. Производили подсчет клеток и оценку их жизнеспособности.

6. Для приготовления опухолевого лизата клетки линии 388mel смешивали в равных пропорциях с клетками других опухолевых клеточных линий и проводили 6 последовательных циклов моментального замораживания до -196°С и оттаивания до комнатной температуры в фосфатно-солевом буфере без криопротектора, качество лизиса контролировали с помощью 0,1% трипанового синего и светового микроскопа.

7. Осуществляли осаждение клеточного детрита центрифугированием (10 мин, 3000 об/мин), фильтрацию надосадочной фракции через фильтр 0,2 мкм и расфасовку опухолевого лизата в криопробирки для хранения при -20°С до использования.

8. Вносили лизат с клеточной линией 388mel в культуры незрелых дендритных клеток пациентов на 5-й день культивирования в соотношении 3 лизированные опухолевые клетки: 1 ДК, добавляли ростовые факторы: гранулоцитарно-макрофагальный фактор роста (72 нг/мл), интерлейкин 4 (20 нг/мл) и фактор некроза опухолей альфа (20 нг/мл). Инкубировали в условиях 37°С, 5% CO₂, 100% влажности в CO₂-инкубаторе «Heracel» (TermoElectronLTDGmbH, Германия) в течение 48 часов.

9. В результате получали активированные ДК с иммунофенотипом

CD14^-/CD1a^-/CD83⁺/CD80⁺/CD86⁺/HLADR⁺/CD209⁺/CCR7⁺.

Пример 2. Использование клеточной линии 388mel для создания модельной системы, позволяющей оценить параметры миграции ДК.

1. Клеточную линию 388mel культивировали, как описывается выше. После пересева клетки собирали, осуществляли подсчет их количества, оценку жизнеспособности и высевали в одну из лунок двухлуночных инсертов (Ibidi, США) в концентрации 3×10⁵ кл/мл на 70 мкл полной питательной среды.

2. В другую лунку двухлуночных инсертов высаживали аналогичное количество созревающих ДК с иммунофенотипом CD14^-CD1a⁺CD83^- в том же объеме питательной среды, содержащей 72 нг/мл GM-CSF, 15 нг/мл IL-4 и фактор некроза опухоли TNFα (20 нг/мл) (BD, США). Расстояние между популяциями клеток составляло 500 мкм.

3. После прикрепления клеток к субстрату удаляли инсерты, добавляли питательную среду и помещали планшеты в систему аналитического клеточного анализатора Cell-IQ (Chip-Man Technologies Ltd, Финляндия) для наблюдения методом фазового контраста в течение 22-34 часов.

4. Для количественной оценки миграции ДК создавали специальный протокол на основе библиотеки различных типов клеточных образов, который использовали для качественного и количественного анализа изображений перемещающихся клеток в режиме реального времени.

5. В результате наблюдения за подвижностью ДК оценили следующие параметры траекторий незрелых ДК, кокультивируемых с клеточной линией 388mel: длина траектории составила 1345,2±39,34 мкм; пройденная дистанция - 168,0±18,0 мкм; средняя скорость прохождения траектории - 52,4±1,63 мкм/ч; угол движения популяции ДК - 333,6±8,54°.

Заявляемый способ расширяет арсенал клеточных линий, используемых для создания цельноклеточных и генноинженерных противоопухолевых вакцин, способствует повышению эффективности лечения и увеличению продолжительность жизни пациентов при лечении злокачественных новообразований. Полученная новая клеточная линия 388mel может использоваться для создания противоопухолевых вакцин, диагностических наборов, тест-систем с целью разработки новых лекарственных средств и новых терапевтических подходов, для тестирования эффективности различных фармацевтических препаратов.