Конъюгаты "антитело - лекарственное средство" с высокой лекарственной нагрузкой

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка притязает на приоритет предварительных заявок на патенты США №№61/984,645, поданной 25 апреля 2014 г., 62/028,731, поданной 24 июля 2014 г., 62/103,999, поданной 15 января 2015 г., и 62/147,293, поданной 14 апреля 2015 г., и, таким образом, все из них полностью включены сюда посредством ссылки.

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Данная заявка подана в электронном виде через EFS-Web и содержит представленный в электронном виде перечень последовательностей в формате txt. txt-файл содержит перечень последовательностей, назван «PC7207805SEQLISTING_ST25.txt», создан 9 апреля 2015 г. и имеет размер 9 КБ. Перечень последовательностей, представленный в этом txt-файле, является частью описания и полностью включен сюда посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится большей частью к опосредованным трансглутаминазой конъюгатам «антитело - лекарственное средство» с высоким соотношением лекарственного средства к антителу (DAR), содержащим: (1) содержащие глутамин метки, эндогенные глутамины и/или эндогенные глутамины, сделанные реакционно-способными посредством конструирования антител или конструированной трансглутаминазы (например, с измененной субстратной специфичностью); и (2) агенты-доноры аминов, содержащие единицы-доноры аминов, линкеры и группировки-агенты. Изобретение также относится к способам получения и способам применения таких конъюгатов «антитело - лекарственное средство».

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Терапия антителами обеспечивает направленное терапевтическое лечение у пациентов с различными расстройствами, такими как рак и иммунологические заболевания, и, таким образом, играет важную роль в биологических исследованиях. Исследованы различные способы направленной терапии антителами, включая конъюгаты «антитело - лекарственное средство» (ADC). См., например, Doronina et al., Bioconj. Chem. 19: 1960-1963 (2008); и Junutula et al., Nat. Biotechnol. 26: 925-932 (2008).

В случае конъюгатов «антитело - лекарственное средство» (то есть иммуноконъюгатов) малые цитотоксические молекулы (лекарственные средства) обычно связаны или конъюгированы с антителами для направленной местной доставки лекарственных группировок в опухоли. Традиционные способы конъюгирования для получения ADC включают химическую модификацию либо через амины лизиновых боковых цепей, либо через цистеиновые сульфгидрильные группы, активированные посредством восстановления межцепочечных дисульфидных связей. ADCETRIS^® (брентуксимаб ведотин) и KADCYLA^® (адо-трастузумаб эмтанзин) являются двумя примерами ADC, полученных с применением этих традиционных способов. См., например, Tanaka et al., FEBS Letters 579: 2092-2096 (2005); и Strop, Bioconj. Chem., (в печати) (2014). При применении традиционных способов конъюгирования ADC есть тенденция к получению разнородных смесей с варьирующим числом лекарственных средств, присоединенных в неспецифических положениях, с варьирующими профилями безопасности, эффективностью и показателями клиренса. См., например, Wang et al., Protein Sci. 14: 2436-2446 (2005); и Firer, Gellerman, J. of Hematology & Oncology, 5:70 (2012). Согласно сообщениям, ADC с двумя-четырьмя лекарственными средствами на антитело обычно превосходят конъюгаты с более высокой лекарственной нагрузкой (например, с более чем четырьмя лекарственными средствами на антитело) по эффективности, переносимости и фармакокинетике in vivo, что приводит к более высокому терапевтическому индексу. См., например, Hamblett et al., Clinical Cancer Research, 10: 7063-7070 (2004).

Недавно были также исследованы ферментативные способы с использованием трансглутаминазы для получения конъюгатов «антитело - лекарственное средство». Трансглутаминазы (ЕС2.3.2.13; протеин-глутаминтамма-глутамилтрансфераза; протеин-глутамин : амин-γ-глутамилтрансфераза; CAS 80146-85-6) принадлежат к семейству ферментов, катализирующих присоединение ацила к первичному амину, где гамма-карбоксамидная группа связанного с пептидом γ-глутамильного остатка является донором ацила и первичный амин является акцептором ацила и донором амина. Конъюгирование антитела и лекарственного средства с использованием трансглутаминазы обеспечивает преимущества высокой селективности, упрощенных методик взаимодействия и мягких условий взаимодействия. См., например, Strop et al., Chemistry & Biology, 20: 161-167 (2013); и Farias et al., Bioconj. Chem. 25(2): 240-250 (2014). В US 2013/0230543 и US 2013/0122020 описано опосредованное трансглутаминазой сайт-специфичное конъюгирование антител и малых молекул.

Все процитированные здесь публикации, патенты и заявки на патенты тем самым полностью включены сюда посредством ссылки для любых задач, в такой же степени, как если бы было конкретно и по отдельности указано, что каждая отдельная публикация, патент и заявка на патент включены таким образом посредством ссылки. В случае, если один или более из включенных литературных источников и аналогичных материалов отличается от данной заявки или противоречит ей, включая, без ограничения, определенные термины, использование терминов, описанные методики или тому подобное, данная заявка имеет преимущество.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится большей частью к опосредованным трансглутаминазой сайт-специфичным конъюгатам «антитело - лекарственное средство» (ADC) с высоким соотношением лекарственного средства к антителу (DAR), содержащим: (1) содержащие глутамин метки, эндогенные глутамины (то есть нативные глутамины без конструирования, такие как глутамины в вариабельных доменах, CDR (областях, определяющих комплементарность) и так далее) и/или эндогенные глутамины, сделанные реакционно-способными посредством конструирования антител или конструированной трансглутаминазы (например, с измененной субстратной специфичностью); и (2) агенты-доноры аминов, содержащие единицы-доноры аминов, линкеры и группировки-агенты. Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что эти сайт-специфичные ADC с повышенной лекарственной нагрузкой (например, с DAR по меньшей мере 5 или выше) имеют более высокую активность in vivo и меньшую неспецифическую цитотоксичность in vitro по сравнению с традиционными ADC с повышенной лекарственной нагрузкой, в которых использована малеимидная связь. Авторы изобретения также обнаружили, что эти сайт-специфичные ADC с повышенной лекарственной нагрузкой (1) имеют фармакокинетические профили, сходные с неконъюгированным антителом дикого типа, у мышей и улучшенные фармакокинетические профили у крыс и (2) сохраняют сопоставимый профиль безопасности с таковым для традиционных ADC со сходной нагрузкой.

В одном аспекте согласно данному изобретению предложен ADC, содержащий формулу антитело-(Т-(Х-Y-Z_a)_b)_c, где: Т представляет собой (1) конструированную сайт-специфичную содержащую глутамин метку, (2) эндогенный глутамин и/или (3) эндогенный глутамин, сделанный реакционно-способным посредством конструирования антитела или конструированной трансглутаминазы; X представляет собой единицу-донор амина; Y представляет собой линкер; и Z представляет собой группировку-агент; X-Y-Z представляет собой агент-донор амина, конъюгированный сайт-специфичным образом с содержащей глутамин меткой, эндогенным глутамином или реакционно-способным эндогенным глутамином; а представляет собой целое число от 1 до 6; b представляет собой целое число от 1 до 6; с представляет собой целое число от 1 до 20; и где произведение a, b и с (соотношение лекарственного средства к антителу) составляет по меньшей мере приблизительно 5.

В некоторых воплощениях Т в антитело-(Т-(Х-Y-Z_a)_b)_c содержит по меньшей мере 1 эндогенный глутамин (например, нативный или реакционно-способный эндогенный глутамин). В некоторых воплощениях реакционно-способный эндогенный глутамин сделан реакционно-способным посредством дегликозилирования (например, ферментативного дегликозилирования) или посредством аминокислотной модификации другой аминокислоты антитела (например, аминокислотной заменой в положении 297, такой как N297Q или N297A (схема нумерации EU).

В некоторых воплощениях антитело в ADC по настоящему изобретению (например, опосредованных трансглутаминазой ADC с повышенной лекарственной нагрузкой) дополнительно содержит вторую аминокислотную модификацию в положениях K222, K340 и/или K370 (например, K222R, K340R и/или K370R).

В некоторых воплощениях агент-донор амина (X-Y-Z) в ADC конъюгирован сайт-специфичным образом с содержащей глутамин меткой в по меньшей мере одном или более чем одном положении, выбранном из группы, состоящей из: (1) карбоксильного конца любой из легкой цепи, тяжелой цепи или как легкой цепи, так и тяжелой цепи; (2) амино-конца любой из легкой цепи, тяжелой цепи или как легкой цепи, так и тяжелой цепи; и (3) S60-R61, R108, Т135, S160, S168, S190-S192, P189-S192, G200-S202, K222-Т225, K222-Т223, Т223, L251-S254, M252-I253, E294-N297, E293-N297, N297 и/или G385 (например, как перечислено в Таблице 1); где содержащая глутамин метка введена в антитело или заменяет одну или более чем одну эндогенную аминокислоту антитела.

В некоторых воплощениях ADC по настоящему изобретению содержит: (а) аминокислотные замены в положениях N297Q и K222R, где агент-донор амина (X-Y-Z) конъюгирован сайт-специфичным образом с эндогенным глутамином в положении 295 и замененным глутамином в положении 297; и (б) одну или более чем одну содержащую глутамин метку, где агент-донор амина конъюгирован сайт-специфичным образом с содержащей(ими) глутамин меткой(ами) на карбоксильном конце легкой цепи антитела; где соотношение лекарственного средства к антителу составляет приблизительно 5-7. В некоторых воплощениях агент-донор амина также конъюгирован сайт-специфичным образом с содержащей глутамин меткой в одном или более чем одном положении, выбранном из группы, состоящей из S60-R61, R108, Т135, S160, S168, S190-S192, P189-S192, G200-S202, K222-Т225, K222-Т223, Т223, L251-S254, M252-I253, E294-N297, E293-N297, N297 и G385 (например, как перечислено в Таблице 1), где содержащая глутамин метка введена в антитело или заменяет одну или более чем одну эндогенную аминокислоту антитела, и где соотношение лекарственного средства к антителу составляет по меньшей мере приблизительно 6. Например, в некоторых воплощениях агент-донор амина также конъюгирован сайт-специфичным образом с содержащей глутамин меткой, введенной после аминокислотного положения Т135 тяжелой цепи антитела, где соотношение лекарственного средства к антителу составляет приблизительно 6-9. В других воплощениях агент-донор амина также конъюгирован сайт-специфичным образом с содержащей глутамин меткой в аминокислотных положениях G200-S202 легкой цепи антитела, где эндогенные аминокислотные остатки заменены содержащей глутамин меткой, и где соотношение лекарственного средства к антителу составляет приблизительно 6-11.

В некоторых воплощениях ADC по настоящему изобретению содержит агент-донор амина, конъюгированный сайт-специфичным образом с содержащей глутамин меткой (а) на карбоксильном конце легкой цепи антитела, (б) после аминокислотного положения Т135 тяжелой цепи антитела и (в) в аминокислотных положениях G200-S202 легкой цепи антитела, где эндогенные аминокислотные остатки заменены содержащей глутамин меткой, и где соотношение лекарственного средства к антителу составляет приблизительно 5-7.

В некоторых воплощениях агент-донор амина (X-Y-Z) выбран из группы, состоящей из Alexa488 кадаверина, 5-FITC (флуоресцеин изотиоцианат) кадаверина, Alexa 647 кадаверина, Alexa 350 кадаверина, 5-TAMRA (карбокситетраметилродамин) кадаверина, 5-FAM (5-карбоксифлуоресцеин) кадаверина, SR101 (сульфородамин 101) кадаверина, 5,6-TAMRA кадаверина, 5-FAM лизина, Ас-Lys-Gly(ацетил-лизин-глицин)-MMAD (монометилауристатин D), амино-PEG3(полиэтиленгликоль 3)-C2-MMAD, амино-PEG6-C2-MMAD, амино-PEG3-С2-аминононаноил-MMAD, аминокапроил-Val-Cit-РАВС(п-аминобензилоксикарбонил)-MMAD, амино-PEG3-C2-Val-Cit-PABC-MMAD, амино-PEG6-C2-Val-Cit-PABC-MMAD, Ac-Lys-Val-Cit-PABC (ацетил-лизин-валин-цитруллин-п-аминобензилоксикарбонил)-MMAD, аминокапроил-MMAD, Ac-Lys-β-Ala-MMAD, амино-PEG2-С2-ММАЕ (монометилауристатин E), аминокапроил-ММАЕ, амино-PEG3-C2-MMAE, аминокапроил-MMAF (монометилауристатин F), аминокапроил-Val-Cit-PABC-MMAE, амино-PEG-6-C2-Val-Cit-PABC-MMAE, Ac-Lys-Val-Cit-PABC-MMAE, аминокапроил-Val-Cit-PABC-MMAF, амино-PEG-6-C2-Val-Cit-PABC-MMAF, Ac-Lys-Val-Cit-PABC-MMAF, амино-PEG6-C2-Val-Cit-PABC-0101, Ac-Lys-Val-Cit-PABC-0101, путресцинилгелданамицина, Ac-Lys-путресцинилгелданамицина, аминокапроил-3377, амино-PEG6-C2-3377, аминокапроил-0131, амино-PEG6-С2-0131, [(3R,5R)-1-{3-[2-(2-аминоэтокси)этокси]пропаноил}пиперидин-3,5-диил]бис-Val-Cit-РАВС-MMAD, [(3R,5R)-1-{3-[2-(2-аминоэтокси)этокси]пропаноил}пиперидин-3,5-диил]бис-Val-Cit-РАВС-ММАЕ, 2-аминоэтокси-PEG6-NODAGA и N-2-ацетил-L-лизил-L-валил-N~5~-карбамоил-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-8-гидрокси-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-гидроксипент-2-еноил]амино}-3,6-диметилтетрагидро-2Н-пиран-2-ил]-3-метилпента-1,3-диен-1-ил}-1,6-диоксаспиро[2.5]окт-5-ил]ацетил}гидразинил)карбонил]окси}метил)фенил]-L-орнитинамида. В некоторых воплощениях агент-донор амина представляет собой биологически совместимый полимер, содержащий реакционно-способный амин и группировку-агент.

В некоторых воплощениях структура «единица-донор амина - линкер» (X-Y) является линейной или разветвленной. В некоторых воплощениях структура X-Y выбрана из группы, состоящей из Ac-Lys-Gly, аминокапроновой кислоты, Ac-Lys-β-Ala, амино-PEG2-C2, амино-PEG3-С2, амино-PEG6-C2, Ac-Lys-Val-Cit-PABC, амино-PEG6-C2-Val-Cit-PABC, аминокапроил-Val-Cit-PABC, [(3R,5R)-1-{3-[2-(2-аминоэтокси)этокси]пропаноил}пиперидин-3,5-диил]бис-Val-Cit-PABC, [(3S,5S)-1-{3-[2-(2-аминоэтокси)этокси]пропаноил}пиперидин-3,5-диил]бис-Val-Cit-РАВС, путресцина и Ac-Lys-путресцин.

В некоторых воплощениях группировка-агент (Z) представляет собой цитотоксический агент, выбранный из группы, состоящей из антрациклина, ауристатина, камптотецина, комбретастатина, доластатина, дуокармицина, энедиина, гелданамицина, индолинобензодиазепинового димера, майтансина, пуромицина, пирролобензодиазепинового димера, таксана, алкалоида барвинка, тубулизина, гемиастерлина, сплайсостатина, пладиенолида и их стереоизомеров, изостеров, аналогов или производных.

В другом аспекте согласно изобретению предложена фармацевтическая композиция, содержащая совокупность ADC с повышенной лекарственной нагрузкой, как описано здесь, где среднее соотношение лекарственного средства к антителу составляет по меньшей мере приблизительно 5,0. В одном варианте здесь предложена фармацевтическая композиция, содержащая совокупность ADC, где по меньшей мере один ADC представляет собой ADC с повышенной лекарственной нагрузкой, как описано здесь, и где среднее соотношение лекарственного средства к антителу составляет по меньшей мере приблизительно 4,1. В другом варианте согласно изобретению предложена фармацевтическая композиция, содержащая ADC с повышенной лекарственной нагрузкой, как описано здесь, и фармацевтически приемлемый эксципиент.

В другом аспекте согласно изобретению предложен способ получения ADC, как описано здесь, включающий стадии на которых: (а) берут молекулу антитело-Т, которая содержит антитело и содержащую глутамин метку, антитело с эндогенным глутамином и/или антитело с реакционно-способным эндогенным глутамином; (б) приводят агент-донор амина, содержащий единицу-донор амина, линкер и группировку-агент (X-Y-Z), в контакт с молекулой антитело-Т в присутствии трансглутаминазы; и (в) обеспечивают возможность антителу-Т ковалентно связываться с агентом-донором амина с образованием конъюгата «антитело - лекарственное средство». В некоторых воплощениях эффективность конъюгирования составляет по меньшей мере приблизительно 51%.

В некоторых воплощениях предложенные здесь способы дополнительно включают стадию очистки, где ADC очищают посредством хроматографии.

В некоторых воплощениях трансглутаминаза представляет собой микробную, очищенную или конструированную трансглутаминазу.

В другом аспекте согласно изобретению предложен способ лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей ADC, как описано здесь.

В другом аспекте согласно изобретению предложен способ ингибирования роста или прогрессирования опухоли у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей ADC, как описано здесь.

В другом аспекте согласно изобретению предложен способ диагностики рака у субъекта, у которого подозревают рак, включающий (а) приведение образца от субъекта в контакт с ADC, как описано здесь, в условиях, приводящих к связыванию ADC с раковым белком, и (б) определение наличия связывания ADC с раковым белком.

В некоторых воплощениях антитело в ADC, как описано здесь, представляет собой моноклональное антитело, поликлональное антитело, человеческое антитело, гуманизированное антитело, химерное антитело, биспецифичное антитело, минитело, диатело или фрагмент антитела.

В некоторых воплощениях содержащая глутамин метка в ADC, как описано здесь, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из Q, LQG, LLQGG (SEQ ID NO: 1), LLQG (SEQ ID NO: 2), LSLSQG (SEQ ID NO: 3), GGGLLQGG (SEQ ID NO: 4), GLLQG (SEQ ID NO: 5), LLQ, GSPLAQSHGG (SEQ ID NO: 6), GLLQGGG (SEQ ID NO: 7), GLLQGG (SEQ ID NO: 8), GLLQ (SEQ ID NO: 9), LLQLLQGA (SEQ ID NO: 10), LLQGA (SEQ ID NO: 11), LLQYQGA (SEQ ID NO: 12), LLQGSG (SEQ ID NO: 13), LLQYQG (SEQ ID NO: 14), LLQLLQG (SEQ ID NO: 15), SLLQG (SEQ ID NO: 16), LLQLQ (SEQ ID NO: 17), LLQLLQ (SEQ ID NO: 18), LLQGR (SEQ ID NO: 19), LLQGPP (SEQ ID NO: 20), LLQGPA (SEQ ID NO: 21), GGLLQGPP (SEQ ID NO: 22), GGLLQGA (SEQ ID NO: 23), LLQGPGK (SEQ ID NO: 25), LLQGPG (SEQ ID NO: 26), LLQGP (SEQ ID NO: 27), LLQP (SEQ ID NO: 28), LLQPGK (SEQ ID NO: 29), LLQAPGK (SEQ ID NO: 30), LLQGAPG (SEQ ID NO: 31), LLQGAP (SEQ ID NO: 32) и LLQLQG (SEQ ID NO: 36).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг. 1 показана цитотоксичность сайт-специфичных ADC с возрастающими DAR в клетках ВхРС3 с высоким уровнем экспрессии мишени в сравнении с ADC с DAR 7,2, конъюгированными традиционным способом. m7E6 представляет собой антитело против Trop2 (антиген поверхности клеток трофобласта 2 (trophoblast cell-surface antigen 2), также известный как M1S1, GA733-1, EGP-1 или TACSTD2); Н7с, L11b, TG6 и LCQ04 обозначают содержащую глутамин трансглутаминазную метку и расположение такой метки в антителе (см. Таблицу 1); N297Q обозначает аминокислотную замену N на Q в положении 297 антитела против Trop2; и K222R обозначает аминокислотную замену K на R в положении 222 антитела против Trop2; малеимидо означает традиционный способ конъюгирования посредством конъюгирования с цистеином. Эти сокращения применимы ко всем другим графическим материалам, описанным здесь.

На Фиг. 2 показана цитотоксичность сайт-специфичных ADC с возрастающими DAR в клетках Colo205 со средним уровнем экспрессии мишени в сравнении с ADC с DAR 7,2, конъюгированными традиционным способом.

На Фиг. 3 показана цитотоксичность сайт-специфичных ADC с возрастающими DAR в клетках CF-PAC1 с низким уровнем экспрессии мишени в сравнении с ADC с DAR 7,2, конъюгированными традиционным способом.

На Фиг. 4 показана неспецифическая цитотоксичность сайт-специфичных ADC с возрастающими DAR в клетках SW620 без экспрессии мишени в сравнении с ADC с DAR 7,2, конъюгированными традиционным способом.

На Фиг. 5 показана цитотоксичность сайт-специфичных ADC с повышенной нагрузкой по настоящему изобретению в клетках Colo205 с умеренной экспрессией мишени в сравнении с ADC со сходными DAR, конъюгированными традиционным способом.

На Фиг. 6 показана эффективность сайт-специфичных ADC с повышенной нагрузкой по настоящему изобретению при индуцировании долгосрочной остановки роста опухоли в ксенотрансплантационной модели Colo205 в сравнении с ADC с DAR 7,2, конъюгированными традиционным способом.

На Фиг. 7 также показана эффективность сайт-специфичных ADC с повышенной нагрузкой по настоящему изобретению при индуцировании долгосрочной остановки роста опухоли в ксенотрансплантационной модели Colo205 в сравнении с ADC со сходными DAR, конъюгированными традиционным способом.

На Фиг. 8(a)-8(h) показаны фармакокинетические профили (PK-профили) сайт-специфичных ADC с повышенной нагрузкой по настоящему изобретению у мышей и крыс в сравнении с неконъюгированным антителом дикого типа и ADC со сходными DAR, конъюгированными традиционным способом.

На Фиг. 9(а)-9(b) показаны PK-профили сайт-специфичных ADC с повышенной нагрузкой по настоящему изобретению с DAR 7,76 и 7,7 и с различными комбинациями сайтов конъюгирования у крыс.

На Фиг. 10(a)-10(d) показана токсикология ADC с повышенной нагрузкой у мышей С57В1/6. На Фиг. 10(a) показана токсикокинетика ADC с DAR 7,8, конъюгированного традиционным способом, и сайт-специфичного ADC с DAR 7,76, введенных в дозе 200 мг/кг. На Фиг. 10(b) показаны изменения массы тела мышей, которым вводили сайт-специфичные ADC с повышенной нагрузкой с DAR 5,85 и с DAR 7,71 и ADC с DAR 7,8, конъюгированный традиционным способом, в дозе 200 мг/кг. На Фиг. 10(c) и 10(d) показаны активность печеночных ферментов и клинико-патологические параметры образцов, полученных на 14 сутки от мышей, которым вводили сайт-специфичные (SS) ADC с высокой нагрузкой «DAR6» (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 амино-PEG6-С2-MMAD; DAR 5,85) и SS «DAR8» (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7 с амино-PEG6-C2-MMAD; DAR 7,76) и традиционный ADC «Cys DAR8» (m7E6 малеимидо-PEG6-C2-MMAD; DAR 7,8) в дозе 200 мг/кг. АР, AST и ALT обозначают аспартатаминотрансферазу, аланинтрансаминазу и щелочную фосфатазу, соответственно.

На Фиг. 11 показан кинетический анализ взаимодействий мишень/IgG для различных ADC, включая дикий тип (WT) (m7E6-неконъюгированное), SS DAR2 (LC) (сайт-специфичный m7E6 LCQ04 амино-PEG6-C2-MMAD), SS DAR4 (m7E6 N297Q/K222R амино-PEG6-C2-MMAD), SS DAR6 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 амино-PEG6-C2-MMAD), SS DAR8 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c амино-PEG6-C2-MMAD) и Cys DAR8 (m7E6 малеимидо-PEG6-С2-MMAD). На каждом изображении показан общий анализ данного IgG при концентрациях мишени (человеческого Trop2) 1,2, 3,7, 11, 33 и 100 нМ. Черными линиями показаны данные измерений, и красными линиями показаны общие аппроксимации; под каждым наложением графиков показаны остаточные сигналы.

На Фиг. 12(а)-12(с) показан анализ стабильности линкера и/или полезной нагрузки посредством масс-спектрометрии образцов, полученных от мышей in vivo. Показано сравнение стабильности линкера (Фиг. 12(a)), стабильности лекарственного средства (Фиг. 12(b); стабильность C-конца конъюгированного MMAD) и комбинированной стабильности структуры «линкер - лекарственное средство» (Фиг. 12(c)) для ADC с DAR 8, конъюгированного традиционным способом, и сайт-специфичных ADC с высокой нагрузкой с DAR 6 и DAR 8. «Cys DAR8» обозначает m7E6 малеимидо-PEG6-С2-MMAD; «SS DAR6» обозначает m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 амино-PEG6-C2-MMAD; и SS «DAR8_1» обозначает m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c амино-PEG6-C2-MMAD.

На Фиг. 13(a)-13(b) показана токсикокинетика ADC, конъюгированных традиционным способом («Cys DAR8»: m7E6 малеимидо-PEG6-С2-MMAD), и сайт-специфичных ADC с высокой нагрузкой с DAR6 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 амино-PEG6-C2-MMAD) и DAR8_1 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c амино-PEG6-C2-MMAD) у мышей при различных концентрациях антител и измерении в различных временных точках.

На Фиг. 14 показана цитотоксичность сайт-специфичных ADC с возрастающими DAR в клетках B×PC3 с высоким уровнем экспрессии мишени в сравнении с сайт-специфичными ADC с меньшим DAR (например, 1,96 и 3,9).

На Фиг. 15 также показана цитотоксичность сайт-специфичных ADC с возрастающими DAR в клетках Colo205 с умеренной экспрессией мишени в сравнении с сайт-специфичными ADC с меньшим DAR (например, 1,96 и 3,9).

На Фиг. 16 также показана цитотоксичность сайт-специфичных ADC с возрастающими DAR в клетках CF-PAC1 с низким уровнем экспрессии мишени в сравнении с сайт-специфичными ADC с меньшим DAR (например, 1,96 и 3,9).

На Фиг. 17 также показано отсутствие неспецифической цитотоксичности сайт-специфичных ADC с возрастающими DAR в клетках SW620 без экспрессии мишени в сравнении с сайт-специфичными ADC с меньшим DAR (например, 1,96 и 3,9).

На Фиг. 18А и 18В показана эффективность сайт-специфичных ADC с возрастающими DAR в сравнении с сайт-специфичными ADC с меньшим DAR (например, 1,9 и 3,7) in vitro в клетках L363 и MM1.S с низким и средним уровнем экспрессии мишени.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится большей частью к опосредованным трансглутаминазой сайт-специфичным конъюгатам «антитело - лекарственное средство» (ADC) с высоким соотношением лекарственного средства к антителу (DAR), содержащим: (1) содержащие глутамин метки, эндогенные глутамины (то есть нативные глутамины без конструирования, такие как глутамины в вариабельных доменах, CDR и так далее) и/или эндогенные глутамины, сделанные реакционно-способными посредством конструирования антител или конструированной трансглутаминазы; и (2) агенты-доноры аминов, содержащие единицы-доноры аминов, линкеры и группировки-агенты, где DAR составляет по меньшей мере приблизительно 5. Ранее было обнаружено, что конъюгаты «антитело - лекарственное средство», в которых использована традиционная малеимидная связь, с DAR от двух до четырех превосходят конъюгаты с более высокой нагрузкой по эффективности, переносимости и фармакокинетике in vivo, что приводит к более высокому терапевтическому индексу. Здесь описаны сайт-специфичные ADC с повышенной нагрузкой (например, с DAR по меньшей мере 5 или выше), имеющие более высокую активность in vivo и меньшую неспецифическую цитотоксичность in vitro по сравнению с традиционными ADC с повышенной нагрузкой. Однократное дозирование раскрытого здесь сайт-специфичного ADC с повышенной нагрузкой значительно превосходило традиционные ADC со сходными DAR по долгосрочной остановке роста опухоли. Кроме того, эти сайт-специфичные ADC с повышенной нагрузкой имеют фармакокинетические профили, сходные с неконъюгированным антителом дикого типа, у мышей и улучшенный PK-профиль по сравнению с традиционными ADC с повышенной нагрузкой со сходными DAR у крыс. Эти сайт-специфичные ADC с повышенной нагрузкой также сохраняют сопоставимый профиль безопасности по сравнению с традиционными ADC с эквивалентной лекарственной нагрузкой.

Соответственно, предложены сайт-специфичные ADC с повышенной нагрузкой, каждый из которых содержит формулу антитело-(Т-(Х-Y-Z_a)_b)_с, где: Т представляет собой (1) конструированную в определенном сайте содержащую глутамин метку, (2) эндогенный глутамин и/или (3) эндогенный глутамин, сделанный реакционно-способным посредством конструирования антитела или конструированной трансглутаминазы; X представляет собой единицу-донор амина; Y представляет собой линкер; и Z представляет собой группировку-агент; X-Y-Z представляет собой агент-донор амина, конъюгированный сайт-специфичным образом с содержащей глутамин меткой, эндогенным глутамином или реакционно-способным эндогенным глутамином; а представляет собой целое число от 1 до 6; b представляет собой целое число от 1 до 6; с представляет собой целое число от 1 до 20; и где произведение a, b и с (соотношение лекарственного средства к антителу) составляет по меньшей мере приблизительно 5.

Также предложены способы лечения рака, ингибирования роста или прогрессирования опухоли, ингибирования метастазирования раковых клеток или опухолей или индуцирования регресса опухоли у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей ADC, как описано здесь.

Также предложены способы получения ADC, как описано здесь, включающие стадии, на которых: (а) берут молекулу антитело-Т, которая содержит антитело и содержащую глутамин метку и/или антитело с эндогенным и/или реакционно-способным эндогенным глутамином; (б) приводят агент-донор амина в контакт с молекулой антитело-Т в присутствии трансглутаминазы; и (в) обеспечивают возможность антителу-Т ковалентно связываться с агентом-донором амина с образованием ADC. В некоторых воплощениях трансглутаминаза представляет собой конструированную трансглутаминазу.

Общие методики и определения

Если здесь не определено иное, все научные и технические термины, использованные в связи с настоящим изобретением, имеют значение, в котором их обычно понимают специалисты в данной области. Кроме того, если контекст не требует иного, формы единственного числа включают множественное число, и формы множественного числа включают единственное число. В целом, номенклатура, использованная в связи с культивированием клеток и тканей, молекулярной биологией, иммунологией, микробиологией, генетикой и химией и гибридизацией белков и нуклеиновых кислот, и соответствующие методики, описанные здесь, хорошо известны и широко применяются в данной области.

Если не указано иное, способы и методики по настоящему изобретению обычно осуществляют в соответствии с традиционными методами, хорошо известными в данной области и описанными в различных общих и более специализированных ссылках, цитируемых и обсуждаемых в настоящем описании. См., например, Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3^rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); и Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003). Ферментативные реакции и методики очистки осуществляют в соответствии с описаниями изготовителя, как это обычно делают в данной области, или как описано здесь. Номенклатура, использованная в связи с молекулярной биологией, биохимией, иммунологией, аналитической химией, синтетической органической химией и медицинской и фармацевтической химией, и соответствующие лабораторные процедуры и методики, описанные здесь, хорошо известны и широко применяются в данной области. В данном описании и формуле изобретения слово «содержать/включать» или варианты, такие как «содержит/включает» или «содержащий/включающий», следует понимать как подразумевающие включение указанного признака или группы признаков, но не исключение какого-либо другого признака или группы признаков.

При использовании здесь термин «содержащая глутамин метка», «глутаминовая метка», «Q-содержащая метка», «Q-метка» или «трансглутаминазная метка» относится к полипептиду или белку, содержащему один или более чем один остаток Gln, действующий как акцептор амина или донор ацила в трансглутаминазной реакции.

При использовании здесь термин «агент-донор амина» или «акцептор ацила» относится к агенту, содержащему один или более чем один реакционно-способный амин (например, первичный амин). Например, агент-донор амина может содержать единицу-донор амина (например, первичный амин NH₂), линкер (например, молекулу, связанную с единицей-донором амина и содержащую дополнительную функциональность для присоединения к полезной нагрузке, такой как малая молекула, полипептид или биологически совместимый полимер) и группировку-агент (например, полезную нагрузку, такую как малая молекула). Агент-донор амина может также представлять собой полипептид (например, антитело) или биологически совместимый полимер, содержащие один или более чем один реакционно-способный лизин, N-конец или реакционно-способный амин.

При использовании здесь термин «сайт-специфичность», «конъюгированный сайт-специфичным образом» или «поперечно сшитый сайт-специфичным образом» относятся к специфичному конъюгированию или поперечному сшиванию агента-донора амина с антителом в определенном сайте (например, в различных положениях, перечисленных в Таблице 1) через содержащую глутамин метку, эндогенный глутамин и/или эндогенный глутамин, сделанный реакционно-способным посредством конструирования антитела или конструированной трансглутаминазы. Сайт-специфичность можно оценить различными методиками, включая, без ограничения, масс-спектрометрию (например, масс-спектрометрии с ионизацией методом лазерной десорбции из матрицы (MALDI-MS), масс-спектрометрию с ионизацией электрораспылением (ESI-MS), тандемную масс-спектрометрию (MS-MS) и времяпролетную масс-спектрометрию (TOF-MS)), хроматографию гидрофобного взаимодействия, ионообменную хроматографию, сайт-направленный мутагенез, флуоресцентное мечение, эксклюзионную хроматографию и рентгеновскую кристаллографию.

При использовании здесь термин «эндогенный глутамин (Q), сделанный реакционно-способным», относится к эндогенному глутамину, сделанному доступным, экспонированным или реакционно-способным для агента-донора амина в присутствии трансглутаминазы посредством конструирования антитела (например, ферментативного дегликозилирования и/или аминокислотной модификации) или конструированной трансглутаминазы.

При использовании здесь термин «биологически совместимый полимер» относится к полимеру (например, повторяющимся мономерным или структурным единицам), подходящему для терапевтического или консервативного лечения реципиента (например, человека) без оказания каких-либо нежелательных местных или системных эффектов на реципиента. Биологически совместимый полимер (синтетический, рекомбинантный или нативный) может представлять собой водорастворимый или водонерастворимый полимер. Биологически совместимый полимер может также представлять собой линейный или разветвленный полимер.

При использовании здесь термин «антитело» представляет собой молекулу иммуноглобулина, способную связываться с мишенью, такой как углевод, полинуклеотид, липид, полипептид и так далее, через по меньшей мере один сайт распознавания антигена, расположенный в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. Подразумевают, что при использовании здесь, если контекстом не указано иное, данный термин охватывает не только интактные поликлональные или моноклональные антитела, но также их фрагменты (такие как Fab, Fab', F(ab')₂, Fv), одноцепочечные (ScFv) и однодоменные антитела, включая антитела акул и представителей семейства Верблюдовых, и слитые белки, содержащие часть антитела, мультивалентные антитела (например, COVX-BODY™), мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела, при условии, что они демонстрируют желаемую биологическую активность) и фрагменты антител, как описано здесь, и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, содержащую сайт распознавания антигена. Антитело включает антитело любого класса, такого как IgG, IgA или IgM (или их подкласс), и антитело не обязательно представляет собой антитело какого-либо определенного класса. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена тяжелых цепей антитела, иммуноглобулины могут быть отнесены к различным классам. Существует пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно разделены на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелых цепей, соответствующие различным классам иммуноглобулинов, названы альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю, соответственно. Субъединичные структуры и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны. В одном аспекте иммуноглобулин представляет собой иммуноглобулин человека, мыши, обезьяны или кролика.

При использовании здесь термин «Fab-содержащий полипептид» относится к полипептиду, содержащему Fab-фрагмент, Fab'-фрагмент или (Fab')₂-фрагмент. Fab-содержащий полипептид может содержать всю шарнирную последовательность дикого типа или ее часть (обычно на карбоксильном конце Fab-части полипептида). Fab-содержащий полипептид может быть получен из или иметь происхождение от любого подходящего иммуноглобулина, такого как по меньшей мере один из различных подтипов IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 или IgA, IgE, IgD или IgM. Fab-содержащий полипептид может представлять собой Fab-содержащий слитый полипептид, где один или более чем один полипептид связан с Fab-содержащим полипептидом. Слияние Fab содержит комбинацию Fab-полипептида иммуноглобулина с партнером по слиянию, который может в большинстве случаев представлять собой любой белок, полипептид или малую молекулу. Для получения Fab-содержащего слитого полипептида с Fab-полипептидом могут быть связаны практически любой белок или малая молекула. Партнеры для слияния с Fab-содержащим полипептидом могут включать, без ограничения, мишень-связывающую область рецептора, молекулу адгезии, лиганд, фермент, цитокин, хемокин или какой-либо другой белок или белковый домен.

«Fab-фрагмент» состоит из одной легкой цепи и C_H1 и вариабельных областей одной тяжелой цепи. Тяжелая цепь молекулы Fab не может образовывать дисульфидную связь с другой молекулой тяжелой цепи.

«Fab'-фрагмент» содержит одну легкую цепь и часть одной тяжелой цепи, содержащую домен V_H и домен C_H1, а также область между доменами C_H1 и C_H2, таким образом, что возможно образование межцепочечной дисульфидной связи между двумя тяжелыми цепями двух Fab'-фрагментов с получением молекулы F(ab')₂.

«F(ab')₂-фрагмент» содержит две легких цепи и две тяжелых цепи, содержащие часть константной области между доменами C_H1 и C_H2, таким образом, что между двумя тяжелыми цепями образуется межцепочечная дисульфидная связь. Таким образом, F(ab')₂-фрагмент состоит из двух Fab'-фрагментов, удерживаемых вместе дисульфидной связью между двумя тяжелыми цепями.

При использовании здесь «фрагменты антител» содержат только часть интактного антитела, предпочтительно сохраняющую по меньшей мере одну, предпочтительно большую часть или все функции, обычно связанные с этой частью, когда она представлена в интактном антителе.

«Мультиспецифичное антитело» представляет собой антитело, направленное на более чем один антиген или эпитоп. «Биспецифичное» антитело, антитело «с двойной специфичностью» или «бифункциональное» антитело представляет собой гибридное антитело, имеющее два разных антиген-связывающих сайта. Биспецифичные антитела являются разновидностью мультиспецифичных антител и могут быть получены множеством способов, включая, без ограничения, слияние гибридом, связывание Fab'-фрагментов или мутации в шарнирной области антитела или доменах C_H3. См., например, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992); и Strop et al., J. Mol. Biol. 420(3): 204-219 (2012). Два сайта связывания биспецифичного антитела будут связываться с двумя разными эпитопами, которые могут быть расположены на одном и том же или на разных белках-мишенях.

При использовании здесь термин «моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из популяции по существу однородных антител, то есть, отдельные антитела, составляющие популяцию, идентичны, за исключением возможных происходящих естественным образом мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела высокоспецифичны и направлены против одного антигена. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, обычно содержащих разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене.

В данной заявке моноклональные антитела могут, в определенных воплощениях, прямо включать «химерные» антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител, имеющих происхождение от определенного вида или принадлежащих к определенному классу или подклассу антител, в то время как остальная часть цепи(ей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител, имеющих происхождение от другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии, что они демонстрируют желаемую биологическую активность (патент США №4816567; и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)).

«Гуманизированные» формы антител, не являющихся человеческими (например, мышиных), представляют собой химерные антитела, содержащие минимальную последовательность, имеющую происхождение от иммуноглобулинов, не являющихся человеческими. В большинстве случаев гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (антитело-реципиент), в которых остатки гипервариабельной области реципиента заменены остатками гипервариабельной области вида, не являющегося человеком (антитело-донор), такого как мышь, крыса, кролик или примат, не являющийся человеком, имеющей желаемую специфичность, аффинность и активность. В некоторых случаях, остатки каркасных областей (FR) человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими остатками от источника, не являющегося человеком. Более того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, отсутствующие в антителе-реципиенте или в антителе-доноре. Эти модификации осуществляют для дальнейшего улучшения свойств антитела. В целом, гуманизированное антитело будет содержать по существу все из по меньшей мере одного и обычно двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все гипервариабельные петли соответствуют гипервариабельным петлям иммуноглобулина, не являющегося человеческим, и все или по существу все FR представляют собой FR последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело возможно будет также содержать по меньшей мере часть константной области (Fc) иммуноглобулина, обычно человеческого иммуноглобулина. См. дополнительные подробности в Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992). См. также следующие обзорные статьи и процитированные в них ссылки: Vaswani, Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23: 1035-1038 (1995); Hurle, Gross, Curr. Op. Biotech. 5: 428-433 (1994).

«Человеческое антитело» представляет собой антитело, имеющее аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности антитела, образованного в организме человека и/или полученного с применением любой из методик получения человеческих антител, как раскрыто здесь. Это определение человеческого антитела прямо исключает гуманизированное антитело, содержащее антиген-связывающие остатки от источника, не являющегося человеком.

При использовании здесь «шарнирная область», «шарнирная последовательность» и их варианты включают значение, известное в данной области, проиллюстрированное, например, в Janeway et al., ImmunoBiology: the immune system in health and disease, (Elsevier Science Ltd., NY) (4^th ed., 1999); Bloom et al., Protein Science (1997), 6: 407-415; Humphreys et al., J. Immunol. Methods (1997), 209: 193-202.

При использовании здесь термин «Fc-содержащий полипептид» относится к полипептиду (например, антителу или иммуноадгезину), содержащему C-концевые полипептидные последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина. Fc-содержащий полипептид может содержать нативные или вариантные Fc-области (то есть последовательности). Fc-область иммуноглобулина обычно содержит два константных домена, домен C_H2 и домен C_H3, и возможно содержит домен C_H4. Fc-содержащий полипептид может содержать всю шарнирную последовательность дикого типа или ее часть (обычно на амино-конце Fc-содержащего полипептида). Fc-содержащий полипептид может также представлять собой димер. Fc-содержащий полипептид может быть получен из или иметь происхождение от любого подходящего иммуноглобулина, такого как по меньшей мере один из различных подтипов IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 или IgA, IgE, IgD или IgM. Несмотря на то, что границы Fc-области тяжелой цепи иммуноглобулина могут варьировать, например границы Fc-области тяжелой цепи человеческого IgG обычно определяют от аминокислотного остатка в положении Glu216 или от Ala231 до ее карбоксильного конца. Нумерация остатков Fc-области соответствует нумерации EU или Kabat. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991.

Fc-содержащий полипептид может представлять собой Fc-содержащий слитый полипептид, где один или более чем один полипептид связан с Fc-содержащим полипептидом. Слияние Fc содержит комбинацию Fc-полипептида иммуноглобулина с партнером по слиянию, который может в большинстве случаев представлять собой любой белок, полипептид или малую молекулу. Для получения Fc-содержащего слитого полипептида с Fc-областью могут быть связаны практически любой белок или малая молекула. Партнеры для слияния с Fc-содержащим полипептидом могут включать, без ограничения, мишень-связывающую область рецептора, молекулу адгезии, лиганд, фермент, цитокин, хемокин или какой-либо другой белок или белковый домен.

При использовании здесь термин «иммуноадгезин» обозначает антителоподобные или иммуноглобулиноподобные молекулы, содержащие комбинацию «связывающего домена» гетерологичного белка («адгезина», например, рецептора, лиганда или фермента) с эффекторным компонентом константных доменов иммуноглобулина (то есть Fc-доменом). Структурно иммуноадгезины содержат слияние аминокислотной последовательности адгезина с желаемой специфичностью связывания, отличной от сайта распознавания и связывания антигена (антиген-связывающего сайта) антитела (то есть, являющейся «гетерологичной») и последовательность константного домена иммуноглобулина. Последовательность константного домена иммуноглобулина, присутствующая в иммуноадгезине, может быть получена из любого иммуноглобулина, такого как подтипы IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 или IgA, IgE, IgD или IgM.

Термины «полипептид», «олигопептид», «пептид» и «белок» использованы здесь взаимозаменяемо для обозначения цепей аминокислот любой длины, предпочтительно относительно коротких (например, из 10-100 аминокислот). Цепь может быть линейной или разветвленной, она может содержать модифицированные аминокислоты и/или может прерываться неаминокислотными группировками. Термин также включает аминокислотную цепь, модифицированную естественным или искусственным образом, например образованием дисульфидных связей, гликозилированием, липидированием, ацетилированием, фосфорилированием или любой другой манипуляцией или модификацией, такой как конъюгирование с метящим компонентом. В определение также включены, например, полипептиды, содержащие один или более чем один аналог аминокислот (включая, например, неприродные аминокислоты и так далее), а также другие модификации, известные в данной области. Следует понимать, что полипептиды могут быть представлены в форме отдельных цепей или связанных цепей.

При использовании здесь термины «аминокислота дикого типа», «IgG дикого типа» или «mAb дикого типа» относятся к последовательности аминокислот или нуклеиновых кислот, естественным образом встречающейся в определенной популяции (например, людей, мышей, крыс, клеток и так далее).

При использовании здесь термин «эффективность конъюгирования» или «эффективность поперечного сшивания» представляет собой соотношение экспериментально измеренных количеств ADC, как описано здесь, к максимальному ожидаемому количеству ADC. Эффективность конъюгирования или эффективность поперечного сшивания могут быть измерены различными методиками, хорошо известными специалистам в данной области, такими как хроматография гидрофобного взаимодействия. Эффективность конъюгирования может также быть измерена при различных температурах, таких как комнатная температура или 37°C.

Термин «эффекторная функция» относится к биологической активности, свойственной Fc-области антитела. Примеры эффекторных функций антител включают, без ограничения, антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC), связывание с Fc-рецепторами, комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC), фагоцитоз, связывание с C1q и понижающую регуляцию рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточных рецепторов, BCR). См., например, патент США №6737056. Для таких эффекторных функций обычно необходимо сочетание Fc-области со связывающим доменом (например, вариабельным доменом антитела), и их можно оценить с применением различных анализов, известных в данной области для оценки таких эффекторных функций антител. Примером измерения эффекторной функции является измерение по связыванию с Fcγ3 и/или C1q.

При использовании здесь «антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность» или «ADCC» относится к клеточно-опосредованной реакции, при которой неспецифические цитотоксические клетки, экспрессирующие Fc-рецепторы (FcR) (например, натуральные клетки-киллеры (NK), нейтрофилы и макрофаги) распознают связанное антитело на клетке-мишени и затем вызывают лизис клетки-мишени. ADCC-активность интересующей молекулы может быть оценена с применением анализа ADCC in vitro, такого как описанный в патенте США №5500362 или 5821337. Полезные эффекторные клетки для таких анализов включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и NK-клетки. Альтернативно или дополнительно, ADCC-активность интересующей молекулы может быть оценена in vivo, например в модели на животных, такой как раскрытая в Clynes et al., 1998, PNAS (USA), 95: 652-656.

«Комплемент-зависимая цитотоксичность» или «CDC» относится к лизису мишени в присутствии комплемента. Путь активации комплемента начинается со связывания первого компонента системы комплемента (C1q) с молекулой (например, антителом), представленной в комплексе с родственным антигеном. Для оценки активации комплемента может быть проведен CDC-анализ, например как описано в Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202: 163 (1996).

При использовании здесь «Fc-рецептор» и «FcR» описывают рецептор, связывающийся с Fc-областью антитела. Предпочтительным FcR является человеческий FcR с нативной последовательностью. Более того, предпочтительный FcR представляет собой FcR, связывающийся с антителом IgG (гамма-рецептор), и включает подклассы FcγRI, FcγRII, FcγRIII и FcγRIV, включая аллельные варианты и формы альтернативного сплайсинга этих рецепторов. FcγRII рецепторы включают FcγRIIA («активирующий рецептор») и FcγRIIB («ингибирующий рецептор»), имеющие сходные аминокислотные последовательности и различающиеся главным образом своими цитоплазматическими доменами. Обзоры FcR приведены в Ravetch, Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9: 457-92; Capel et al., 1994, Immunomethods, 4: 25-34; de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126: 330-41; Nimmerjahn et al., 2005, Immunity 23: 2-4. «FcR» также включает неонатальный рецептор FcRn, обеспечивающий перенос материнских IgG плоду (Guyer et al., 1976, J. Immunol., 117:587; и Kim et al., 1994, J. Immunol., 24:249).

При использовании здесь «лечение» представляет собой способ получения полезных или желаемых клинических результатов. Для задач данного изобретения полезные или желаемые клинические результаты включают, без ограничения, одно или более из следующего: уменьшение пролиферации (или уничтожение) неопластических или раковых клеток; ингибирование метастазирования неопластических клеток; сокращение или уменьшение размера опухоли; ремиссию рака; уменьшение симптомов рака; повышение качества жизни субъектов, страдающих от рака; снижение дозы других лекарственных средств, необходимых для лечения рака; задержку прогрессирования рака; излечение рака; и/или продление выживания пациентов с раком.

При использовании здесь «эффективная доза» или «эффективное количество» лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции представляет собой количество, достаточное для достижения любого одного или более чем одного полезного или желаемого результата. Для профилактического применения полезные или желаемые результаты включают устранение или снижение риска, уменьшение тяжести или задержку начала заболевания, включая биохимические, гистологические и/или поведенческие симптомы заболевания, его осложнения и промежуточные патологические фенотипы, проявляющиеся при развитии заболевания. Для терапевтического применения полезные или желаемые результаты включают клинические результаты, такие как: снижение частоты или уменьшение степени выраженности одного или более чем одного симптома различных связанных с раком заболеваний или состояний (таких как рак желудка, головы и шеи, легкого, яичника и поджелудочной железы); снижение дозы других лекарственных средств, необходимых для лечения заболевания; усиление эффекта другого лекарственного средства; и/или задержка прогрессирования рака у пациентов. Эффективная доза может быть введена за одно или более чем одно введение. Для задач данного изобретения эффективная доза лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции представляет собой количество, достаточное для проведения профилактического или терапевтического лечения, либо непосредственно, либо косвенно. Как понимают в клиническом контексте, эффективная доза лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции может быть или может не быть достигнута в сочетании с другим лекарственным средством, соединением или фармацевтической композицией. Таким образом, «эффективную дозу» можно рассматривать в контексте введения одного или более чем одного терапевтического агента, и один агент можно считать вводимым в эффективном количестве, если в сочетании с одним или более чем одним другим агентом достигнут или может быть достигнут желаемый результат.

Термин «очищать» и его грамматические варианты использованы для обозначения удаления, полного или частичного, по меньшей мере одной примеси из смеси, содержащей ADC и одну или более чем одну примесь, посредством чего повышают степень чистоты ADC в композиции (то есть посредством уменьшения количества (миллионных долей, ppm) примеси(ей) в композиции).

Ссылка на «приблизительно» в приведенном здесь описании значения или параметра включает (и описывает) воплощения, направленные непосредственно на это значение или параметр. Например, описание со ссылкой на «приблизительно X» включает описание «X». Числовые диапазоны включают числа, определяющие диапазон.

«Индивид» или «субъект» представляет собой млекопитающее, более предпочтительно человека. Млекопитающие также включают, без ограничения, сельскохозяйственных животных, спортивных животных, приматов, лошадей, собак, кошек, мышей и крыс.

Следует понимать, что при описании приведенных здесь воплощений с использованием термина «содержащий/включающий» также предусмотрены аналогичные в других отношениях воплощения, описанные с использованием терминов «состоящий из» и/или «состоящий по существу из».

Там, где аспекты или воплощения изобретения описаны с использованием группы Маркуша или других групп альтернатив, настоящее изобретение включает не только всю перечисленную группу как единое целое, но также каждого представителя группы по отдельности и все возможные подгруппы основной группы, а также основную группу без одного или более чем одного представителя группы. Настоящее изобретение также предусматривает прямое исключение одного или более чем одного из любых представителей группы в заявленном изобретении.

Обозначения остатков в данной заявке основаны на схеме нумерации константного домена EU (Edelman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 63(1): 78-85 (1969)).

Если не указано иное, все технические и научные термины, использованные здесь, имеют то же значение, в котором их обычно понимает специалист в области, к которой относится данное изобретение. Здесь описаны типичные методы и материалы, однако при практическом применении или испытании настоящего изобретения могут также быть применены методы и материалы, сходные с описанными здесь или эквивалентные им. Все публикации и другие ссылки, упомянутые здесь, полностью включены посредством ссылки. В случае противоречий настоящая заявка, включая определения, имеет преимущество. Несмотря на то, что здесь процитирован ряд документов, это цитирование не является признанием того, что какой-либо из этих документов является частью общепринятого и общеизвестного уровня техники в данной области. В данном описании и формуле изобретения слово «содержать/включать» или варианты, такие как «содержит/включает» или «содержащий/включающий», следует понимать как подразумевающие включение указанного признака или группы признаков, но не исключение какого-либо другого признака или группы признаков. Если контекст не требует иного, формы единственного числа включают множественное число, и формы множественного числа включают единственное число. Материалы, методы и примеры являются исключительно иллюстративными и не являются ограничивающими.

Конъюгаты «антитело - лекарственное средство» с высокой лекарственной загрузкой

Конъюгаты «антитело - лекарственное средство», описанные здесь, содержат антитело, конъюгированное сайт-специфичным образом с агентом-донором амина (например, малой молекулой, связанной с линкером с единицей-донором амина) через конструированную содержащую глутамин метку, эндогенный глутамин (то есть нативные глутамины без конструирования, такие как глутамины в вариабельных доменах, CDR и так далее) и/или реакционно-способный эндогенный глутамин, где соотношение лекарственного средства к антителу (DAR) составляет по меньшей мере приблизительно 5 (например, по меньшей мере 5 лекарственных средств / полезных нагрузок на антитело). Эндогенный глутамин может быть сделан реакционно-способным (то есть способным образовывать ковалентную связь в качестве донора ацила в присутствии амина и трансглутаминазы) посредством модификации одной или более чем одной аминокислоты (например, аминокислотной делеции, вставки, замены или мутации) антитела, ферментативного дегликозилирования или взаимодействия с конструированной трансглутаминазой. Соответственно, в одном аспекте предложен конъюгат «антитело - лекарственное средство» (ADC), содержащий формулу антитело-(Т-(X-Y-Z_a)_b)_c, где: Т представляет собой (1) конструированную в определенном сайте содержащую глутамин метку, (2) эндогенный глутамин и/или (3) эндогенный глутамин, сделанный реакционно-способным посредством конструирования антитела или конструированной трансглутаминазы; X представляет собой единицу-донор амина; Y представляет собой линкер; и Z представляет собой группировку-агент; X-Y-Z представляет собой агент-донор амина, конъюгированный сайт-специфичным образом с содержащей глутамин меткой, эндогенным глутамином или реакционно-способным эндогенным глутамином; а представляет собой целое число от 1 до 6; b представляет собой целое число от 1 до 6; с представляет собой целое число от 1 до 20; и где произведение a, b и с (соотношение лекарственного средства к антителу) составляет по меньшей мере приблизительно 5. Как содержащая глутамин метка, эндогенный глутамин и/или реакционно-способный глутамин антитела, так и агент-донор амина (X-Y-Z), описанный здесь, являются субстратами трансглутаминазы, и связь между содержащей глутамин меткой и/или эндогенным/реакционно-способным глутамином и агентом-донором амина имеет формулу CH₂-CH₂-CO-NH-, где NH-связан с линкером и группировкой-агентом.

Трансглутаминазы являются протеин-глутамин γ-глутамилтрансферазами (ЕС 2.3.2.13), обычно катализирующими pH-зависимое трансамидирование глутаминовых остатков лизиновыми остатками. Трансглутаминаза, используемая в изобретении, описанном здесь, может быть получена из множества источников или конструирована для катализа трансамидирования одного или более чем одного эндогенного глутаминового остатка одним или более чем одним лизиновым остатком или агентом-донором амина, содержащим один или более чем один реакционно-способный амин. В некоторых воплощениях трансглутаминаза представляет собой кальций-зависимую трансглутаминазу, которой необходим кальций для индуцирования конформационных изменений фермента и появления ферментативной активности. Например, трансглутаминаза может иметь происхождение из печени морской свинки и получена из коммерческих источников (например, Sigma-Aldrich (St. Louis, МО) и MP Biomedicals (Irvine, CA)). В некоторых воплощениях полипептид mTGase (микробной трансглутаминазы) имеет происхождение от грибкового белка (например, трансглутаминазы Oomycetes, Actinomycetes, Saccharomyces, Candida, Cryptococcus, Monascus или Rhizopus). В некоторых воплощениях полипептид mTGase имеет происхождение от Myxomycetes (например, трансглутаминаза Physarum polycephalum). В некоторых воплощениях полипептид mTGase имеет происхождение от бактериального белка, такого как трансглутаминаза Streptoverticillium sp. или Streptomyces sp. (например, Streptomyces mobarensis или Streptoverticillium mobarensis). В некоторых воплощениях полипептид mTGase имеет происхождение от бактериального белка, такого как, без ограничения, трансглутаминаза Streptoverticillium mobarensis, Streptoverticillium griseocarneum, Streptoverticillium ladakanum, Streptomyces mobarensis, Streptomyces viridis, Streptomyces ladakanum, Streptomyces caniferus, Streptomyces platensis, Streptomyces hygroscopius, Streptomyces netropsis, Streptomyces fradiae, Streptomyces roseovertivillatus, Streptomyces cinnamaoneous, Streptomyces griseocarneum, Streptomyces lavendulae, Streptomyces lividans, Streptomyces lydicus, Streptomyces sioyansis, Actinomadura sp., Bacillus (например, Bacillus circulans, Bacillus subtilis и так далее), Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium glutamicum, Clostridium, Enterobacter sp., Micrococcus, Providencia sp. или их изолятов. В некоторых воплощениях трансглутаминаза представляет собой кальций-независимую трансглутаминазу, которой не нужен кальций для индуцирования конформационных изменений фермента и появления ферментативной активности. В некоторых воплощениях полипептид mTGase имеет происхождение от S. mobarensis. Имеющаяся в продаже кальций-независимая трансглутаминаза, такая как ACTIVA™ (Ajinomoto, Japan), также является подходящей для настоящего изобретения.

В некоторых воплощениях трансглутаминаза, используемая в изобретении, описанном здесь, представляет собой конструированную трансглутаминазу, катализирующую трансамидирование одного или более чем одного эндогенного глутаминового остатка антитела одним или более чем одним лизиновым остатком или реакционно-способным амином агента-донора амина. Например, один или более чем один аминокислотный остаток дикого типа встречающейся в природе трансглутаминазы может быть удален или заменен другим аминокислотным остатком(ами) с получением конструированной трансглутаминазы.

В некоторых воплощениях трансглутаминаза, используемая в изобретении, описанном здесь, может также представлять собой рекомбинантный белок, полученный с применением рекомбинантных методик, известных специалистам в данной области. В некоторых воплощениях трансглутаминаза, используемая в изобретении, описанном здесь, может представлять собой очищенный белок. Например, степень чистоты очищенной трансглутаминазы составляет по меньшей мере приблизительно 50%. При использовании здесь «чистый» или «очищенный» белок относится к белку (например, трансглутаминазе), свободному от других белковых примесей. В некоторых воплощениях степень чистоты очищенной трансглутаминазы составляет по меньшей мере приблизительно 55%-60%, 60%-65%, 65%-70%, 70%-75%, 75%-80%, 80%-85%, 85%-90%, 90%-95%, 95%-98% или 99%. В некоторых воплощениях степень чистоты очищенной трансглутаминазы составляет приблизительно 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%.

В некоторых воплощениях содержащая глутамин метка ADC, как описано здесь, пространственно отделена от реакционно-способного Lys антитела. Например, содержащая глутамин метка пространственно отделена от реакционно-способного Lys на карбоксильном конце, амино-конце или как на карбоксильном, так и на амино-конце полипептида.

В некоторых воплощениях ADC по настоящему изобретению содержит по меньшей мере 1 эндогенный глутамин, сделанный реакционно-способным в реакции трансамидирования посредством конструирования антитела или конструированной трансглутаминазой. В некоторых воплощениях конструирование антитела представляет собой дегликозилирование антитела (например, ферментативное дегликозилирование) или аминокислотную модификацию антитела, включая аминокислотную делецию, вставку, замену, мутацию или любую их комбинацию. Например, аминокислоту дикого типа Asn (N) в положении 297 антитела заменяют аминокислотой Ala (А), что приводит к агликозилированию в положении 297 и реакционно-способному эндогенному глутамину (Q) в положении 295. В другом примере аминокислотная модификация антитела представляет собой аминокислотную замену N на Q в положении 297, что приводит к агликозилированию в положении 297, реакционно-способному эндогенному Q в положении 295 и сайт-специфичному конъюгированию между N297Q и Q295 и одним или более чем одним агентом-донором амина в этих двух сайтах в присутствии трансглутаминазы.

В некоторых воплощениях ADC по настоящему изобретению содержит содержащую глутамин метку, конструированную в по меньшей мере одном или более чем одном положении, включающем, без ограничения: (1) карбоксильный конец любой из легкой цепи, тяжелой цепи или как легкой цепи, так и тяжелой цепи; (2) амино-конец любой из легкой цепи, тяжелой цепи или как легкой цепи, так и тяжелой цепи; и (3) S60-R61, R108, Т135, S160, S168, S190-S192, P189-S192, G200-S202, K222-Т225, K222-Т223, Т223, L251-S254, M252-I253, E294-N297, E293-N297, N297 и/или G385; где содержащая глутамин метка введена в антитело или заменяет одну или более чем одну эндогенную аминокислоту антитела, где соотношение лекарственного средства к антителу составляет по меньшей мере приблизительно 5. Примеры конкретных содержащих глутамин меток и соответствующих конструированных положений приведены в Таблице 1. Соответственно, в некоторых воплощениях ADC по настоящему изобретению имеет DAR по меньшей мере приблизительно 5 (например, 5 лекарственных средств / полезных нагрузок на антитело) и содержит содержащую глутамин метку, конструированную в одном или более чем одном положении, перечисленном в Таблице 1.

В некоторых воплощениях антитело в ADC по настоящему изобретению дополнительно содержит вторую аминокислотную модификацию в положении(ях) 222, 340 и/или 370 (нумерация EU) по сравнению с тем же положением антитела дикого типа. В некоторых воплощениях модификация представляет собой аминокислотную делецию, вставку, замену, мутацию или любую их комбинацию. В некоторых воплощениях замена включает замену аминокислоты дикого типа на другую (например, аминокислоту, не являющуюся аминокислотой дикого типа). В некоторых воплощениях другая аминокислота (например, не являющаяся аминокислотой дикого типа) представляет собой Arg (например, K222R, K340R или K370R). В некоторых воплощениях другая аминокислота (например, не являющаяся аминокислотой дикого типа) представляет собой Ala, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val.

Соответственно, в некоторых воплощениях ADC по настоящему изобретению содержит: (а) аминокислотные замены в положениях N297Q и K222R, где агент-донор амина конъюгирован сайт-специфичным образом с эндогенным глутамином в положении 295 и замененным глутамином в положении 297; и (б) одну или более чем одну содержащую глутамин метку, где агент-донор амина конъюгирован сайт-специфичным образом с содержащей(ими) глутамин меткой(ами) на карбоксильном конце легкой цепи антитела; где соотношение лекарственного средства к антителу (DAR) составляет приблизительно 5-7. В некоторых воплощениях содержащая глутамин метка на карбоксильном конце легкой цепи антитела представляет собой GGLLQGA (SEQ ID NO: 23) или GGLLQGPP (SEQ ID NO: 22).

В некоторых воплощениях ADC по настоящему изобретению содержит: (а) аминокислотные замены в положениях N297Q и K222R, где агент-донор амина конъюгирован сайт-специфичным образом с эндогенным глутамином в положении 295 и замененным глутамином в положении 297; и (б) одну или более чем одну содержащую глутамин метку, где агент-донор амина конъюгирован сайт-специфичным образом с содержащей(ими) глутамин меткой(ами) на карбоксильном конце легкой цепи антитела; (в) одну или более чем одну содержащую глутамин метку, где агент-донор амина дополнительно конъюгирован сайт-специфичным образом с содержащей глутамин меткой в одном или более чем одном положении, выбранном из группы, состоящей из S60-R61, R108, Т135, S160, S168, S190-S192, P189-S192, G200-S202, K222-Т225, K222-Т223, Т223, L251-S254, M252-I253, E294-N297, E293-N297, N297 и G385 антитела; где содержащая глутамин метка введена в антитело или заменяет одну или более чем одну эндогенную аминокислоту антитела; и где соотношение лекарственного средства к антителу составляет по меньшей мере приблизительно 6. Например, в некоторых воплощениях ADC по настоящему изобретению также содержит: (а) аминокислотные замены в положениях N297Q и K222R, где агент-донор амина конъюгирован сайт-специфичным образом с эндогенным глутамином в положении 295 и замененным глутамином в положении 297; и (б) одну или более чем одну содержащую глутамин метку, где агент-донор амина конъюгирован сайт-специфичным образом с содержащей(ими) глутамин меткой(ами) на карбоксильном конце легкой цепи антитела; (в) одну или более чем одну глутаминовую метку, где агент-донор амина дополнительно конъюгирован сайт-специфичным образом с содержащей глутамин меткой на карбоксильном конце легкой цепи антитела; где соотношение лекарственного средства к антителу (DAR) составляет приблизительно 6-9. В некоторых воплощениях содержащая глутамин метка на карбоксильном конце легкой цепи антитела представляет собой GGLLQGA (SEQ ID NO: 23) или GGLLQGPP (SEQ ID NO: 22); и содержащая глутамин метка на карбоксильном конце тяжелой цепи антитела представляет собой LLQGA (SEQ ID NO: 11) или LLQGPP (SEQ ID NO: 20).

В одном варианте ADC по настоящему изобретению содержит: (а) аминокислотные замены в положениях N297Q и K222R, где агент-донор амина конъюгирован сайт-специфичным образом с эндогенным глутамином в положении 295 и замененным глутамином в положении 297; и (б) одну или более чем одну содержащую глутамин метку, где агент-донор амина конъюгирован сайт-специфичным образом с содержащей(ими) глутамин меткой(ами) на карбоксильном конце легкой цепи антитела; (в) одну или более чем одну содержащую глутамин метку, где агент-донор амина дополнительно конъюгирован сайт-специфичным образом с содержащей глутамин меткой, введенной после аминокислотного положения Т135 тяжелой цепи антитела; и где соотношение лекарственного средства к антителу (DAR) составляет приблизительно 6-9. В некоторых воплощениях содержащая глутамин метка на карбоксильном конце легкой цепи антитела представляет собой GGLLQGA (SEQ ID NO: 23) или GGLLQGPP (SEQ ID NO: 22); и содержащая глутамин метка, введенная после Т135 тяжелой цепи антитела, представляет собой LLQG (SEQ ID NO: 2).

В другом варианте ADC по настоящему изобретению содержит: (а) аминокислотные замены в положениях N297Q и K222R, где агент-донор амина конъюгирован сайт-специфичным образом с эндогенным глутамином в положении 295 и замененным глутамином в положении 297; и (б) одну или более чем одну содержащую глутамин метку, где агент-донор амина конъюгирован сайт-специфичным образом с содержащей(ими) глутамин меткой(ами) на карбоксильном конце легкой цепи антитела; (в) одну или более чем одну содержащую глутамин метку, где агент-донор амина дополнительно конъюгирован сайт-специфичным образом с содержащей глутамин меткой в аминокислотных положениях G200-S202 тяжелой цепи антитела; где соотношение лекарственного средства к антителу (DAR) составляет приблизительно 6-9. В некоторых воплощениях содержащая глутамин метка на карбоксильном конце легкой цепи антитела представляет собой GGLLQGA (SEQ ID NO: 23) или GGLLQGPP (SEQ ID NO: 22); и содержащая глутамин метка в аминокислотных положениях G200-S202 легкой цепи антитела представляет собой LLQG (SEQ ID NO: 2).

В некоторых воплощениях ADC по настоящему изобретению также содержит: (а) аминокислотные замены в положениях N297Q и K222R, где агент-донор амина конъюгирован сайт-специфичным образом с эндогенным глутамином в положении 295 и замененным глутамином в положении 297; и (б) одну или более чем одну содержащую глутамин метку, где агент-донор амина конъюгирован сайт-специфичным образом с содержащей(ими) глутамин меткой(ами) на карбоксильном конце легкой цепи антитела; (в) одну или более чем одну содержащую глутамин метку, где агент-донор амина дополнительно конъюгирован сайт-специфичным образом с содержащей глутамин меткой в аминокислотных положениях G200-S202 легкой цепи антитела; (г) одну или более чем одну содержащую глутамин метку, где агент-донор амина дополнительно конъюгирован сайт-специфичным образом с содержащей глутамин меткой, введенной после аминокислотного положения Т135 тяжелой цепи антитела; и где соотношение лекарственного средства к антителу (DAR) составляет приблизительно 9-11. В некоторых воплощениях содержащая глутамин метка на карбоксильном конце легкой цепи антитела представляет собой GGLLQGA (SEQ ID NO: 23) или GGLLQGPP (SEQ ID NO: 22); содержащая глутамин метка в аминокислотных положениях G200-S202 легкой цепи антитела представляет собой LLQG (SEQ ID NO: 2); и содержащая глутамин метка, введенная после Т135 тяжелой цепи антитела, также представляет собой LLQG (SEQ ID NO: 2).

В некоторых воплощениях ADC по настоящему изобретению также содержит агент-донор амина, конъюгированный сайт-специфичным образом с содержащей глутамин меткой (а) на карбоксильном конце легкой цепи антитела, (б) после аминокислотного положения Т135 тяжелой цепи антитела и (в) в аминокислотных положениях G200-S202 легкой цепи антитела, где эндогенные аминокислотные остатки заменены содержащей глутамин меткой, и где соотношение лекарственного средства к антителу составляет приблизительно 5-7. В некоторых воплощениях содержащая глутамин метка на карбоксильном конце легкой цепи антитела представляет собой GGLLQGA (SEQ ID NO: 23) или GGLLQGPP (SEQ ID NO: 22); содержащая глутамин метка в аминокислотных положениях G200-S202 легкой цепи антитела представляет собой LLQG (SEQ ID NO: 2); и содержащая глутамин метка, введенная после Т135 тяжелой цепи антитела, также представляет собой LLQG (SEQ ID NO: 2).

Соотношение лекарственного средства к антителу (DAR) в ADC по настоящему изобретению составляет от приблизительно 5 до приблизительно 720. В некоторых воплощениях DAR составляет приблизительно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 и 710.

В некоторых воплощениях содержащая глутамин метка для ADC, описанного здесь, содержит аминокислотную последовательность XXQX (SEQ ID NO: 37), где X может представлять собой обычную или необычную аминокислоту, как описано здесь. Например, в некоторых воплощениях X представляет собой L (Leu), A (Ala), G (Gly), S (Ser), V (Val), F (Phe), Y (Tyr), H (His), R (Arg), N (Asn), E (Glu), D (Asp), С (Cys), Q (Gln), I (Ile), M (Met), P (Pro), T (Thr), K (Lys) или W (Trp). В некоторых воплощениях содержащая глутамин метка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из Q, LQG, LLQGG (SEQ ID NO: 1), LLQG (SEQ ID NO: 2), LSLSQG (SEQ ID NO: 3), GGGLLQGG (SEQ ID NO: 4), GLLQG (SEQ ID NO: 5), LLQ, GSPLAQSHGG (SEQ ID NO: 6), GLLQGGG (SEQ ID NO: 7), GLLQGG (SEQ ID NO: 8), GLLQ (SEQ ID NO: 9), LLQLLQGA (SEQ ID NO: 10), LLQGA (SEQ ID NO: 11), LLQYQGA (SEQ ID NO: 12), LLQGSG (SEQ ID NO: 13), LLQYQG (SEQ ID NO: 14), LLQLLQG (SEQ ID NO: 15), SLLQG (SEQ ID NO: 16), LLQLQ (SEQ ID NO: 17), LLQLLQ (SEQ ID NO: 18), LLQGR (SEQ ID NO: 19), LLQGPP (SEQ ID NO: 20), LLQGPA (SEQ ID NO: 21), GGLLQGPP (SEQ ID NO: 22), GGLLQGA (SEQ ID NO: 23), LLQGPGK (SEQ ID NO: 25), LLQGPG (SEQ ID NO: 26), LLQGP (SEQ ID NO: 27), LLQP (SEQ ID NO: 28), LLQPGK (SEQ ID NO: 29), LLQAPGK (SEQ ID NO: 30), LLQGAPG (SEQ ID NO: 31), LLQGAP (SEQ ID NO: 32) и LLQLQG (SEQ ID NO: 36). В некоторых воплощениях содержащая глутамин метка содержит аминокислотную последовательность LLQGA (SEQ ID NO: 11), LQG, GGLLQGA (SEQ ID NO: 23), LLQGPA (SEQ ID NO: 21), LLQGPP (SEQ ID NO: 20), GGLLQGPP (SEQ ID NO: 22), LLQGSG (SEQ ID NO: 13), LLQG (SEQ ID NO: 2), LLQYQG (SEQ ID NO: 14), LLQLLQG (SEQ ID NO: 15), LLQLQG (SEQ ID NO: 36), LLQLLQ (SEQ ID NO: 18), LLQLQ (SEQ ID NO: 17), LLQGR (SEQ ID NO: 19), LLQYQGA (SEQ ID NO: 12), SLLQG (SEQ ID NO: 16) или LLQLLQGA (SEQ ID NO: 10). В некоторых воплощениях содержащая глутамин метка-донор ацила не содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из LGGQGGG (SEQ ID NO: 38), GGGQGGL (SEQ ID NO: 39), GXGQGGG (SEQ ID NO: 40), GGXQGGG (SEQ ID NO: 41), GGGQXGG (SEQ ID NO: 42) и GGGQGXG (SEQ ID NO: 43), где X представляет собой G, A, S, L, V, F, Y, R, N или E). Другие типичные метки также описаны, например, в US 20130230543 и US 2013/0122020.

В некоторых воплощениях антитело в ADC, описанных здесь, содержит аминокислотную модификацию в последнем аминокислотном положении на карбоксильном конце по сравнению с тем же положением антитела дикого типа. В некоторых воплощениях модификация представляет собой аминокислотную делецию, вставку, замену, мутацию или любую их комбинацию. В некоторых воплощениях замена включает замену аминокислоты дикого типа на другую (например, аминокислоту, не являющуюся аминокислотой дикого типа). В некоторых воплощениях вставка включает вставку одной или более чем одной аминокислоты (например, введение одной, двух, трех или более аминокислот). В некоторых воплощениях другая (например, не являющаяся аминокислотой дикого типа) или вставленная аминокислота представляет собой Arg. В некоторых воплощениях другая аминокислота (например, не являющаяся аминокислотой дикого типа) представляет собой Ala, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val. Например, в некоторых воплощениях последняя аминокислота на карбоксильном конце антитела (например, тяжелой цепи антитела) может быть удалена, и содержащая глутамин метка, конструированная на C-конце полипептида, содержит аминокислотную последовательность LLQGA (SEQ ID NO: 11) или LLQGPP (SEQ ID NO: 20).

В некоторых воплощениях антитело содержит аминокислотную модификацию в первом аминокислотном положении на амино-конце по сравнению с тем же положением антитела дикого типа. В некоторых воплощениях модификация представляет собой аминокислотную делецию, вставку, замену, мутацию или любую их комбинацию. В некоторых воплощениях замена включает замену аминокислоты дикого типа на другую аминокислоту (например, не являющуюся аминокислотой дикого типа). В некоторых воплощениях вставка включает вставку аминокислоты. В некоторых воплощениях аминокислота, не являющаяся аминокислотой дикого типа, или вставленная аминокислота представляют собой Arg. В некоторых воплощениях другая аминокислота (например, не являющаяся аминокислотой дикого типа или вставленная аминокислота) представляет собой Ala, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val.

В некоторых воплощениях ADC, описанный здесь, содержит полноразмерную тяжелую цепь антитела и легкую цепь антитела. В некоторых воплощениях антитело, описанное здесь, представляет собой моноклональное антитело, поликлональное антитело, человеческое антитело, гуманизированное антитело, химерное антитело, биспецифичное антитело, минитело, диатело или фрагмент антитела.

В некоторых воплощениях антитело представляет собой IgG. В некоторых воплощениях IgG выбран из группы, состоящей из IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.

В некоторых воплощениях антитело представляет собой IgA, IgE, IgD или IgM.

В некоторых воплощениях эффекторная функция (например, как измерено по связыванию с Fcγ3 и/или C1q) ADC, описанных здесь, снижена не более чем приблизительно в 1 раз, 2 раза, 3 раза, 4 раза или 5 раз по сравнению с антителом дикого типа. В некоторых воплощениях антитело в ADC представляет собой IgG, эффекторная функция которого снижена не более чем приблизительно в 2 раза по сравнению с IgG дикого типа. В других воплощениях эффекторная функция IgG снижена приблизительно в 2 раза по сравнению с IgG дикого типа. В других воплощениях эффекторная функция IgG снижена более чем приблизительно в 2 раза по сравнению с IgG дикого типа. В некоторых воплощениях антитело в ADC представляет собой IgG, эффекторная функция которого снижена не более чем приблизительно в 1 раз по сравнению с IgG дикого типа. В других воплощениях эффекторная функция IgG снижена приблизительно в 1 раз по сравнению с IgG дикого типа. В некоторых воплощениях эффекторная функция IgG снижена более чем приблизительно в 1 раз, 3 раза, 4 раза или 5 раз по сравнению с IgG дикого типа.

В некоторых воплощениях эффекторная функция (например, как измерено по связыванию с Fcγ3 и/или C1q) ADC, описанного здесь, повышена по меньшей мере приблизительно в 1-3000 раз по сравнению с антителом дикого типа. В некоторых воплощениях эффекторная функция ADC повышена по меньшей мере приблизительно в 1-5 раз, 6-10 раз, 11-15 раз, 16-20 раз, 21-25 раз, 26-30 раз, 31-35 раз, 36-40 раз, 41-45 раз, 46-50 раз, 51-55 раз, 56-60 раз, 61-65 раз, 66-70 раз, 71-75 раз, 76-80 раз, 81-85 раз, 86-90 раз, 91-95 раз, 96-100 раз, 101-200 раз, 201-300 раз, 301-500 раз, 501-1000 раз, 1001-1500 раз, 1501-2000 раз, 2001-2500 раз, 2501-3000 раз по сравнению с антителом дикого типа. В некоторых воплощениях антитело в ADC представляет собой IgG, эффекторная функция которого повышена приблизительно в 1-300 раз по сравнению с IgG дикого типа. В некоторых воплощениях эффекторная функция IgG повышена приблизительно в 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 10 раз, 15 раз, 20 раз, 40 раз, 60 раз, 80 раз, 100 раз, 150 раз, 200 раз, 250 раз, 300 раз, 400 раз, 500 раз, 600 раз, 700 раз, 800 раз, 900 раз, 1000 раз, 1500 раз, 2000 раз, 2500 раз или 3000 раз по сравнению с IgG дикого типа.

В некоторых воплощениях агент-донор амина имеет формулу: X-Y-Z, где X представляет собой единицу-донор амина; Y представляет собой линкер; и Z представляет собой группировку-агент.

Число агентов-доноров аминов, которые могут быть конъюгированы с антителом, зависит от: (1) числа содержащих глутамин меток, которые связаны с антителом / введены в антитело, а также числа глутаминов в содержащей глутамин метке; и/или (2) числа эндогенных глутаминов в антителе (то есть нативных глутаминов без конструирования, таких как глутамины в вариабельных доменах, CDR и так далее); и/или (3) числа эндогенных глутаминов, сделанных реакционно-способными посредством конструирования антитела, как описано здесь, или конструированной трансглутаминазы. Например, два агента-донора аминов могут быть конъюгированы с антителом сайт-специфичным образом на карбоксильных концах двух легких цепей, и четыре агента-донора аминов могут быть конъюгированы с антителом сайт-специфичным образом в положениях Q295 и N297Q. В некоторых воплощениях агенты-доноры аминов в каждом конъюгируемом положении могут быть одинаковыми или разными.

Единица-донор амина по настоящему изобретению представляет собой первичный амин (NH₂), обеспечивающий субстрат для трансглутаминазы, позволяя конъюгировать группировку-агент с антителом через содержащую глутамин метку, эндогенный глутамин и/или реакционно-способный эндогенный глутамин. Соответственно, связь между содержащей глутамин меткой, эндогенным глутамином и/или реакционноспособным эндогенным глутамином и единицей-донором амина имеет формулу CH₂-CH₂-CO-NH-, где один NH-связан с одним линкером и одной или более чем одной группировкой-агентом.

Линкер по настоящему изобретению может представлять собой расщепляемый или нерасщепляемый линкер. Например, линкер (с единицей-донором амина) или агент-донор амина могут быть отсоединены от антитела. В некоторых воплощениях линкер может представлять собой пептидный линкер (например, обычную и/или необычную аминокислоту (аминокислоты)) и/или непептидный линкер. Примеры непептидного линкера включают алкильный линкер и РЕС(полиэтиленгликолевый)-линкер.

В некоторых воплощениях «единица-донор амина - линкер» (например, X-Y) представляет собой линейную единицу, содержащую группировку-агент. В других воплощениях «единица-донор амина - линкер» представляет собой разветвленную единицу (например, по меньшей мере 2 единицы), содержащую по меньшей мере приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или более группировок-агентов. В одном варианте группировки-агенты на разветвленном линкере могут представлять собой одинаковые или разные группировки-агенты.

Типичные структуры «единица-донор амина - линкер» включают, без ограничения, Ac-Lys-Gly, аминокапроновую кислоту, Ac-Lys-β-Ala, амино-PEG2-С2, амино-PEG3-C2, амино-PEG6-С2, Ас-Lys-Val-Cit(цитруллин)-РАВС(п-аминобензилоксикарбонил), амино-PEG3-C2-Val-Cit-PABC, амино-PEG6-C2-Val-Cit-PABC, аминокапроил-Val-Cit-PABC, [(3R,5R)-1-{3-[2-(2-аминоэтокси)этокси]пропаноил}пиперидин-3,5-диил]бис-Val-Cit-РАВС, [(3S,5S)-1-{3-[2-(2-аминоэтокси)этокси]пропаноил}пиперидин-3,5-диил]бис-Val-Cit-РАВС, Ac-Lys-путресцин или 2-аминоэтокси.

Группировка-агент конструированного полипептида по настоящему изобретению включает малую молекулу, белок или полипептид и биологически совместимый полимер.

В некоторых воплощениях малая молекула представляет собой цитотоксический агент, иммуносупрессивный агент или агент для визуализации (например, флуорофор). В некоторых воплощениях цитотоксический агент представляет собой химиотерапевтический агент.

Примеры цитотоксического агента включают, без ограничения, антрациклин, ауристатин, доластатин, комбретастатин, дуокармицин, пирролобензодиазепиновый димер, индолинобензодиазепиновый димер, энедиин, гелданамицин, майтансин, пуромицин, таксан, алкалоид барвинка, камптотецин, тубулизин, гемиастерлин, сплайсостатин, пладиенолид и их стереоизомеры, изостеры, аналоги или производные.

Антрациклины имеют происхождение из бактерий Streptomyces, и их используют для лечения широкого спектра видов рака, таких как лейкозы, лимфомы, рак молочной железы, матки, яичника и легкого. Типичные антрациклины включают, без ограничения, даунорубицин, доксорубицин (то есть адриамицин), эпирубицин, идарубицин, валрубицин и митоксантрон.

Доластатины и их пептидные аналоги и производные ауристатины являются высокоактивными антимитотическими агентами, продемонстрировавшими противораковую и противогрибковую активность. См., например, патент США №5663149 и Pettit et al., Antimicrob. Agents Chemother. 42: 2961-2965, 1998. Типичные доластатины и ауристатины включают, без ограничения, доластатин 10, ауристатин Е, ауристатин ЕВ (АЕВ), ауристатин EFP (AEFP), MMAD (монометилауристатин D или монометилдоластатин 10), MMAF (монометилауристатин F или N-метилвалин-валин-долаизолейцин-долапроин-фенилаланин), ММАЕ (монометилауристатин Е или N-метилвалин-валин-долаизолейцин-долапроин-норэфедрин), АЕ-сложный эфир 5-бензоилвалериановой кислоты (AEVB) и другие новые ауристатины (такие как описанные в публикации патента США №2013/0129753). В некоторых воплощениях ауристатин представляет собой 0101 (2-метилаланил-N-[(3R,4S,5S)-3-метокси-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-{[(1S)-2-фенил-1-(1,3-тиазол-2-ил)этил]амино}пропил]пирролидин-1-ил}-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-1-валинамид), имеющий следующую структуру:

В некоторых воплощениях ауристатин представляет собой 3377 (N,2-диметилаланил-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-карбоксил-2-фенилэтил]амино}-1-метокси-2-метил-3-оксопропил]пирролидин-1-ил}-2-метокси-1-[(1S)-1-метилпропил]-4-оксобутил}-N-метил-L-валинамид), имеющий следующую структуру:

.

В некоторых воплощениях ауристатин представляет собой 3377-ОМе (N,2-диметиллаланил-N-[(3R,4S,5S)-3-метокси-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-3-{[(2S)-1-метокси-1-оксо-3-фенил пропан-2-ил]амино}-2-метил-3-оксопропил]пирролидин-1-ил}-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-1-валинамид), имеющий следующую структуру:

В других воплощениях ауристатин представляет собой 0131 (2-метил-L-проли-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-карбокси-2-фенилэтил]амино}-1-метокси-2-метил-3-оксопропил]пирролидин-1-ил}-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамид), имеющий следующую структуру:

В других воплощениях ауристатин представляет собой 0121 (2-метил-L-проли-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-метокси-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил]амино}-1-метокси-2-метил-3-оксопропил]пирролидин-1-ил}-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамид), имеющий следующую структуру:

Камптотецин представляет собой цитотоксический хинолиновый алкалоид, ингибирующий фермент топоизомеразу I. Примеры камптотецина и его производных включают, без ограничения, топотекан, иринотекан и их метаболиты, такие как SN-38.

Комбретастатины являются природными фенолами, обладающими разрушительным действием на сосуды опухолей. Примеры комбретастатинов и их производных включают, без ограничения, комбретастатин А-4 (СА-4) и омбрабулин.

Дуокармицин и СС-1065 являются ДНК-алкилирующими агентами с цитотоксической активностью. См. Boger, Johnson, PNAS 92: 3642-3649 (1995). Типичные дуокармицин и СС-1065 включают, без ограничения, (+)-дуокармицин А и (+)-дуокармицин SA, (+)-СС-1065 и соединения, раскрытые в международной заявке PCT/IB2015/050280, включая, без ограничения: N~2~-ацетил-L-лизил-L-валил-N~5~-карбамоил-N-[4-({[(2-{[({(1S)-1-(хлорметил)-3-[(5-{[(1S)-1-(хлорметил)-5-(фосфоноокси)-1,2-дигидро-3H-бензо[е]индол-3-ил]карбонил}тиофен-2-ил)карбонил]-2,3-дигидро-1Н-бензо[е]индол-5-ил}окси)карбонил](метил)амино}этил)(метил)карбамоил]окси}метил)фенил]-1-орнитинамид, имеющий структуру:

N~2~-ацетил-L-лизил-L-валил-N~5~-карбамоил-N-[4-({[(2-{[({(8S)-8-(хлорметил)-6-[(3-{[(1S)-1-(хлорметил)-8-метил-5-(фосфоноокси)-1,6-дигидропирроло[3,2-е]индол-3(2Н)-ил]карбонил}бицикло[1.1.1]пент-1-ил)карбонил]-1-метил-3,6,7,8-тетрагидропирроло[3,2-е]индол-4-ил}окси)карбонил](метил)амино}этил)(метил)карбамоил]окси}метил)фенил]-L-орнитинамид, имеющий структуру:

N~2~-ацетил-L-лизил-L-валил-N~5~-карбамоил-N-[4-({[(2-{[({(8S)-8-(хлорметил)-6-[(4-{[(1S)-1-(хлорметил)-8-метил-5-(фосфоноокси)-1,6-дигидропирроло[3,2-е]индол-3(2Н)-ил]карбонил}пентацикло[4.2.0.0~2,5~.0~3,8-.0~4,7~]окт-1-ил)карбонил]-1-метил-3,6,7,8-тетрагидропирроло[3,2-е]индол-4-ил}окси)карбонил](метил)амино}этил)(метил)карбамоил]окси}метил)фенил]-L-орнитинамид, имеющий структуру:

Энедиины представляют собой класс противоопухолевых бактериальных продуктов, характеризующихся либо девяти- и десятичленными кольцами, либо присутствием циклической системы конъюгированных тройных-двойных-тройных связей. Типичные энедиины включают, без ограничения, калихеамицин, эсперамицин, унциаламицин, динемицин и их производные.

Гелданамицины представляют собой бензохиноновые ансамициновые антибиотики, связывающиеся с Hsp90 (белком теплового шока 90) и используемые в качестве противоопухолевых лекарственных средств. Типичные гелданамицины включают, без ограничения, 17-AAG (17-N-аллиламино-17-деметоксигелданамицин) и 17-DMAG (17-диметиламиноэтиламино-17-деметоксигелданамицин).

Гемиастерлин и его аналоги (например, HTI-286) связываются с тубулином, нарушают нормальную динамику микротрубочек и, в стехиометрических количествах, приводят к деполимеризации микротрубочек.

Майтансины или их производные майтансиноиды ингибируют пролиферацию клеток, ингибируя образование микротрубочек во время митоза посредством ингибирования полимеризации тубулина. См. Remillard et al., Science 189: 1002-1005 (1975). Типичные майтансины и майтансиноиды включают, без ограничения, мертансин (DM1) и его производные, а также ансамитоцин.

Пирролобензодиазепиновые димеры (PBD) и индолинобензодиазепиновые димеры (IGN) являются противоопухолевыми агентами, содержащими одну или более чем одну имминную функциональную группу или их эквиваленты, связывающиеся с двухцепочечной ДНК. Молекулы PBD и IGN основаны на природном продукте атрамицине и взаимодействуют с ДНК последовательность-селективным образом, предпочтительно с последовательностями пурин-гуанин-пурин. Типичные PBD и их аналоги включают, без ограничения, SJG-136.

Сплайсостатины и пладиенолиды являются противоопухолевыми соединениями, ингибирующими сплайсинг и взаимодействующими со сплайсосомой SF3b. Примеры сплайсостатинов включают, без ограничения, сплайсостатин A, FR901464 и (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-гидразинил-2-оксоэтил)-4-гидрокси-1,6-диоксаспиро[2.5]окт-5-ил]-3-метилпента-2,4-диен-1-ил}-2,5-диметилтетрагидро-2Н-пиран-3-ил]амино}-5-оксопент-3-ен-2-илацетат, имеющий структуру:

Примеры пладиенолидов включают, без ограничения, пладиенолид В, пладиенолид D и Е7107.

Таксаны представляют собой дитерпены, действующие как противотубулиновые агенты или ингибиторы митоза. Типичные таксаны включают, без ограничения, паклитаксел (например, TAXOL^®) и доцетаксел (TAXOTERE^®).

Тубулизины представляют собой природные продукты, выделенные из штамма миксобактерий, приводящие, как продемонстрировано, к деполимеризации микротрубочек и остановке митоза. Типичные тубулизины включают, без ограничения, тубулизин А, тубулизин В и тубулизин D.

Алкалоиды барвинка также являются противотубулиновыми агентами. Типичные алкалоиды барвинка включают, без ограничения, винкристин, винбластин, виндезин и винорелбин.

В некоторых воплощениях группировка-агент представляет собой иммуносупрессивный агент. Примеры иммуносупрессивных агентов включают, без ограничения, ганцикловир, этанерцепт, такролимус, сиролимус, воклоспорин, циклоспорин, рапамицин, циклофосфамид, азатиоприн, микофенолата мофетил, метотрексат, глюкокортикоиды и их аналоги и производные.

В некоторых воплощениях группировка-агент представляет собой агент для визуализации (например, флуорофор или хелатор), такой как флуоресцеин, родамин, люминофоры на основе лантанидов и их производные или радиоизотоп, связанный с хелатором. Примеры флуорофоров включают, без ограничения, флуоресцеин изотиоцианат (FITC) (например, 5-FITC), флуоресцеин амидит (FAM) (например, 5-FAM), эозин, карбоксифлуоресцеин, эритрозин, Alexa Fluor^® (например, Alexa 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 647, 660, 680, 700 или 750), карбокситетраметилродамин (TAMRA) (например, 5-TAMRA), тетраметилродамин (TMR) и сульфородамин (SR) (например, SR101). Примеры хелаторов включают, без ограничения, 1,4,7,10-тетраазациклододекан-N,N',N'',N'''-тетрауксусную кислоту (DOTA), 1,4,7-триазациклононан-1,4,7-триуксусную кислоту (NOTA), 1,4,7-триазациклононан-1-глутаровую-4,7-уксусную кислоту (дефероксамин), диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA) и 1,2-бис(о-аминофенокси)этан-N,N,N',N'-тетрауксусную кислоту) (ВАРТА).

В некоторых воплощениях группировка-агент представляет собой полипептид. В некоторых воплощениях полипептид представляет собой антитело, такое как гуманизированное, человеческое, химерное или мышиное моноклональное антитело.

В некоторых воплощениях группировка-агент представляет собой полипептидный токсин (или белковый токсин). Примеры полипептидных токсинов включают, без ограничения, цепь А дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь А экзотоксина, цепь А рицина, цепь А абрина, цепь А модессина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, диантиновые белки, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин, трикотецены, пептиды с ингибиторным цистиновым узлом (ICK) (например, цератотоксины) и конотоксин (например, KIIIA или SmIIIa).

В некоторых воплощениях радиоизотопы или другие метки могут быть включены в группировку-агент (например, посредством связывания с хелатором) для конъюгирования антитела с агентом-донором амина, несущим хелатор. Примеры радиоизотопов или других меток включают, без ограничения, ³Н, ¹⁴С, ¹⁵N, ³⁵S, ¹⁸F, ³²Р, ³³Р, ⁶⁴Cu, ⁶⁸Ga,⁸⁹Zr, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹¹¹In, ¹³¹In, ¹⁵³Sm, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ²¹¹At, ²¹²Bi и ¹⁵³Pb.

В некоторых воплощениях группировка-агент представляет собой биологически совместимый полимер. Антитело может быть конъюгировано с биологически совместимым полимером через содержащую глутамин метку, эндогенный глутамин и/или реакционно-способный эндогенный глутамин для улучшения биологических характеристик антитела, например для увеличения периода полувыведения из сыворотки и биологической активности и/или для продления периода полувыведения in vivo. Примеры биологически совместимых полимеров включают водорастворимые полимеры, такие как полиэтиленгликоль (PEG) или его производные, и биологически совместимые полимеры, содержащие цвиттер-ионы (например, полимеры, содержащие фосфорилхолин).

В некоторых воплощениях агент-донор амина (X-Y-Z) представляет собой

или

где X представляет собой NH₂ (то есть образует, таким образом, ковалентную связь с глутамином, такую как CH₂-CH₂-CO-NH-), m составляет от 0 до 20, n составляет от 1 до 8, р составляет от 0 до 3, q представляет собой 0 или 1, аминокислота представляет собой любую обычную или необычную аминокислоту, и Z представляет собой цитотоксический агент или агент для визуализации.

Обычные или встречающиеся в природе аминокислоты разделяют на группы на основании общих свойств боковых цепей: (1) неполярные: Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) полярные незаряженные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) кислые (отрицательно заряженные): Asp, Glu; (4) основные (положительно заряженные): Lys, Arg; и (5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: Gly, Pro; и (6) ароматические: Trp, Tyr, Phe, His. Обычные аминокислоты включают L- или D-стереохимию.

Необычные аминокислоты представляют собой аминокислоты, не встречающиеся в природе. Примеры необычных аминокислот включают, без ограничения, аминоадипиновую кислоту, бета-аланин, бета-аминопропионовую кислоту, аминомасляную кислоту, пиперидиновую кислоту, аминокапроновую кислоту, аминогептановую кислоту, аминоизомасляную кислоту, аминопимелиновую кислоту, цитруллин, диаминомасляную кислоту, десмозин, диаминопимелиновую кислоту, диаминопропионовую кислоту, N-этилглицин, N-этиласпарагин, гидроксилизин, аллогидроксилизин, гидроксипролин, изодесмозин, аллоизолейцин, N-метилглицин, саркозин, N-метилизолейцин, N-метилвалин, норвалин, норлейцин, орнитин, 4-гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат, ε-N,N,N-триметиллизин, ε-N-ацетиллизин, О-фосфосерин, N-ацетилсерин, N-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, σ-N-метиларгинин и другие сходные аминокислоты и производные аминокислот (например, 4-гидроксипролин).

В некоторых воплощениях агент-донор амина представляет собой биологически совместимый полимер, содержащий реакционно-способный амин и группировку-агент.

В некоторых воплощениях агент-донор амина выбран из группы, состоящей из Alexa 488 кадаверина, 5-FITC кадаверина, Alexa 647 кадаверина, Alexa 350 кадаверина, 5-TAMRA кадаверина, 5-FAM кадаверина, SR101 кадаверина, 5,6-TAMRA кадаверина, 5-FAM лизина, Ac-Lys-Gly-MMAD, амино-PEG3-C2-MMAD, амино-PEG6-C2-MMAD, амино-PEG3-С2-аминононаноил-MMAD, аминокапроил-Val-Cit-PABC-MMAD, Ac-Lys-β-Ala-MMAD, аминокапроил-MMAD, амино-PEG6-C2-Val-Cit-PABC-MMAD, Ac-Lys-Val-Cit-PABC-MMAD, Ас-Lys-Val-Cit-PABC-0101, амино-PEG3-C2-Val-Cit-PABC-MMAD, амино-PEG6-C2-Val-Cit-PABC-0101, аминокапроил-ММАЕ, амино-PEG3-С2-ММАЕ, амино-PEG2-C2-MMAE, аминокапроил-MMAF, аминокапроил-Val-Cit-PABC-MMAE, амино-PEG6-C2-Val-Cit-PABC-MMAF, аминокапроил-Val-Cit-PABC-MMAF, амино-PEG2-C2-MMAF, амино-PEG3-C2-MMAF, путресцинилгелданамицина, Ac-Lys-путресцинилгелданамицина, аминокапроил-3377, аминокапроил-0131, амино-PEG6-C2-0131, амино-PEG6-C2-3377, аминокапроил-0121, амино-PEG6-C2-0121, [(3R,5R)-1-{3-[2-(2-аминоэтокси)этокси]пропаноил}пиперидин-3,5-диил]бис-Val-Cit-РАВС-MMAD, [(3R,5R)-1-{3-[2-(2-аминоэтокси)этокси]пропаноил}пиперидин-3,5-диил]бис-Val-Cit-РАВС-ММАЕ, 2-аминоэтокси-PEG6-NODAGA (или 2,2'-(7-(1-амино-28-карбокси-25-оксо-3,6,9,12,15,18,21-гептаокса-24-азаоктакозан-28-ил)-1,4,7-триазонан-1,4-диил)диуксусной кислоты) и N-2-ацетил-L-лизил-1-валил-N~5~-карбамоил-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-8-гидрокси-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-гидроксипент-2-еноил]амино}-3,6-диметилтетрагидро-2Н-пиран-2-ил]-3-метилпента-1,3-диен-1-ил}-1,6-диоксаспиро[2.5]окт-5-ил]ацетил}гидразинил)карбонил]окси}метил)фенил]-L-орнитинамида. В некоторых воплощениях агент-донор амина представляет собой Ac-Lys-Val-Cit-PABC-MMAD, Ac-Lys-Val-Cit-PABC-0101 или амино-PEG6-C2-MMAD. В некоторых воплощениях содержащая глутамин метка-донор ацила содержит аминокислотную последовательность GGLLQGA (SEQ ID NO: 23) или GGLLQGPP (SEQ ID NO: 22) и, дополнительно, LLQGA (SEQ ID NO: 11), LLQGPP (SEQ ID NO: 20) или LLQG (SEQ ID NO: 2), и агент-донор амина представляет собой Ac-Lys-Val-Cit-PABC-MMAD, Ac-Lys-Val-Cit-PABC-0101 и/или амино-PEG6-C2-MMAD. Типичные структуры агента-донора амина перечислены в Таблице 2.

Способы получения конъюгатов «антитело - лекарственное средство» с повышенной лекарственной нагрузкой

Также предложены способы получения ADC, описанных здесь. В одном аспекте согласно изобретению предложен способ получения ADC, содержащего формулу антитело-(Т-(X-Y-Z_a)_b)_c, где: Т представляет собой (1) конструированную в определенном сайте содержащую глутамин метку, (2) эндогенный глутамин и/или (3) эндогенный глутамин, сделанный реакционно-способным посредством конструирования антитела или конструированной трансглутаминазы; X представляет собой единицу-донор амина; Y представляет собой линкер; и Z представляет собой группировку-агент; X-Y-Z представляет собой агент-донор амина, конъюгированный сайт-специфичным образом с содержащей глутамин меткой, эндогенным глутамином и/или реакционно-способным эндогенным глутамином; а представляет собой целое число от 1 до 6; b представляет собой целое число от 1 до 6; с представляет собой целое число от 1 до 20; и где произведение a, b и с (соотношение лекарственного средства к антителу) составляет по меньшей мере приблизительно 5; включающий стадии, на которых: (а) беруг молекулу антитело-Т, которая содержит антитело и содержащую глутамин метку и/или антитело с эндогенным и/или реакционно-способным эндогенным глутамином; (б) приводят агент-донор амина в контакт с молекулой антитело-Т в присутствии трансглутаминазы (например, конструированной трансглутаминазы или очищенной трансглутаминазы); и (в) обеспечивают возможность антителу-Т ковалентно связываться с агентом-донором амина с образованием конъюгата «антитело - лекарственное средство». В некоторых воплощениях молекулу антитело-Т экспрессируют в клетках СНО.

В некоторых воплощениях эффективность конъюгирования ADC, полученного с применением способов, описанных здесь, составляет по меньшей мере приблизительно 51%. В некоторых воплощениях эффективность конъюгирования ADC составляет по меньшей мере приблизительно 51%-60%, 61%-70%, 71%-80%, 81%-90% или 91%-100%. В некоторых воплощениях эффективность конъюгирования ADC составляет приблизительно 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% или 100%.

В некоторых воплощениях соотношение молярных концентраций агента-донора амина, приводимого в контакт, и молекулы антитело-Т, приводимой в контакт, составляет от приблизительно 4:1 до приблизительно 10000:1. Например, соотношение молярных концентраций агента-донора амина (например, цитотоксического лекарственного средства) и антитела (например, соединенного с содержащей глутамин меткой или содержащего нативный/реакционно-способный глутамин), загруженных или используемых для реакции конъюгирования, катализируемой трансглутаминазой, может составлять приблизительно 20:1. В некоторых воплощениях соотношение концентраций агента-донора амина, приводимого в контакт, и молекулы антитело-Т, приводимой в контакт, составляет приблизительно 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 200:1, 300:1, 400:1, 500:1, 600:1, 700:1, 800:1, 900:1, 1000:1, 2000:1, 3000:1, 4000:1, 5000:1, 6000:1, 7000:1, 8000:1, 9000:1 или 10000:1.

В некоторых воплощениях, когда антитело конъюгируют с агентом-донором амина через содержащую глутамин метку, эндогенный глутамин и/или реакционно-способный эндогенный глутамин в определенном сайте, ADC более стабилен (например, имеет более продолжительный период полувыведения in vivo) и/или имеет увеличенную площадь под фармакокинетической кривой. Например, ADC, содержащий аминокислотные модификации N297Q и K222R, содержащую(ие) глутамин метку(и) на карбоксильном конце легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела и/или в одном или более чем одном положении в легкой цепи или тяжелой цепи антитела (например, см. Таблицу 1), как описано здесь, стабильнее традиционного ADC с малеимидной связью.

В некоторых воплощениях способы, предложенные здесь, дополнительно включают стадию очистки. ADC, описанные здесь, могут быть очищены с применением различных способов очистки, таких как, например, хроматография на гидроксиапатите, диализ, аффинная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC) (например, фракционирование на HIC), преципитация с сульфатом аммония, преципитация с полиэтиленгликолем или производными полиэтиленгликоля, анионо- или катионообменная хроматография, HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография) с обращенной фазой, хроматография на диоксиде кремния, хроматофокусирование, SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия), гель-фильтрация, эксклюзионная хроматография и слабая распределительная хроматография (weak partitioning chromatography).

В некоторых воплощениях по меньшей мере одна стадия очистки включает стадию способа аффинной хроматографии. Для аффинной очистки конструированных Fc-содержащих полипептидных конъюгатов, описанных здесь, может быть использован лиганд на основе белка А (синтетического, рекомбинантного или нативного). Лиганд на основе синтетического или рекомбинантного белка А может быть приобретен из коммерческих источников от GE Healthcare (Piscataway, NJ), Pierce (Rockford, IL), Sigma-Aldrich (St. Louis, МО) или Applied Biosystems (Foster City, CA), и лиганд на основе нативного белка А (например, MABSELECT™, PROSEP™ Va и PROSEP™ Ultra Plus) может быть приобретен из коммерческих источников от GE Healthcare (Piscataway, NJ) или Millipore (Billerica, MA).

В некоторых воплощениях очищенный ADC, как описано здесь, полученный в результате стадии очистки, имеет высокую степень чистоты, то есть степень чистоты по меньшей мере приблизительно 70%-75%, 75%-80%, 80%-85%, 85%-90%, 90%-95%, 95%-98% или 99%. Например, степень чистоты очищенного ADC составляет приблизительно 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%.

Способ применения конъюгатов «антитело - лекарственное средство» с высокой лекарственной нагрузкой ADC по настоящему изобретению полезны в различных применениях, включая, без ограничения, способы терапевтического лечения и способы диагностического лечения.

В одном аспекте согласно изобретению предложен способ лечения рака у субъекта. Соответственно, в некоторых воплощениях предложен способ лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту эффективного количества композиции (например, фармацевтической композиции), содержащей ADC, как описано здесь. При использовании здесь виды рака включают, без ограничения, солидный рак (такой как рак мочевого пузыря, молочной железы, шейки матки, хориокарциному, рак толстой кишки, пищевода, желудка, глиобластому, рак головы и шеи, почки, печени, легкого (например, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC)), полости рта, яичника, поджелудочной железы, предстательной железы и кожи) и опухоли системы крови (такие как острый лимфобластный лейкоз (ALL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), острый миелогенный лейкоз (AML), хронический миелогенный лейкоз (CML), волосатоклеточный лейкоз (HCL), Т-клеточный пролимфоцитарный лейкоз (T-PLL), лейкоз из больших гранулярных лимфоцитов, множественную миелому, неходжкинскую лимфому (NHL) (включая фолликулярную лимфому (FL) и диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому (DLBCL)) и Т-клеточный лейкоз взрослых.

В некоторых воплощениях предложен способ ингибирования роста или прогрессирования опухоли у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту эффективного количества композиции, содержащей ADC, как описано здесь. В других воплощениях предложен способ ингибирования метастазирования раковых клеток или опухолей (например, солидных опухолей или опухолей системы крови) у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту эффективного количества композиции, содержащей ADC, как описано здесь. В других воплощениях предложен способ индуцирования регресса опухоли у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту эффективного количества композиции, содержащей ADC, как описано здесь.

В другом аспекте предложен способ выявления, диагностики и/или мониторинга состояния, ассоциированного с раковым белком (например, Trop-2, BRCA1 (ген 1 рака молочной железы), BRCA2, HER2 (рецептор человеческого эпидермального фактора роста 2 типа), VEGF (фактор роста эндотелия сосудов), CD20, CD25, EFGR, 5Т4, CD22 и так далее) in vivo или in vitro. Соответственно, в некоторых воплощениях предложен способ диагностики рака у субъекта, у которого подозревают рак, включающий (а) приведение образца от субъекта в контакт с ADC, как описано здесь, в условиях, приводящих к связыванию ADC с раковым белком, и (б) определение наличия связывания ADC с раковым белком.

Группировка-агент в ADC, как описано здесь, может представлять собой выявляемую группировку, такую как агент для визуализации и фермент-субстратная метка. ADC, как описано здесь, могут также быть использованы для диагностических анализов in vivo, таких как визуализация in vivo (например, PET (позитроно-эмиссионная томография) или SPECT (однофотонная эмиссионная компьютерная томография)), или в качестве реагента для окрашивания.

В некоторых воплощениях способы, описанные здесь, дополнительно включают стадию лечения субъекта дополнительной формой терапии. В некоторых воплощениях дополнительная форма терапии представляет собой дополнительную противораковую терапию, включая, без ограничения, химиотерапию, лучевую терапию, хирургическое вмешательство, гормональную терапию и/или дополнительную иммунотерапию.

В некоторых воплощениях дополнительная форма терапии включает введение одного или более чем одного терапевтического агента в дополнение к ADC, как описано здесь. Терапевтические агенты включают, без ограничения, второй ADC (например, традиционный ADC, такой как брентуксимаб ведотин (ADCETRIS^®) и адо-трастузумаб эмтанзин (KADCYLA^®)), антитело (например, антитело против VEGF, антитело против HER2, антитело против CD25, и/или антитело против CD20), ингибитор ангиогенеза, цитотоксический агент (например, доцетаксел, цисплатин, доксорубицин, митомицин, тамоксифен или фторурацил) и противовоспалительный агент (например, преднизон и прогестерон).

Фармацевтические композиции

Согласно настоящему изобретению также предложена фармацевтическая композиция, содержащая ADC с повышенной лекарственной нагрузкой, как описано здесь, в фармацевтически приемлемом эксципиенте или носителе. ADC могут быть введены сами по себе, или в комбинации с одним или более чем одним другим ADC по настоящему изобретению, или в комбинации с одним или более чем одним другим лекарственным средством (или в форме любой их комбинации). Например, ADC по настоящему изобретению могут быть введены в комбинации с традиционными ADC (например, с DAR 1-4) или сайт-специфичными ADC с применением технологии конъюгирования, опосредованной трансглутаминазой, как описано здесь, с DAR 1-4. Таким образом, способы и применения по изобретению также включают воплощения комбинаций (совместного введения) с другими активными агентами, как описано ниже.

Подразумевают, что при использовании здесь термин «совместное введение», «вводимый совместно» или «в комбинации с» обозначает и относится к следующему: (1) одновременное введение комбинации ADC, раскрытого здесь, и терапевтического(их) агента(ов) пациенту, нуждающемуся в лечении, когда такие компоненты включены вместе в одну лекарственную форму, высвобождающую указанные компоненты у указанного пациента по существу одновременно; (2) по существу одновременное введение такой комбинации ADC, раскрытого здесь, и терапевтического(их) агента(ов) пациенту, нуждающемуся в лечении, когда такие компоненты включены отдельно друг от друга в отдельные лекарственные формы, принимаемые указанным пациентом по существу одновременно, вследствие чего происходит по существу одновременное высвобождение указанных компонентов у указанного пациента; (3) последовательное введение такой комбинации ADC, раскрытого здесь, и терапевтического(их) агента(ов) пациенту, нуждающемуся в лечении, когда такие компоненты включены отдельно друг от друга в отдельные лекарственные формы, принимаемые указанным пациентом последовательно с существенным временным интервалом между каждым приемом, вследствие чего высвобождение указанных компонентов у указанного пациента происходит в существенно разные моменты времени; и (4) последовательное введение такой комбинации ADC, раскрытого здесь, и терапевтического(их) агента(ов) пациенту, нуждающемуся в лечении, когда такие компоненты включены вместе в одну лекарственную форму, высвобождающую указанные компоненты контролируемым образом, вследствие чего происходит их параллельное, последовательное и/или перекрывающееся высвобождение у указанного пациента, одновременно и/или в разные моменты времени.

В целом, раскрытые здесь ADC являются подходящими для введения в форме композиции вместе с одним или более чем одним фармацевтически приемлемым эксципиентом. Термин «эксципиент» использован здесь для описания любого ингредиента, отличного от соединения(ий) по изобретению. Выбор эксципиента(ов) в значительной степени зависит от таких факторов, как конкретный способ введения, эффект эксципиента на растворимость и стабильность и тип лекарственной формы. При использовании здесь «фармацевтически приемлемый эксципиент» включает все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические агенты, агенты, задерживающие всасывание, и тому подобные, являющиеся физиологически совместимыми. Некоторыми примерами фармацевтически приемлемых эксципиентов являются вода, физиологический раствор, забуференный фосфатом физиологический раствор, декстроза, глицерин, этанол и тому подобное, а также их комбинации. В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция содержит изотонические агенты, включая, без ограничения, сахара, полиспирты (например, маннит, сорбит) или хлорид натрия. Дополнительные примеры фармацевтически приемлемых веществ включают, без ограничения, смачивающие агенты или небольшие количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие агенты или эмульгаторы, консерванты или буферы, продлевающие срок хранения или повышающие эффективность антитела.

Согласно настоящему изобретению также предложена фармацевтическая композиция, содержащая совокупность ADC с повышенной лекарственной нагрузкой по настоящему изобретению, как описано здесь, где среднее соотношение лекарственного средства к антителу (DAR) составляет от приблизительно 5,0 до приблизительно 720,0. В некоторых воплощениях среднее DAR составляет по меньшей мере приблизительно 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5.4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 16,0, 16,5, 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,5, 20,0, 30,0, 40,0, 50,0, 60,0, 70,0, 80,0, 90,0, 100,0, 110,0, 120,0, 130,0, 140,0, 150,0, 200,0, 250,0, 300,0, 350,0, 400,0, 450,0, 500,0, 550,0, 600,0, 650,0 или 700,0.

В одном варианте согласно настоящему изобретению также предложена фармацевтическая композиция, содержащая совокупность ADC, где по меньшей мере один ADC представляет собой ADC с повышенной лекарственной нагрузкой по настоящему изобретению, как описано здесь, и где среднее соотношение лекарственного средства к антителу составляет от приблизительно 4,1 до приблизительно 720,0. В некоторых воплощениях среднее DAR составляет по меньшей мере приблизительно 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 16,0, 16,5, 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,5, 20,0, 30,0, 40,0, 50,0, 60,0, 70,0, 80,0, 90,0, 100,0, 110,0, 120,0, 130,0, 140,0, 150,0, 200,0, 250,0, 300,0, 350,0, 400,0, 450,0, 500,0, 550,0, 600,0, 650,0 или 700,0. Например, фармацевтическая композиция может содержать один или более чем один сайт-специфичный ADC, имеющий DAR по меньшей мере приблизительно 5, как описано здесь, и один или более чем один сайт-специфичный ADC (с применением технологии конъюгирования, опосредованного трансглутаминазой, как описано здесь), имеющий DAR 1, 2, 3 или 4. В качестве еще одного примера, фармацевтическая композиция может содержать (1) один или более чем один сайт-специфичный ADC, имеющий DAR по меньшей мере приблизительно 5, как описано здесь, (2) один или более чем один сайт-специфичный ADC (с применением технологии конъюгирования, опосредованного трансглутаминазой, как описано здесь), имеющий DAR 1, 2, 3 или 4, и (3) один или более чем один традиционный ADC с малеимидной связью с DAR 1, 2, 3, 4 или более.

В некоторых воплощениях описанные здесь ADC могут быть деиммунизированы для снижения иммуногенности при введении субъекту с применением известных методик, таких как описанные, например, в РСТ-публикациях WO 98/52976 и WO 00/34317.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению и способы их изготовления очевидны для специалистов в данной области. Такие композиции и способы их изготовления можно обнаружить, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, 22^nd Edition (Mack Publishing Company, 2012). Фармацевтические композиции предпочтительно изготавливают по стандартам GMP (надлежащая производственная практика).

Фармацевтическая композиция по изобретению может быть изготовлена, упакована или представлена в продаже в нефасованной форме, в форме стандартной разовой дозы или в форме совокупности стандартных разовых доз. При использовании здесь «стандартная доза» представляет собой дискретное количество фармацевтической композиции, содержащее предопределенное количество активного ингредиента. Количество активного ингредиента обычно равно дозе активного ингредиента, которую будут вводить субъекту, или подходящей доле такой дозы, такой как, например, одна вторая или одна третья такой дозы. Любой способ введения пептидов, белков или антител, принятый в данной области, может быть подходящим образом применен для конструированных полипептидных конъюгатов, раскрытых здесь.

Фармацевтические композиции по изобретению обычно являются подходящими для парентерального введения. Парентеральное введение фармацевтической композиции включает любой путь введения, характеризующийся физическим проникновением через ткань субъекта и введением фармацевтической композиции через повреждение в ткани, что обычно приводит к введению непосредственно в кровоток, в мышцу или во внутренний орган. Например, парентеральное введение включает, без ограничения, введение фармацевтической композиции посредством инъекции композиции, применения композиции через хирургический разрез, применения композиции через проникающую в ткань нехирургическую рану и тому подобное. В частности, предполагают, что парентеральное введение включает, без ограничения, подкожную, внутрибрюшинную, внутримышечную, интрастернальную, внутривенную, внутриаретриальную, интратекальную, интравентрикулярную, интрауретральную, интракраниальную, интрасиновиальную инъекцию или инфузии; и методики инфузии при диализе почек. В некоторых воплощениях парентеральное введение представляет собой внутривенный или подкожный способ введения.

Фармацевтические композиции, подходящие для парентерального введения, обычно содержат активный ингредиент в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, таким как стерильная вода или стерильный изотонический физиологический раствор. Такие композиции могут быть изготовлены, упакованы или представлены в продаже в форме, подходящей для болюсного введения или для непрерывного введения. Композиции для инъекций могут быть изготовлены, упакованы или представлены в продаже в стандартной лекарственной форме, например в ампулах или в многодозовых контейнерах, содержащих консервант. Композиции для парентерального введения включают, без ограничения, суспензии, растворы, эмульсии в масляных или водных наполнителях, пасты и тому подобное. Такие композиции могут дополнительно содержать один или более чем один дополнительный ингредиент, включая, без ограничения, суспендирующие, стабилизирующие или диспергирующие агенты. В одном воплощении композиции для парентерального введения активный ингредиент представлен в сухой форме (например, в форме порошка или гранул) для восстановления подходящим разбавителем (например, стерильной апирогенной водой) перед парентеральным введением восстановленной композиции. Композиции для парентерального введения также включают водные растворы, которые могут содержать эксципиенты, такие как соли, углеводы и забуферивающие агенты (предпочтительно до pH 3-9), но в некоторых применениях они могут более подходящим образом быть изготовлены в форме стерильных неводных растворов или в высушенной форме для использования в сочетании с подходящим разбавителем, таким как стерильная апирогенная вода. Типичные формы для парентерального введения включают растворы или суспензии в стерильных водных растворах, например водных растворах пропиленгликоля или декстрозы. Если желательно, такие лекарственные формы могут быть подходящим образом забуферены. Другие полезные композиции для парентерального введения включают композиции, содержащие активный ингредиент в микрокристаллической форме или в липосомальном препарате. Композиции для парентерального введения могут быть изготовлены для немедленного и/или модифицированного высвобождения. Композиции с модифицированным высвобождением включают композиции с контролируемым, отсроченным, длительным, прерывистым, направленным и программируемым высвобождением. Например, в одном аспекте стерильные растворы для инъекций могут быть получены посредством включения конструированного Fc-содержащего полипептида, например конъюгата «антитело - лекарственное средство» или биспецифичного антитела, в необходимом количестве в подходящий растворитель, по необходимости с одним из или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, с последующей стерилизующей фильтрацией. Обычно дисперсии получают посредством включения активного соединения в стерильный наполнитель, содержащий основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций предпочтительными способами получения являются вакуумная сушка и лиофильная сушка, приводящие к получению порошка активного ингредиента и любого дополнительного желаемого ингредиента из их раствора, предварительно стерилизованного фильтрацией. Надлежащую текучесть раствора можно поддерживать, например, используя покрытие, такое как лецитин, поддерживая необходимый размер частиц в случае дисперсии и используя поверхностно-активные вещества. Продолжительное всасывание композиций для инъекций может быть обеспечено посредством включения в композицию агента, задерживающего всасывание, например моностеаратных солей и желатина.

Схемы дозирования можно корректировать для обеспечения оптимального желаемого ответа. Например, может быть введен один болюс, могут быть введены несколько раздельных доз на протяжении некоторого периода времени, или дозу можно пропорционально снижать или повышать в зависимости от особенностей терапевтической ситуации. Особенно предпочтительно изготавливать композиции для парентерального введения в стандартной лекарственной форме для простоты введения и единообразия доз. При использовании здесь стандартная лекарственная форма относится к физически дискретным единицам, подходящим для использования в качестве единичных доз у пациентов/субъектов, для которых предназначено лечение, где каждая единица содержит предопределенное количество активного соединения, рассчитанное для оказания желаемого терапевтического эффекта, вместе с необходимым фармацевтическим носителем. Описание стандартных лекарственных форм по изобретению обычно продиктовано: (а) уникальными свойствами группировки-агента (например, малой молекулы, такой как цитотоксический агент) и конкретным терапевтическим или профилактическим эффектом, который необходимо достичь; и (б) ограничениями, присущими области включения такого активного соединения в лекарственные формы для лечения чувствительности у индивидов, и непосредственно зависит от них.

Таким образом, исходя из представленного здесь описания, специалисту в данной области будет ясно, что дозу и схему введения корректируют в соответствии со способами, хорошо известными в терапевтической области. То есть может быть легко определена максимальная переносимая доза, и также может быть определено эффективное количество, обеспечивающее выявляемый терапевтический полезный эффект у пациента, как и временные требования для введения каждого агента для обеспечения выявляемого терапевтического полезного эффекта у пациента. Соответственно, несмотря на то, что здесь приведены примеры определенных доз и схем введения, эти примеры никоим образом не ограничивают дозу и схему введения, которые могут быть использованы у пациента при практическом применении настоящего изобретения.

Следует отметить, что значения доз могут варьировать в зависимости от типа и тяжести состояния, подлежащего облегчению, и могут включать однократные или многократные дозы. Следует также понимать, что для любого конкретного субъекта конкретные схемы введения следует корректировать с течением времени в соответствии с индивидуальными потребностями и профессиональным суждением лица, осуществляющего или контролирующего введение композиций, и что диапазоны доз, приведенные здесь, являются лишь примерами, и подразумевают, что они не ограничивают объем или практическое применение заявленной композиции. Кроме того, схема введения композиций по данному изобретению может быть основана на множестве факторов, включая тип заболевания, возраст, массу тела, пол и состояние здоровья пациента, тяжесть состояния, путь введения и конкретное используемое антитело. Таким образом, схема введения может варьировать в широких пределах, но может быть определена рутинным образом с применением стандартных способов. Например, дозы можно корректировать по фармакокинетическим или фармакодинамическим параметрам, которые могут включать клинические эффекты, такие как токсические эффекты, и/или лабораторные показатели. Таким образом, настоящее изобретение включает повышение дозы у отдельных пациентов по усмотрению специалиста. Определение подходящих доз и схем введения хорошо известно в соответствующей области и будет ясно специалисту, располагающему информацией, раскрытой здесь.

Для введения субъектам-людям общая месячная доза ADC, раскрытого здесь, обычно входит в диапазон от приблизительно 0,01 мг до приблизительно 1200 мг на пациента, в зависимости, конечно, от способа введения. Например, необходимая месячная доза для внутривенного введения может составлять от приблизительно 1 до приблизительно 1000 мг на пациента. Общая месячная доза может быть введена в форме одной дозы или отдельных доз и может, по усмотрению врача, выходить за пределы типичного диапазона, указанного здесь.

Типичный неограничивающий диапазон для терапевтически или профилактически эффективного количества ADC, как раскрыто здесь, составляет от приблизительно 0,01 до приблизительно 1000 мг на пациента в месяц. В определенных воплощениях ADC можно вводить в дозе от приблизительно 1 до приблизительно 200 или от приблизительно 1 до приблизительно 150 мг на пациента в месяц. В некоторых воплощениях пациент представляет собой человека.

Наборы

Согласно изобретению также предложены наборы (или изделия) для применения в лечении расстройств, описанных выше. Наборы по изобретению содержат один или более чем один контейнер, содержащий очищенный ADC, и инструкции по применению конъюгата для лечения заболевания. Например, инструкции содержат описание введения ADC для лечения заболевания, такого как рак (например, солидный рак или опухоль системы крови). Набор может дополнительно содержать описание выбора индивида, подходящего для лечения, на основе выяснения наличия заболевания у индивида и стадии заболевания.

Инструкции, относящиеся к применению ADC, обычно содержат информацию, относящуюся к дозе, схеме дозирования и пути введения для предполагаемого лечения. Контейнеры могут представлять собой разовые дозы, упаковки с нефасованной формой (например, многодозовые контейнеры) или дробные дозы. Инструкции, присутствующие в наборах по изобретению, обычно представляют собой письменные инструкции на этикетке или вкладыше (например, листе бумаги, включенном в набор), но также приемлемы машиночитаемые инструкции (например, инструкции на магнитном или оптическом запоминающем диске).

Наборы по данному изобретению представлены в подходящей упаковке. Подходящая упаковка включает, без ограничения, флаконы, бутылки, банки, мягкую упаковку (например, герметичные майларовые или полиэтиленовые пакеты) и тому подобное. Также предполагают упаковку для использования в комбинации с определенным устройством, таким как ингалятор, устройство для назального введения (например, аэрозольный ингалятор) или инфузионное устройство, такое как мини-насос. Набор может иметь стерильное входное отверстие (например, контейнер может представлять собой пакет с раствором для внутривенного введения или флакон с пробкой, прокалываемой иглой для подкожных инъекций). Контейнер может также иметь стерильное входное отверстие (например, контейнер может представлять собой пакет с раствором для внутривенного введения или флакон с пробкой, прокалываемой иглой для подкожных инъекций). По меньшей мере один активный агент в композиции представляет собой ADC с повышенной лекарственной нагрузкой, как описано здесь. Контейнер может дополнительно содержать второй фармацевтически активный агент.

Наборы могут возможно содержать дополнительные компоненты, такие как буферы и пояснительная информация. Обычно набор содержит контейнер и этикетку или вкладыш(и) на контейнере или в связи с ним.

ПРИМЕРЫ

Следует понимать, что примеры и воплощения, описанные здесь, приведены лишь в иллюстративных целях, и что в их свете специалистам в данной области будут предложены различные модификации или изменения, которые следует включать в сущность и объем данной заявки.

Пример 1: Цитотоксичность ADC против Trop-2 с возрастающей повышенной лекарственной нагрузкой, конъюгированных сайт-специфичным образом, в клетках с высокой экспрессией мишени (B×PC3. Trop-2+++)

В этом примере показана цитотоксичность ADC (сайт-специфичных и традиционных) с повышенной лекарственной нагрузкой in vitro в клетках B×PC3 с высоким уровнем экспрессии мишени.

Конъюгирование антител с лекарственными средствами

А. Конъюгирование антител с лекарственными средствами, опосредованное трансглутаминазой

Химерные мышиные антитела против Trop-2 экспрессировали как конструированные человеческие подтипы IgG1 с содержащими глутамин трансглутаминазными («Q») метками в различных аминокислотных положениях (например, TG6, LCQ04, Н7с, L11b, см. Таблицу 1) и конъюгировали с различными линкерами и полезными нагрузками (например, аминокапроил-vc-PABC-MMAD (аминокапроил-валин-цитруллин-п-аминобензилоксикарбонил-MMAD); амино-PEG6-C2-MMAD). В одном случае трансглутаминазные метки конструировали на C-концах как легкой цепи, так и тяжелой цепи антитела, а также в положении 297 человеческого IgG (схема нумерации EU) (например, аминокислоту дикого типа аспарагин (N) в положении 297 Trop-2-антитела заменяли глутамином (N297Q)). Комбинация меток, конструированных как на легкой цепи, так и на тяжелой цепи, или во множестве сайтов в тяжелой или легкой цепи антитела, приводит к множеству сайтов конъюгирования на одно антитело (например, DAR 4-10). Конъюгирование антитела против Trop-2 с полезной нагрузкой (например, MMAD) затем проводили посредством реакции трансамидирования, катализируемой микробной трансглутаминазой, между антителом против Trop-2, несущим содержащую(ие) глутамин метку(и) в определенном сайте (например, на карбоксильном конце и/или амино-конце тяжелой цепи или легкой цепи, в положении 297 и/или другом сайте антитела) с аминосодержащим линкером, связанным с полезной нагрузкой (например, MMAD). В некоторых случаях аминокислоту дикого типа лизин в положении 222 (схема нумерации EU) антитела заменяли аминокислотой аргинином («K222R»). Например, было обнаружено, что замена K222R оказывает неожиданный эффект, приводящий к более однородной композиции конъюгата антитела и полезной нагрузки и/или значительному уменьшению межцепочечного поперечного сшивания с глутаминовой меткой на C-конце легкой цепи антитела. В реакции трансамидирования глутамин антитела действовал как донор ацила, и аминосодержащее соединение действовало как акцептор ацила (донор амина). Очищенное антитело против Trop-2 в концентрации 33 мкМ инкубировали с 10-100 М избытком акцептора ацила в диапазоне 33-3300 мкМ в присутствии 1-3% (масс./об.) трансглутаминазы Streptoverticillium mobaraense (ACTIVA™, Ajinomoto, Japan) в буфере со 150 мМ хлорида натрия или сульфата натрия и 25 мМ MES (2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота), HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота) или трис-HCl при pH в диапазоне 6,2-9,2. Условия реакции корректировали для отдельных производных-акцепторов ацилов и оптимальную эффективность и специфичность обычно наблюдали для 33 мкМ антитела, 660 мкМ производного и 2% (масс./об.) трансглутаминазы в 150 мМ NaCl, 25 мМ трис-HCl, pH 8,5. После инкубации при 37°C в течение 16-20 часов антитело очищали на смоле MabSelect SuRe™ или Butyl Sepharose™ High Performance (GE Healthcare, Piscataway, NJ) с применением стандартных хроматографических способов, известных специалистам в данной области, таких как коммерческая аффинная хроматография и хроматография гидрофобного взаимодействия от GE Healthcare.

Б. Традиционное конъюгирование антител с лекарственными средствами

Для получения антитела (например, химерного мышиного антитела против Trop-2 (m7E6)), конъюгированного с PEG6-C2-MMAD через традиционную малеимидную связь со средней лекарственной нагрузкой 4 (например, 4 MMAD на молекулу антитела), антитело в концентрации 5 мг/мл сначала восстанавливали с использованием 7,5 молярного эквивалента ТСЕР (трис(2-карбоксиэтил)фосфин) в буфере, содержащем 25 мМ трис, pH 7,5, и 150 мМ NaCl в течение 2 часов при 37°C. 7,5-молярный избыток малеимидо-PEG6-C2-MMAD добавляли к восстановленному антителу при комнатной температуре (приблизительно 22°C) и инкубировали в течение 1 часа. Проводили диализ реакционной смеси против PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор) при 4°C и стерилизующую фильтрацию через 0,2 мкм фильтр. Для получения m7E6 с малеимидо-PEG6-С2-MMAD с лекарственной нагрузкой 8 антитело восстанавливали 10-молярным избытком ТСЕР в реакционном буфере, как описано выше, с включением 50 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота). 12-молярный избыток малеимидо-PEG6-C2-MMAD добавляли к восстановленному антителу и проводили обработку, как описано выше. Для получения m7E6, конъюгированного с малеимидо-PEG6MMAD с лекарственной нагрузкой 6, антитело восстанавливали 8-кратным молярным избытком ТСЕР в буфере, как при восстановлении для DAR 8, с последующим добавлением 8-кратного молярного избытка малеимидо-PEG6-C2-MMAD. Для очистки разновидностей DAR 6 реакционную смесь разбавляли с получением буферной композиции с 0,75 М сульфата аммония и 25 мМ фосфата калия, pH 7 (буфер А). Полученный материал наносили на 2×1 мл Butyl HP Hi Trap (GE Healthcare), соединенные последовательно, проводили промывку с использованием 2 CV (объем колонки) буфера А и элюирование с использованием 20 CV линейного градиента в 25 мМ фосфата калия, pH 7, 20%-м изопропанолом. Фракции, содержащие DAR 6, объединяли, проводили диализ против PBS и концентрировали с использованием центрифужного фильтра 10 kDa Amicon Ultra (Millipore Corporation).

Исследования in vitro

Исследования цитотоксичности химерных антител против Trop-2 m7E6 Н7 с амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 1,96, сайт-специфичный), m7E6 L11b амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 1,96, сайт-специфичный), m7E6 TG6 амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 1,99, сайт-специфичный), m7E6 LCQ04/K222R амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 1,97, сайт-специфичный), m7E6 N297Q/K222R амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 3,83, сайт-специфичный), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 5.85, сайт-специфичный), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/TG6 амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 7.71, сайт-специфичный), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,76, сайт-специфичный), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/L11b амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,80, сайт-специфичный) и m7E6 малеимидо-PEG6-С2-MMAD (DAR 7.20, традиционный) in vitro проводили с использованием экспрессирующих мишень клеток B×PC3. Число DAR в данном примере и других примерах, как описано здесь, относится к отношению полезной нагрузки к молекуле антитела. Использованный линкер представлял собой PEG6, и использованная полезная нагрузка представляла собой MMAD. B×Pc3 представляют собой линию раковых клеток с высокими уровнями экспрессии мишени (Trop-2+++). Перед обработкой клетки высевали на планшеты с белыми стенками и прозрачным дном в количестве 2000 клеток на лунку на 24 часа. Клетки обрабатывали 4-кратным серийным разведением конъюгатов «антитело - лекарственное средство» в трех повторностях. Жизнеспособность клеток определяли с применением CellTiter-Glo^® Luminescent Cell Viability Assay 96 (Promega, Madison, WI) через 96 часов после обработки. Относительную жизнеспособность клеток определяли как процент от контроля без обработки. IC50 и концентрацию ADC, при которой была отмечена гибель 50% клеток (то есть 50%-я цитотоксичность), рассчитывали с применением программного обеспечения GraphPad Prism 5 и выражали как концентрацию (нМ); максимальную гибель клеток, наблюдаемую при самой высокой исследованной концентрации ADC, выражали как процент от контроля без обработки. Результаты анализа цитотоксичности показаны на Фиг. 1 и представлены в Таблице 3. Три сайт-специфичные молекулы с DAR 7,71 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/TG6 амино-PEG6-C2-MMAD), 7,76 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c амино-PEG6-C2-MMAD) и 7,80 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/L11b амино-PEG6-C2-MMAD) имели такую же активность, как ADC, конъюгированный традиционным способом, с DAR 7,20 (m7E6 малеимидо-PEG6-С2-MMAD).

Эти результаты показывают, что, в то время как все ADC приводили к почти полной гибели клеток B×PC3 с высокой экспрессией мишени, независимо от содержания полезной нагрузки, конъюгаты с большим содержанием лекарственного средства были активнее конъюгатов с меньшим содержанием лекарственного средства.

Пример 2: Цитотоксичность ADC против Trop-2 с возрастающей повышенной лекарственной нагрузкой, конъюгированных сайт-специфичным образом, в клетках с умеренной экспрессией мишени (Colo205, Trop-2+)

В этом примере показана цитотоксичность ADC (сайт-специфичных и традиционных) с повышенной лекарственной нагрузкой in vitro в клетках Colo205 с умеренной экспрессией мишени.

Исследования цитотоксичности химерных антител против Trop-2 m7E6 Н7 с амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 1,96, сайт-специфичный), m7E6 L11b амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 1,96, сайт-специфичный), m7E6 TG6 амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 1,99, сайт-специфичный), m7E6 LCQ04/K222R амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 1,97, сайт-специфичный), m7E6 N297Q/K222R амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 3,83, сайт-специфичный), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 5,85, сайт-специфичный), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/TG6 амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,71, сайт-специфичный), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,76, сайт-специфичный), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/L11b амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,80, сайт-специфичный) и m7E6 малеимидо-PEG6-С2-MMAD (DAR 7.20, традиционный) in vitro проводили с использованием экспрессирующих мишень клеток Colo205; Colo205 представляют собой линию раковых клеток с умеренными уровнями экспрессии мишени (Trop-2+). Перед обработкой клетки высевали на планшеты с белыми стенками и прозрачным дном в количестве 2000 клеток на лунку на 24 часа. Клетки обрабатывали 4-кратным серийным разведением конъюгатов «антитело - лекарственное средство» в трех повторностях. Жизнеспособность клеток определяли с применением CellTiter-Glo^® Luminescent Cell Viability Assay 96 (Promega, Madison, WI) через 96 часов после обработки. Относительную жизнеспособность клеток определяли как процент от контроля без обработки. IC50 и концентрацию ADC, при которой была отмечена гибель 50% клеток (то есть 50%-ная цитотоксичность), рассчитывали с применением программного обеспечения GraphPad Prism 5 и выражали как концентрацию (нМ); максимальную гибель клеток, наблюдаемую при самой высокой исследованной концентрации ADC, выражали как процент от контроля без обработки. Результаты анализа цитотоксичности показаны на Фиг. 2 и представлены в Таблице 4. ADC с DAR 5,85 приводили к полной гибели клеток. Три сайт-специфичные молекулы с DAR 7,71 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/TG6 амино-PEG6-C2-MMAD), 7,76 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c амино-PEG6-C2-MMAD) и 7,80 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/L11b амино-PEG6-C2-MMAD) были сопоставимы с ADC, конъюгированным традиционным способом, с DAR 7,20 (m7E6 малеимидо-PEG6-C2-MMAD).

Эти результаты демонстрируют положительную корреляцию повышенной цитотоксической активности и эффективности в клетках Colo205 с умеренной экспрессией мишени и содержания полезной нагрузки в ADC.

Только молекулы с повышенной лекарственной нагрузкой (например, DAR 5,85 или выше) позволяли достичь полной гибели клеток.

Пример 3: Цитотоксичность ADC против Trop-2 с возрастающей повышенной лекарственной нагрузкой, конъюгированных сайт-специфичным образом, в клетках с низкой экспрессией мишени (CF-PAC1, Trop-2(+))

В этом примере показана цитотоксичность сайт-специфичных ADC с повышенной лекарственной нагрузкой in vitro в клетках CF-PAC1 с низкой экспрессией мишени.

Исследования цитотоксичности химерных антител против Trop-2 m7E6 Н7 с амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 1,96, сайт-специфичный), m7E6 L11b амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 1,96, сайт-специфичный), m7E6 TG6 амино-PEG6-С2-MMAD (DAR 1,99, сайт-специфичный), m7E6 LCQ04/K222R амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 1,97, сайт-специфичный), m7E6 N297Q/K222R амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 3,83, сайт-специфичный), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 5.85, сайт-специфичный), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/TG6 амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,71, сайт-специфичный), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,76, сайт-специфичный), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/L11b амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,80, сайт-специфичный) и m7E6 малеимидо-PEG6-С2-MMAD (DAR 7,20, традиционный) in vitro проводили с использованием экспрессирующих мишень клеток CF-PAC1; CF-PAC1 представляют собой линию раковых клеток с умеренными уровнями экспрессии мишени (Trop-2+). Перед обработкой клетки высевали на планшеты с белыми стенками и прозрачным дном в количестве 2000 клеток на лунку на 24 часа. Клетки обрабатывали 4-кратным серийным разведением конъюгатов «антитело - лекарственное средство» в трех повторностях. Жизнеспособность клеток определяли с применением CellTiter-Glo^® Luminescent Cell Viability Assay 96 (Promega, Madison, WI) через 96 часов после обработки. Относительную жизнеспособность клеток определяли как процент от контроля без обработки. IC50 и концентрацию ADC, при которой была отмечена гибель 50% клеток (например, 50%-ная цитотоксичность), рассчитывали с применением программного обеспечения GraphPad Prism 5 и выражали как концентрацию (нМ); максимальную гибель клеток, наблюдаемую при самой высокой исследованной концентрации ADC, выражают как процент от контроля без обработки. В Таблице 5 и на Фиг. 3 показана положительная корреляция повышенной цитотоксической активности в клетках CF-PAC1 с низкой экспрессией мишени и содержания полезной нагрузки в ADC; например, чем выше содержание полезной нагрузки, тем выше цитотоксическая активность. Три сайт-специфичные молекулы с DAR 7,71 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/TG6 амино-PEG6-C2-MMAD), 7,76 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c амино-PEG6-C2-MMAD) и 7,80 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/L11b амино-PEG6-C2-MMAD) были сопоставимы с ADC, конъюгированным традиционным способом, с DAR 7,20 (m7E6 малеимидо-PEG6-C2-MMAD).

Этот пример также демонстрирует положительную корреляцию повышенной цитотоксической активности в клетках CF-PAC1 с низкой экспрессией мишени и содержания полезной нагрузки в ADC.

Пример 4: Цитотоксичность ADC против Trop-2 с возрастающей повышенной лекарственной нагрузкой, конъюгированных сайт-специфичным образом, в клетках без экспрессии мишени (SW620, Trop-2-)

В этом примере показана неспецифическая цитотоксичность сайт-специфичных ADC с повышенной лекарственной нагрузкой in vitro в клетках SW620 без экспрессии мишени.

Исследования цитотоксичности химерных антител против Trop-2 m7E6 TG6 амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 1,99, сайт-специфичный), m7E6 LCQ04/K222R амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 1,88, сайт-специфичный), m7E6 N297Q/K222R амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 3,92, сайт-специфичный), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 5,85, сайт-специфичный), m7E6 N297Q/K222R/LCQ0^G6 амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,71, сайт-специфичный), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,76, сайт-специфичный), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/L11b амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,80, сайт-специфичный) и m7E6 малеимидо-PEG6-С2-MMAD (DAR 7,20, традиционный) in vitro проводили с использованием клеток SW620, не экспрессирующих мишень; SW620 представляют собой линию раковых клеток без экспрессии мишени (Trop-2-). Перед обработкой клетки высевали на планшеты с белыми стенками и прозрачным дном в количестве 2000 клеток на лунку на 24 часа. Клетки обрабатывали 4-кратным серийным разведением конъюгатов «антитело - лекарственное средство» в трех повторностях. Жизнеспособность клеток определяли с применением CellTiter-Glo^® Luminescent Cell Viability Assay 96 (Promega, Madison, WI) через 96 часов после обработки. Относительную жизнеспособность клеток определяли как процент от контроля без обработки. IC50 и концентрацию ADC, при которой была отмечена гибель 50% клеток (то есть 50%-я цитотоксичность), рассчитывали с применением программного обеспечения GraphPad Prism 5 и выражали как концентрацию (нМ); максимальную гибель клеток, наблюдаемую при самой высокой исследованной концентрации ADC, выражали как процент от контроля без обработки. В данном примере начальная концентрация ADC была повышена более чем в тринадцать раз по сравнению с другими in vitro-примерами с 266 нМ до 3500 нМ, чтобы определить возможный независимый от мишени цитотоксический эффект ADC. Результаты анализа цитотоксичности показаны на Фиг. 4 и представлены в Таблице 6. Три сайт-специфичные молекулы с DAR 7,71 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/TG6 амино-PEG6-C2-MMAD), 7,76 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c амино-PEG6-C2-MMAD) и 7,80 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/L11b амино-PEG6-C2-MMAD) обладали существенно сниженной неспецифической цитотоксичностью чем ADC, конъюгированный традиционным способом, с DAR 7,20.

Эти результаты показывают, что при повышенной концентрации ADC была отмечена независимая от мишени цитотоксичность, и что у сайт-специфичных ADC она была ниже, чем у традиционных конъюгатов.

Пример 5: Попарное сравнение цитотоксичности ADC против Trop-2 с возрастающей повышенной лекарственной нагрузкой, конъюгированных сайт-специфичным образом и традиционным способом, в клетках с умеренной экспрессией мишени (Colo205. Trop-2+)

В этом примере показана повышенная цитотоксичность и активность сайт-специфичных ADC с повышенной лекарственной нагрузкой in vitro в клетках Colo205 с умеренной экспрессией мишени.

Исследования цитотоксичности химерных антител против Trop-2 m7E6 малеимидо-PEG65-С2-MMAD (DAR 4, 13, традиционный), m7E6 N297Q/K222R амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 3,86, сайт-специфичный), m7E6 малеимидо-PEG6-C2-MMAD (DAR 6,09, традиционный), m7E6 N297Q/LCQ04/K222R амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 5,86, сайт-специфичный), m7E6 малеимидо-PEG6-С2-MMAD (DAR 7,80, традиционный), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,77, сайт-специфичный) и контрольного IgG N297Q/LCQ04/K222R амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 5,84, сайт-специфичный) in vitro проводили с использованием экспрессирующих мишень клеток Colo205; Colo205 представляют собой линию раковых клеток с умеренными уровнями экспрессии мишени (Trop-2+). Перед обработкой клетки высевали на планшеты с белыми стенками и прозрачным дном в количестве 2000 клеток на лунку на 24 часа. Клетки обрабатывали 4-кратным серийным разведением конъюгатов «антитело - лекарственное средство» в трех повторностях. Жизнеспособность клеток определяли с применением CellTiter-Glo^® Luminescent Cell Viability Assay 96 (Promega, Madison, WI) через 96 часов после обработки. Относительную жизнеспособность клеток определяли как процент от контроля без обработки. IC₅₀ и концентрацию ADC, при которой была отмечена гибель 50% клеток (например, 50%-ная цитотоксичность), рассчитывали с применением программного обеспечения GraphPad Prism 5 и выражали как концентрацию (нМ); максимальную гибель клеток, наблюдаемую при самой высокой исследованной концентрации ADC, выражают как процент от контроля без обработки. Результаты анализа цитотоксичности показаны на Фиг. 5 и представлены в Таблице 7. Три сайт-специфичные молекулы с DAR 3,86 (m7E6 N297Q/K222R амино-PEG6-C2-MMAD), 5,86 (m7E6 N297Q/LCQ04/K222R амино-PEG6-C2-MMAD) и 7,77 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c амино-PEG6-С2-MMAD) были сопоставимы с ADC, конъюгированными традиционным способом, с DAR 4,13 (m7E6 малеимидо-PEG6-С2-MMAD), 6,09 (m7E6 малеимидо-PEG6-C2-MMAD) и 7,80 (m7E6 малеимидо-PEG6-С2-MMAD), соответственно.

Эти результаты демонстрируют положительную корреляцию повышенной цитотоксической активности и эффективности в клетках Colo205 с умеренной экспрессией мишени и содержания полезной нагрузки в ADC; (например, чем выше содержание полезной нагрузки в молекуле, тем выше активность).

Пример 6: Сайт-специфичный конъюгат антитела 7Е6 против Trop-2 и ауристатина с соотношением лекарственного средства к антителу 7.76 индуцировал долгосрочную остановку роста опухоли в ксенотрансплантационной модели Colo205

В этом примере показана эффективность сайт-специфичных ADC с повышенной лекарственной нагрузкой в ксенотрансплантационной модели Colo205.

Исследования эффективности m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c амино-PEG6-C2-MMAD (DAR7.76, сайт-специфичный), m7E6 малеимидо-PEG6-С2-MMAD (DAR 7,20, традиционный), m7E6 N297Q/K222R амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 3,92, сайт-специфичный) и контрольного IgG N297Q/K222R амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 3,68, сайт-специфичный) in vivo проводили в ксенотрансплантационной модели Colo205 с экспрессией мишени; Colo205 представляют собой линию раковых клеток с умеренными уровнями экспрессии мишени (Trop-2+). Три миллиона раковых клеток Colo205 имплантировали подкожно мышам nu/nu в возрасте 5-8 недель до достижения размера опухоли приблизительно 250 мм³. Животных рандомизировали по размеру опухоли и введение осуществляли посредством болюсной инъекции в хвостовую вену. 6 мг/кг mAb вводили посредством болюсной инъекции в хвостовую вену за 1 введение. Размер опухоли измеряли два раза в неделю штангенциркулем и рассчитывали по следующей формуле: объем опухоли = (длина × ширина²)/2. Животных умерщвляли при достижении объема опухоли 2000 мм³ или уменьшении массы тела более чем на 20%. На Фиг. 6 показано, что однократное введение сайт-специфичного конъюгата с DAR 7,76 приводило к долгосрочной остановке роста опухоли, значительно превосходя эффект традиционного конъюгата с DAR 7,2.

Кроме того, различия в активности сайт-специфичного и традиционного конъюгатов с высоким DAR не были обусловлены различным связыванием ADC с мишенью, поскольку все ADC продемонстрировали сходную кинетику связывания. Фиг. 11 и Таблица 8. Кинетика связывания при взаимодействии мишени/IgG, как показано на Фиг. 11 и в Таблице 8, была определена с использованием биосенсора поверхностного плазмонного резонанса Biacore Т200 (GE Lifesciences, Piscataway, NJ).

WT (m7E6-неконъюгированное), SS DAR2 (LC) (сайт-специфичный m7E6 LCQ04 амино-PEG6-C2-MMAD), SS DAR4 (m7E6 N297Q/K222R амино-PEG6-C2-MMAD), SS DAR6 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 амино-PEG6-C2-MMAD), SS DAR8 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c амино-PEG6-C2-MMAD) и Cys DAR8 (m7E6 малеимидо-PEG6-С2-MMAD).

В целом, данный пример демонстрирует, что ADC по настоящему изобретению (например, с DAR 7,76) индуцирует долгосрочную остановку роста опухоли эффективнее, чем традиционный ADC со сходным или более высоким DAR, и что ADC с DAR менее 5 в этой модели по существу неэффективны.

Пример 7: Сайт-специфичные конъюгаты 7Е6 против Trop-2 и ауристатина с соотношением лекарственного средства к антителу 5,86 и 7,77 эффективнее соответствующих традиционных конъюгатов и индуцировали долгосрочную остановку роста опухоли в ксенотрансплантационной модели Colo205

В этом примере также показана эффективность сайт-специфичных ADC с повышенной лекарственной нагрузкой в ксенотрансплантационной модели Colo205.

Исследования эффективности m7E6 малеимидо-PEG6-С2-MMAD (DAR 4, 13, традиционный), m7E6 N297Q/K222R амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 3,86, сайт-специфичный), m7E6 малеимидо-PEG6-С2-MMAD (DAR 6,09, традиционный), m7E6 N297Q/LCQ04/K222R амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 5,86, сайт-специфичный), m7E6 малеимидо-PEG6-С2-MMAD (DAR 7,80, традиционный), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,77, сайт-специфичный) и контрольного IgG N297Q/LCQ04/K222R амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 5,84, сайт-специфичный) in vitro проводили в ксенотрансплантационной модели Colo205 с экспрессией мишени; Colo205 представляют собой линию раковых клеток с умеренными уровнями экспрессии мишени (Trop-2+). Три миллиона раковых клеток Colo205 имплантировали подкожно мышам nu/nu в возрасте 5-8 недель до достижения размера опухоли приблизительно 200 мм³. Животных рандомизировали по размеру опухоли и введение осуществляли посредством болюсной инъекции в хвостовую вену. 6 мг/кг mAb вводили посредством болюсной инъекции в хвостовую вену за 1 введение. Размер опухоли измеряли два раза в неделю штангенциркулем и рассчитывали по следующей формуле: объем опухоли = (длина × ширина²)/2. Животных умерщвляли при достижении объема опухоли 2000 мм³ или уменьшении массы тела более чем на 20%. На Фиг. 7 показано, что однократное введение сайт-специфичных конъюгатов с DAR 5,86 (m7E6 N297Q/LCQ04/K222R амино-PEG6-C2-MMAD) и DAR 7,77 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c амино-PEG6-C2-MMAD) приводило к долгосрочной остановке роста опухоли, значительно превосходя эффект традиционных конъюгатов с DAR 6,09 (m7E6 малеимидо-PEG6-С2-MMAD) и DAR 7,80 (m7E6 малеимидо-PEG6-С2-MMAD). Различия в активности не были обусловлены различным связыванием ADC с мишенью, поскольку все ADC продемонстрировали сходную кинетику связывания, как обсуждено в Примере 6.

Соответственно, данный пример также демонстрирует, что ADC по настоящему изобретению (например, сайт-специфичные с DAR 5,86 и 7,77) индуцируют долгосрочную остановку роста опухоли эффективнее, чем традиционные ADC со сходным DAR.

Пример 8: Сайт-специфичные конъюгаты 7Е6 против Trop-2 и ауристатина с высоким соотношением лекарственного средства к антителу демонстрируют лучший по сравнению с традиционными ADC фармакокинетический (PK) профиль

В этом примере показаны PK-профили сайт-специфичных ADC с повышенной лекарственной нагрузкой в сравнении с традиционными ADC с повышенной лекарственной нагрузкой как у мышей, так и у крыс.

Фармакокинетику ADC по настоящему изобретению изучали как у мышей, так и у крыс и анализировали с применением ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ); DAR анализировали посредством LC/MS (жидкостная хроматография - масс-спектрометрия).

PK-анализ общего количества антитела

На каждую лунку 96-луночного микротитрационного планшета (NUNC) сорбировали 100 мкл Fc-специфичного козьего антитела против человеческого IgG (Pierce, Rockford, IL), 1 мкг/мл в 1×PBS (Cell Gro). Планшеты инкубировали при 4-8°C в течение ночи. Все стадии отмывки проводили с использованием устройства для отмывки планшетов Biotek EL×405 и 1×PBS/0,05% Tween. После 3-кратной отмывки планшеты блокировали с использованием 200 мкл буфера для анализа (1×PBS/0,5% BSA (бычий сывороточный альбумин)/0,05% полисорбат 20) и инкубировали 1-2 часа при комнатной температуре с легким перемешиванием. Планшеты отмывали 3 раза и в соответствующие лунки добавляли по 100 мкл стандартов, контролей и образцов, разведенных 1:100 в буфере для анализа. После двухчасовой инкубации с легким перемешиванием при комнатной температуре планшеты отмывали 6 раз перед внесением 100 мкл антитела для выявления (Fab-специфичное HRP(пероксидаза хрена)-меченное антитело против человеческого IgG от Sigma (St. Louis, МО)), разведенного до 250 нг/мл в буфере для анализа. Планшеты инкубировали еще один час с легким перемешиванием при комнатной температуре перед 6-кратной отмывкой. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл ТМВ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин) (KPL, Gaithersburg, MD). Окраске давали проявляться приблизительно 5 минут перед остановкой реакции с использованием 100 мкл 1 М фосфорной кислоты. Оптическую плотность измеряли при 450 нм с контролем при 650 нм на устройстве для считывания планшетов SpectraMax 340 (Molecular Devices). Для построения калибровочных кривых с 4-параметрической регрессией и расчета концентраций в образцах использовали программное обеспечение SoftMax Pro 5.2.

PK-анализ ADC

На каждую лунку 96-луночнсто микротитрационного планшета (NUNC) сорбировали 100 мкл козьего антитела против человеческого IgG, 2 мкг/мл в 1×PBS (Cell Gro). Планшеты инкубировали при 4-8°C в течение ночи. Все стадии отмывки проводили на устройстве для отмывки планшетов Biotek EL×405 с использованием 1×PBS/0,05% Tween. После 3-кратной отмывки планшеты блокировали с использованием 200 мкл буфера для анализа (1×PBS/0,5% BSA/0,05% полисорбат 20) на лунку и инкубировали 1-2 часа при комнатной температуре с легким перемешиванием. Планшеты отмывали 3 раза и в соответствующие лунки добавляли по 100 мкл стандартов, контролей и образцов, разведенных 1:100 в буфере для анализа, в двух повторностях. После двухчасовой инкубации с легким перемешиванием при комнатной температуре планшеты отмывали 6 раз перед внесением 100 мкл антитела для выявления (биотинилированное моноклональное антитело против MMAD), разведенного до 4 мкг/мл в буфере для анализа. Планшеты инкубировали в течение 1,5 часа с легким перемешиванием при комнатной температуре перед 6-кратной отмывкой. Авидин-HRP (Vector Labs, Burlingame, СА) разводили до 0,5 мкг/мл в буфере для анализа и вносили в каждую лунку по 100 мкл. Планшеты инкубировали еще час перед 6-кратной отмывкой. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл ТМВ (KPL, Gaithersburg, MD). Окраске давали проявляться приблизительно 5 минут перед остановкой реакции с использованием 100 мкл 1 М фосфорной кислоты. Оптическую плотность измеряли при 450 нм с контролем при 650 нм на устройстве для считывания планшетов SpectraMax 340 (Molecular Devices, Downingtown, PA). Для построения калибровочных кривых с 4-параметрической регрессией и расчета концентраций в образцах использовали программное обеспечение SoftMax Pro 5.2.

LC/MS-анализ интактной массы ADC и расчет DAR

Перед LC/MS-анализом ADC (сайт-специфичные DAR6 и DAR8 и традиционный DAR8) дегликозилировали PNGaseF (пептид-N-гликозидазой F) (New England Biolabs Inc., Ipswich, MA) в неденатурирующих условиях при 37°C в течение ночи. ADC (1 мкг) загружали на колонку с обращенной фазой, заполненную полимерным веществом (Michrom-Bruker, Fremont, СА). LC/MS-анализ проводили с использованием HPLC-системы серии Agilent 1100, содержащей бинарный насос для HPLC, дегазатор, автодозатор с температурным контролем, нагреватель колонки и диодно-матричный детектор (DAD), в сочетании с масс-спектрометром Orbitrap Velos Pro (Thermo Fisher Scientific, Somerset, NJ) с электрораспылительным источником ионов. Подвижные фазы состояли из растворителя А (0,1%-я водная муравьиная кислота) и растворителя В (0,1%-я муравьиная кислота в ацетонитриле). HPLC проводили с использованием возрастающего градиента растворителя В на протяжении цикла продолжительностью 30 мин, состоявшего из изократического потока 3%-го растворителя В в течение 10 мин с последующим градиентом до 97%-го растворителя В в течение 1 мин, удержания 97%-го растворителя В в течение 2 мин и, в завершение, с последующим уравновешиванием 3%-м растворителем В в течение 17 мин. Осуществляли деконволюцию полученных масс-спектров с использованием программного обеспечения ProMass (Thermo Fisher Scientific, Somerset, NJ). Для сайт-специфичных ADC DAR рассчитывали с использованием интактной массы ADC; для традиционных ADC DAR рассчитывали по подвергнутым деконволюции спектрам тяжелых и легких цепей, поскольку традиционные ADC не содержат межмолекулярных дисульфидных связей, и в условиях обращенной фазы происходит разделение цепей. Расчет DAR основан на относительной интенсивности наблюдаемых разновидностей DAR.

Исследования in vivo

У мышей однократное введение (6 мг/кг) всех ADC анализировали в ксенотрансплантационной модели Colo205. В этих условиях антитело m7E6, конъюгированное с PEG6MMAD как (1) m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 5,85, сайт-специфичный); и (2) m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,76, сайт-специфичный), продемонстрировало фармакокинетический профиль, сходный с неконъюгированным антителом m7E6 дикого типа. Сравнение сигналов общего mAb и ADC показало, что ADC с повышенной лекарственной нагрузкой (mAb или ADC m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 5,85, сайт-специфичный); или mAb или ADC m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,76, сайт-специфичный)) продемонстрировали очень небольшое снижение содержания полезной нагрузки за двухнедельный период. См. Фиг. 8(c) и 8(d). Данные указывают на то, что опосредованное трансглутаминазой связывание амино-PEG6-C2-MMAD приводит к получению стабильных конъюгатов. В отличие от этого, антитело m7E6, конъюгированное с малеимидо-PEG6-С2-MMAD с применением традиционного способа (m7E6 малеимидо-PEG6-С2-MMAD (DAR 7,8)) продемонстрировало меньшую, чем в случае общего mAb и неконъюгированного антитела, площадь под фармакокинетической кривой ADC. См. Фиг. 8(b). Уменьшение содержания полезной нагрузки в конъюгатах на основе малеимида было описано ранее (см., например, Alley et al., Bioconj. Chem. 19(3): 759-765 (2008); и Shen et al., Nat. Biotechnol. 30(2): 184-189 (2012)), и полагают, что оно происходит посредством механизма, обратного присоединению по Михаэлю. Вероятно, сниженная активность традиционных ADC-конъюгатов in vivo обусловлена различием площади под фармакокинетической кривой ADC между традиционными конъюгатами с DAR 8 и ADC-конъюгатами по настоящему изобретению.

Уменьшение площади под фармакокинетической кривой, наблюдаемое в ELISA-анализах для традиционных ADC, может быть усилено возможностью недооценки снижения содержания полезной нагрузки в антителах ADC-анализом, применяемым в этих экспериментах. Конкретнее, ELISA ADC показывает сигнал не только для DAR 8, но также всех других разновидностей с меньшей лекарственной нагрузкой, образованных in vivo. Этот эффект был более выраженным в случае разновидностей с повышенной лекарственной нагрузкой, таких как ADC с DAR 8, полученных традиционным способом конъюгирования, где возможна потеря до семи лекарственных средств без существенного изменения сигнала ELISA. Кроме того, уменьшение содержания лекарственного средства, вероятно, было основной причиной низкой активности нерасщепляемых традиционных конъюгатов, таких как m7E6 малеимидо-PEG6-С2-MMAD (DAR 8), in vivo. В отличие от этого, у нерасщепляемых ADC-конъюгатов по настоящему изобретению (например, DAR 6 или DAR 8) нет малеимидной нестабильности, и они способны существенно ингибировать рост опухоли в ксенотрансплантационной модели Colo205 с умеренной экспрессией мишени.

Для сравнения с мышами PK-исследования ADC с повышенным содержанием лекарственного средства проводили также у крыс.ADC, основанные на традиционном способе конъюгирования (m7E6 малеимидо-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,8)) также продемонстрировали наименьшие уровни циркулирующих ADC. См. Фиг. 8(e). ADC по настоящему изобретению с DAR 8 (например, m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,76, сайт-специфичный)) продемонстрировали промежуточные уровни циркулирующих ADC, и ADC по настоящему изобретению с DAR 6 (например, m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 PEG6MMAD (DAR 5,85, сайт-специфичный)) продемонстрировали наиболее высокие уровни циркулирующих ADC, сопоставимые с неконъюгированным антителом m7E6. См. Фиг. 8(e). Традиционные ADC с DAR 7,8 продемонстрировали наибольшие отличия от неконъюгированного антитела, где площадь под фармакокинетической кривой, как для общего антитела, так и для ADC, была намного меньше соответствующих уровней неконъюгированного антитела. См. Фиг. 8(f). В случае m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 PEG6MMAD (DAR 5,85, сайт-специфичный) уровни общего mAb и уровни ADC были почти эквивалентны уровням неконъюгированного антитела. См. Фиг. 8(g). Уровни общего mAb, а также уровни ADC для m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c PEG6MMAD были снижены по сравнению неконъюгированным антителом, Фиг. 8(h). Это отличается от PK-результатов, полученных у мышей, где ADC по настоящему изобретению с DAR 8 продемонстрировал PK, сходную с неконъюгированным антителом. Эти результаты позволяют предположить, что сочетание сайтов конъюгирования, которые по отдельности демонстрируют PK дикого типа, может приводить к уменьшению площади под фармакокинетической кривой.

Масс-спектрометрический анализ мышиных in vivo образцов дополнительно выявил снижение содержания структуры «линкер - полезная нагрузка» в традиционном ADC (например, m7E6 малеимидо-PEG6-С2-MMAD) приблизительно на 28%, в то время как трансглутаминазный линкер остается интактным в обоих сайт-специфичных конъюгатах DAR6 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 PEG6MMAD) и DAR8_1 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c амино-PEG6-C2-MMAD). См. Фиг. 12(a). Масс-спектрометрическое исследование также выявило C-концевую деградацию лекарственного средства MMAD, уровни которой сходны у сайт-специфичных конъюгатов DAR6, SS DAR8_1 и традиционных конъюгатов DAR8 (Фиг. 12(b)). Комбинированная стабильность структуры «линкер - полезная нагрузка» в конъюгатах показана на Фиг. 12(c).

В целом, этот пример демонстрирует, что ADC с повышенной лекарственной нагрузкой по настоящему изобретению имеют PK-профили, сходные с таковыми для неконъюгированного антитела дикого типа у мышей и лучшие, чем у традиционных ADC с повышенной лекарственной нагрузкой, PK-профили у крыс.

Пример 9: Сочетание сайтов конъюгирования ADC, которые по отдельности демонстрируют фармакокинетические профили дикого типа, может приводить к уменьшению площади под фармакокинетической кривой у крыс

В этом примере показаны PK-профили сайт-специфичных ADC с повышенной лекарственной нагрузкой с различными комбинациями сайтов конъюгирования у крыс.

PK-исследования ADC с повышенной лекарственной нагрузкой с различными комбинациями сайтов конъюгирования проводили также у крыс. Сайт-специфичный ADC с DAR 7,76 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c амино-PEG6-C2-MMAD) был получен посредством сочетания сайт-специфичного ADC с DAR 1,99 (m7E6 Н7 с амино-PEG6-C2-MMAD) с сайт-специфичным ADC с DAR5.85 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 амино-PEG6-C2-MMAD). Сайт-специфичные ADC с DAR 5,85 и 1,99 продемонстрировали PK-профили дикого типа у крыс по отдельности, но продемонстрировали уменьшение площади под фармакокинетической кривой при их сочетании в форме сайт-специфичного ADC с DAR 7,76. См. Фиг. 9(a). В сравнение, при сочетании того же сайт-специфичного ADC с DAR 5,85 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 амино-PEG6-C2-MMAD) с другим сайт-специфичным ADC с DAR 1,96 (m7E6 TG6 амино-PEG6-C2-MMAD; сайт конъюгирования на C-конце тяжелой цепи антитела, вдали от сайтов конъюгирования m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 амино-PEG6-C2-MMAD) полученный ADC (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/TG6 амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,7, сайт-специфичный)) не продемонстрировал дополнительного снижения площади под фармакокинетической кривой (например, снижение не более чем у m7E6 TG6 амино-PEG6-C2-MMAD). См. Фиг. 9(b).

Полученные данные показывают, что слишком большое число гидрофобных полезных нагрузок (например, MMAD), расположенных в непосредственной близости друг от друга, может ухудшать PK-профиль ADC у крыс. Эти данные также показывают, что для сайтов конъюгирования, расположенных далеко друг от друга, PK-профиль комбинации сайтов у крыс сходен с наименьшим PK-профилем отдельного сайта.

Пример 10: Безопасность и переносимость конъюгатов 7Е6 против Trop-2 и ауристатина, конъюгированных сайт-специфичным образом в сравнении с традиционными ADC у мышей

В этом примере показана безопасность и переносимость сайт-специфичных ADC с повышенной лекарственной нагрузкой у мышей.

Мышам С57В1/6 проводили однократное введение 75, 125 или 200 мг/кг ADC, конъюгированного традиционным способом (m7E6 малеимидо-PEG6-С2-MMAD «DAR8»), или сайт-специфичных ADC, конъюгированных с нерасщепляемой полезной нагрузкой PEG6-C2-MMAD (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 амино-PEG6-C2-MMAD («DAR6») и m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/TG6 амино-PEG6-C2-MMAD («DAR8_1»)). Оценивали клинические наблюдения, массу тела, фармакокинетику и клинико-патологические параметры. Конкретнее, животных осматривали сразу и через 2 часа после инъекции, затем ежедневно на протяжении двух недель после введения. Массу тела отмечали в 0, 2, 5, 7, 9, 12 и 14 сутки. Забор образцов крови для оценки фармакокинетики осуществляли через 5 минут, 7 суток и 14 суток после введения, для клинических биохимических и гематологических анализов - в 14 сутки.

Как традиционный, так и сайт-специфичные конъюгаты были переносимы вплоть до очень высокой дозы 200 мг/кг. Клинических наблюдений или существенных изменений массы тела, которые указывали бы на токсичность, не было. Фиг. 10(b). Клинико-патологические параметры для всех трех конъюгатов (традиционного ADC «DAR8» и двух сайт-специфичных ADC «DAR8_1» и «DAR6») оценивали в конце исследования (14 сутки), и токсикологически значимых или существенных изменений обнаружено не было.

Фиг. 10(c) и 10(d). Например, не было существенных изменений показателей печеночных ферментов (аспартатаминотрансферазы (AST), аланинтрансаминазы (ALT) и щелочной фосфатазы (ALP)) и ключевых гематологических показателей (нейтрофилов, ретикулоцитов и тромбоцитов).

Вместе взятые, эти результаты показывают, что как сайт-специфичные, так и традиционные конъюгаты в высоких дозах 200 мг/кг с DAR 8 и PEG6-C2-MMAD обладают хорошей переносимостью у мышей. Кроме того, по сравнению с традиционным конъюгатом DAR8 сайт-специфичный конъюгат DAR8_1 достигал приблизительно 55% наибольшей площади под фармакокинетической кривой. Фиг. 10(a). Кроме того, в высоких дозах традиционный конъюгат с DAR 8 также продемонстрировал концентрации антитела, которые были меньше ожидаемых. Фиг. 13(a). Этот феномен не наблюдали в случае сайт-специфичного ADC DAR8_1, продемонстрировавшего ожидаемое увеличение площади под фармакокинетической кривой даже в самой высокой исследованной дозе 200 мг/кг. Фиг. 13(b).

В целом, сайт-специфичные конъюгаты продемонстрировали хороший профиль безопасности с большей площадью под фармакокинетической кривой ADC по сравнению с традиционными конъюгатами.

Пример 11: Цитотоксичность ADC против Trop-2 с возрастающей повышенной лекарственной нагрузкой, конъюгированных сайт-специфичным образом, в клетках с высоким уровнем экспрессии мишени (B×PC3. Trop-2+++)

В этом примере показана цитотоксичность ADC с повышенной лекарственной нагрузкой (например, с DAR 5,95-9,4 (сайт-специфичное конъюгирование)) in vitro в клетках B×PC3 с высоким уровнем экспрессии мишени.

Исследования цитотоксичности химерных антител против Trop-2 m7E6 L11b амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 1,96, сайт-специфичный), m7E6 N297Q/K222R амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 3,9, сайт-специфичный), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 5,95, сайт-специфичный), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,6, сайт-специфичный) и N297Q/K222R/LCQ04/L11b/H7c амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 9,4, сайт-специфичный) in vitro проводили с использованием экспрессирующих мишень клеток B×PC3. B×Pc3 представляют собой линию раковых клеток с высокими уровнями экспрессии мишени (Trop-2+++). Перед обработкой клетки высевали на планшеты с белыми стенками и прозрачным дном в количестве 2000 клеток на лунку на 24 часа. Клетки обрабатывали 4-кратным серийным разведением конъюгатов «антитело - лекарственное средство» в трех повторностях. Жизнеспособность клеток определяли с применением CellTiter-Glo^® Luminescent Cell Viability Assay 96 (Promega, Madison, WI) через 96 часов после обработки. Относительную жизнеспособность клеток определяли как процент от контроля без обработки. IC50 и концентрацию ADC, при которой была отмечена гибель 50% клеток (то есть 50%-я цитотоксичность), рассчитывали с применением программного обеспечения GraphPad Prism 5 и выражали как концентрацию (нМ); максимальную гибель клеток, наблюдаемую при самой высокой исследованной концентрации ADC, выражали как процент от контроля без обработки. Результаты анализа цитотоксичности показаны на Фиг. 14 и представлены в Таблице 9. Эти результаты показывают, что, в то время как все ADC приводили к почти полной гибели клеток B×PC3 с высоким уровнем экспрессии мишени, независимо от содержания полезной нагрузки, конъюгаты с повышенной лекарственной нагрузкой были активнее конъюгатов с более низкой лекарственной нагрузкой.

Пример 12: Цитотоксичность ADC против Trop-2 с возрастающей повышенной лекарственной нагрузкой, конъюгированных сайт-специфичным образом, в клетках с умеренной экспрессией мишени (Colo205, Trop-2+)

В этом примере показана цитотоксичность ADC с повышенной лекарственной нагрузкой (например, с DAR 5,95-9,4 (сайт-специфичное конъюгирование)) in vitro в клетках Colo205 с умеренной экспрессией мишени.

Исследования цитотоксичности химерных антител против Trop-2 m7E6 L11b амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 1,96, сайт-специфичный), m7E6 N297Q/K222R амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 3,9, сайт-специфичный), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 5,95, сайт-специфичный), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,6, сайт-специфичный) и N297Q/K222R/LCQ04/L11b/H7c амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 9,4, сайт-специфичный) in vitro проводили с использованием экспрессирующих мишень клеток Colo205; Colo205 представляют собой линию раковых клеток с умеренными уровнями экспрессии мишени (Trop-2+). Перед обработкой клетки высевали на планшеты с белыми стенками и прозрачным дном в количестве 2000 клеток на лунку на 24 часа. Клетки обрабатывали 4-кратным серийным разведением конъюгатов «антитело - лекарственное средство» в трех повторностях. Жизнеспособность клеток определяли с применением CellTiter-Glo^® Luminescent Cell Viability Assay 96 (Promega, Madison, WI) через 96 часов после обработки. Относительную жизнеспособность клеток определяли как процент от контроля без обработки. IC50 и концентрацию ADC, при которой была отмечена гибель 50% клеток (то есть 50%-я цитотоксичность), рассчитывали с применением программного обеспечения GraphPad Prism 5 и выражали как концентрацию (нМ); максимальную гибель клеток, наблюдаемую при самой высокой исследованной концентрации ADC, выражали как процент от контроля без обработки. Результаты анализа цитотоксичности показаны на Фиг. 15 и представлены в Таблице 10. Эти результаты демонстрируют положительную корреляцию повышенной цитотоксической активности и эффективности в клетках Colo205 с умеренной экспрессией мишени и содержания полезной нагрузки в ADC. Только молекулы с повышенной лекарственной нагрузкой (например, DAR 5,95 или выше) позволяли достичь полной гибели клеток.

Данный пример также демонстрирует, что повышение DAR до 9,4 в конъюгате N297Q/K222R/LCQ04/L11b/H7c амино-PEG6-C2-MMAD приводило к повышению активности по сравнению с конъюгатом m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c амино-PEG6-C2-MMAD с DAR 7,6.

Пример 13: Цитотоксичность ADC против Trop-2 с возрастающей повышенной лекарственной нагрузкой, конъюгированных сайт-специфичным образом, в клетках с низким уровнем экспрессии мишени (CF-PAC1, Trop-2(+))

В этом примере показана цитотоксичность ADC с повышенной лекарственной нагрузкой (например, с DAR 5,95-9,4 (сайт-специфичное конъюгирование)) in vitro в клетках CF-PAC1 с низким уровнем экспрессии мишени.

Исследования цитотоксичности химерных антител против Trop-2 m7E6 L11b амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 1,96, сайт-специфичный), m7E6 N297Q/K222R амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 3,9, сайт-специфичный), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 5,95, сайт-специфичный), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,6, сайт-специфичный) и N297Q/K222R/LCQ04/L11b/H7c амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 9,4, сайт-специфичный) in vitro проводили с использованием экспрессирующих мишень клеток CF-PAC1; CF-PAC1 представляют собой линию раковых клеток с умеренными уровнями экспрессии мишени (Trop-2+). Перед обработкой клетки высевали на планшеты с белыми стенками и прозрачным дном в количестве 2000 клеток на лунку на 24 часа. Клетки обрабатывали 4-кратным серийным разведением конъюгатов «антитело - лекарственное средство» в трех повторностях. Жизнеспособность клеток определяли с применением CellTiter-Glo^® Luminescent Cell Viability Assay 96 (Promega, Madison, WI) через 96 часов после обработки. Относительную жизнеспособность клеток определяли как процент от контроля без обработки. IC₅₀ и концентрацию ADC, при которой была отмечена гибель 50% клеток (например, 50%-ная цитотоксичность), рассчитывали с применением программного обеспечения GraphPad Prism 5 и выражали как концентрацию (нМ); максимальную гибель клеток, наблюдаемую при самой высокой исследованной концентрации ADC, выражают как процент от контроля без обработки. В Таблице 11 и на Фиг. 16 показана положительная корреляция повышенной цитотоксической активности в клетках CF-PAC1 с низкой экспрессией мишени и содержания полезной нагрузки в ADC; например, чем выше содержание полезной нагрузки, тем выше цитотоксическая активность. У конъюгата N297Q/K222R/LCQ04/L11b/H7c амино-PEG6-C2-MMAD с DAR 9,4 максимальная цитотоксическая активность была несколько повышена.

Этот пример также демонстрирует положительную корреляцию повышенной цитотоксической активности и эффективности в клетках CF-PAC1 с низкой экспрессией мишени и содержания полезной нагрузки в ADC.

Пример 14: Цитотоксичность ADC против Trop-2 с возрастающей повышенной лекарственной нагрузкой, конъюгированных сайт-специфичным образом, в клетках без экспрессии мишени (SW620, Trop-2-)

В этом примере показана цитотоксичность ADC с повышенной лекарственной нагрузкой (например, с DAR 5,95-9,4 (сайт-специфичное конъюгирование)) in vitro в клетках SW620 без экспрессии мишени.

Исследования цитотоксичности химерных антител против Trop-2 m7E6 L11b амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 1,96, сайт-специфичный), m7E6 N297Q/K222R амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 3,9, сайт-специфичный), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 5,95, сайт-специфичный), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,6, сайт-специфичный) и N297Q/K222R/LCQ04/L11b/H7c амино-PEG6-C2-MMAD (DAR 9,4, сайт-специфичный) in vitro проводили с использованием клеток SW620 без экспрессии мишени; SW620 представляют собой линию раковых клеток без экспрессии мишени (Trop-2-). Перед обработкой клетки высевали на планшеты с белыми стенками и прозрачным дном в количестве 2000 клеток на лунку на 24 часа. Клетки обрабатывали 4-кратным серийным разведением конъюгатов «антитело - лекарственное средство» в трех повторностях. Жизнеспособность клеток определяли с применением CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay 96 (Promega, Madison, WI) через 96 часов после обработки. Относительную жизнеспособность клеток определяли как процент от контроля без обработки. IC₅₀ и концентрацию ADC, при которой была отмечена гибель 50% клеток (то есть 50%-ная цитотоксичность), рассчитывали с применением программного обеспечения GraphPad Prism 5 и выражали как концентрацию (нМ); максимальную гибель клеток, наблюдаемую при самой высокой исследованной концентрации ADC, выражали как процент от контроля без обработки. Результаты анализа цитотоксичности показаны на Фиг. 17 и представлены в Таблице 12. В исследованном диапазоне концентраций все конъюгаты продемонстрировали минимальную неспецифическую цитотоксическую активность.

Данный пример демонстрирует, что повышение DAR до 9,4 в конъюгате N297Q/K222R/LCQ04/L11b/H7c амино-PEG6-C2-MMAD не приводило к повышению неспецифической цитотоксической активности по сравнению с конъюгатами с меньшим DAR.

Пример 15: Цитотоксичность ADC против ВСМА (антиген созревания В-клеток) с возрастающей повышенной лекарственной нагрузкой, конъюгированных сайт-специфичным образом, в клетках с низким уровнем экспрессии и высоким уровнем экспрессии мишени ВСМА

В этом примере показана цитотоксичность ADC с повышенной лекарственной нагрузкой (например, с DAR 5,95 (сайт-специфичное конъюгирование)) in vitro в клетках L363 и MM1.S с низкой и умеренной экспрессией мишени, соответственно.

Исследования цитотоксичности человеческого антитела против ВСМА (антиген созревания В-клеток) (Ab1), конъюгированного со структурой «линкер - полезная нагрузка», включая Ab1-LCQ05/K222P-сплайсостатин-((2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-гидразинил-2-оксоэтил)-4-гидрокси-1,6-диоксаспиро[2.5]окт-5-ил]-3-метилпента-2,4-диен-1-ил}-2,5-диметилтетрагидро-2Н-пиран-3-ил]амино}-5-оксопент-3-ен-2-илацетат) (DAR 1,9, сайт-специфичный), Ab1-LCQ04/K222R-сплайсостатин (DAR 1,9, сайт-специфичный), Ab1-N297Q/K222R-сплайсостатин (DAR 3,7, сайт-специфичный) и Ab1-N297Q/K222R/LCQ05-сплайсостатин (DAR 5,95, сайт-специфичный), in vitro проводили с использованием экспрессирующих мишень клеток L363 (линия раковых клеток с низкими уровнями экспрессии мишени (ВСМА(+)) и MM1.S (линия раковых клеток с умеренными уровнями экспрессии мишени (ВСМА(++)). Клетки высевали на планшеты с прозрачным дном в количестве 3000 клеток на лунку. Клетки обрабатывали 4-кратным серийным разведением конъюгатов «антитело - лекарственное средство» в трех повторностях. Жизнеспособность клеток определяли с применением CellTiter-Glo^® Luminescent Cell Viability Assay 96 (Promega, Madison, WI) через 96 часов после обработки. Относительную жизнеспособность клеток определяли как процент от контроля без обработки. ЕС₅₀ рассчитывали с использованием программного обеспечения Prism. На Фиг. 18А и 18В показана положительная корреляция повышенной цитотоксической активности и эффективности и низкого (например, 1,9 и 3,7), по сравнению с высоким (например, 5,9), содержания полезной нагрузки в ADC.

Соответственно, данный пример также демонстрирует положительную корреляцию повышенной цитотоксической активности в таких клетках, как L363 с низкой экспрессией мишени и MM1.S с высокой экспрессией мишени, и содержания полезной нагрузки в ADC.

Несмотря на то, что раскрытые идеи были описаны со ссылкой на различные применения, способы и композиции, следует понимать, что возможны различные изменения и модификации без выхода за рамки раскрытых здесь идей и приведенной ниже формулы изобретения. Описанные выше примеры приведены для лучшей иллюстрации раскрытых идей, и подразумевают, что они не ограничивают объем идей, представленных здесь. Несмотря на то, что настоящие идеи были описаны в свете этих типичных воплощений, специалисту в данной области будет ясно, без ненужных экспериментов, что возможны многочисленные изменения и модификации этих типичных воплощений. Все такие изменения и модификации входят в объем настоящих идей.

Все ссылки, приведенные здесь, включая патенты, заявки на патенты, научные статьи, учебные пособия и тому подобное, и ссылки, приведенные в них, в той степени, в которой они еще не включены, полностью таким образом включены сюда посредством ссылки. В случае, если один или более из включенных литературных источников и аналогичных материалов отличается от данной заявки или противоречит ей, включая, без ограничения, определенные термины, применение терминов, описанные методики или тому подобное, данная заявка имеет преимущество.

В предшествующих описании и Примерах подробно описаны определенные конкретные воплощения изобретения и описан лучший вариант осуществления изобретения, предполагаемый авторами изобретения. Тем не менее, следует понимать, что независимо от подробности предшествующего описания в тексте, изобретение может быть практически применено множеством путей, и изобретение следует трактовать согласно приложенной формуле изобретения и любым ее эквивалентам.