Результат интеллектуальной деятельности: Средство для дезинвазии против цист букстонелл крупного рогатого скота

Изобретение относится к области ветеринарной протозоологии и может быть использовано в скотоводческих хозяйствах при заболеваниях крупного рогатого скота букстонеллезом.

Паразитарные болезни крупного рогатого скота в нашей стране представляют серьезную проблему для интенсивного развития скотоводства, особенно в хозяйствах с большой концентрацией поголовья. Это связано с широким распространением паразитозов крупного рогатого скота у нас в стране и за рубежом, среди которых основное значение имеют паразитические простейшие, гельминтозы и арахно-энтомозы. Ущерб от паразитарных болезней крупного рогатого скота, прежде всего, обусловлено снижением их продуктивности и ухудшением качества животноводческой продукции, а при высокой интенсивности инвазии и гибелью животных. [1]

Исследованиями отечественных и зарубежных ученых установлено, что каждое скотоводческое хозяйство, практикующее стойлово-выгульное содержание с использованием пастбищ, неблагополучно по паразитарным болезням и, прежде всего, паразитическим простейшим, среди которых по экстенсивности инвазии наиболее часто встречается букстонеллез. По данным литературы в кишечнике крупного рогатого скота разного возраста паразитирует один вид инфузорий Buxtonella sulcata.

Проведенные в условиях скотоводческих хозяйств Центрального и Уральского Федеральных округов исследования показали повсеместное распространение букстонеллезной инвазии среди поголовья. Наибольшая экстенсивность букстонеллезной инвазии была установлена у коров 1-6 отелов, затем в порядке убывания были нетели, молодняк 1-2 лет, молодняк до 1-го года и на последнем месте телята в возрасте до 30 дней. По сезонам года наибольшая экстенсивность букстонеллезной инвазии была отмечена зимой, при этом интенсивность инвазии, по количеству цист в 1 г фекалий, колебалась от 200 до 1100 экз. Исследователи разных стран отмечают отрицательное влияние инвазии на организм животных, когда количество паразитических простейших - букстонелл свыше 800 экз. в 1 г фекалий. Тогда болезнь проявляется клинически, общее состояние животного угнетенное, прекращается руминация, усиливается перистальтика, диарея, слизистая оболочка прямой кишки гиперемирована. Шерстный покров в области хвоста и задних конечностей загрязнен жидкими испражнениями.

Источником инвазии является зараженное животное, восприимчивы к инвазии животные всех возрастов, но наибольшая интенсивность инвазии отмечена у коров в зимние месяцы.

Передача инвазии в неблагополучных хозяйствах происходит через загрязненные цистами букстонелл кормушки, корма, воду, подстилку, инвентарь. Часто механическими разносчиками цист букстонелл становятся грызуны, насекомые - мухи, синантропные птицы, а также обслуживающий персонал - на обуви, одежде, предметах ухода.

Способствуют широкому распространению букстонеллеза крупного рогатого скота различные нарушения технологии выращивания телят: скученность скота в помещениях, повышенная влажность воздуха и подстилки, неполноценное кормление и антисанитария. [2, 4].

Необходимо отметить, что цисты букстонелл могут сохраняться жизнеспособными во внешней среде в течение многих месяцев и служить факторами передачи инвазии к восприимчивым животным. Эпизоотический процесс при букстонеллезе крупного рогатого скота, как и при многих заразных болезнях состоит из трех звеньев: источник инвазии, факторы передачи и восприимчивые животные. Для прерывания этой цепочки, прежде всего, необходимо воздействовать на факторы передачи инвазии, уничтожая экзогенную стадию. [3].

Для борьбы с паразитическими простейшими крупного рогатого скота и, прежде всего, кокцидиоза предложены препараты эффективные как против экзогенных стадий, так и эндогенных. В отношении букстонеллеза крупного рогатого скота раньше такие исследования не проводились. Исходя из отмеченного, проблема букстонеллеза крупного рогатого скота ставит перед исследователями задачу разработать меры борьбы как с экзо-, так и эндогенными стадиями развития инвазии и, прежде всего, разработать средство дезинвазии объектов внешней среды против цист букстонелл.

Среди известных средств дезинвазии, которые используют против экзогенных стадий кокцидий уместно отметить 7%-й раствор аммиака, 2%-я эмульсия ортохлорфенола, 10%-й раствор однохлористого йода, 4%-й раствор едкого натра, который должен иметь температуру не ниже 80°С. Однако эффективность упомянутых средств дезинвазии не устраивает запросы практики. [5].

Исходя из отмеченного и учитывая устойчивость цист букстонелл во внешней среде, эффективное средство дезинвазии против них возможно создать, используя несколько активных компонентов и вспомогательных веществ. В качестве таких препаратов следует рассматривать глутаровый альдегид и йод кристаллический при их совместном применении.

Первый из упомянутых препаратов - глутаровый альдегид, является высокоэффективным дезинфицирующим средством для наружного применения. Второй из отмеченных - йод кристаллический, обладает широким спектром действия в отношении возбудителей инфекционных и инвазионных болезней. Механизм действия йода заключается в коагуляции белков клетки отмеченных возбудителей с образованием йодаминов.

Использованный в качестве вспомогательного вещества полиэтиленгликоль-400 (ПЭГ-400) обладает высокими эмульгирующими свойствами. Наличие фосфорных соединений в составе делает его близким к лецитину и кефалину, благодаря чему он оказывает эффективное смягчающее действие на оболочку паразитического простейшего букстонеллу, а в дальнейшем под воздействием полиэтиленгликоля клеточная мембрана паразита частично растворяется, открывая доступ для проникновения внутрь цисты используемого средства дезинвазии.

При совместном применении против цист букстонелл крупного рогатого скота рассматриваемые выше средства оказывают синергетическое действие на паразитарный объект, использованные в качестве вспомогательных веществ йодид калия, спирт этиловый способствуют лучшей растворимости йода кристаллического, а ПЭГ-400 обладает высокими эмульгирующими свойствами, способствуя очистке пола, стен и технологического оборудования, тем самым повышает биодоступность объекта.

В задачу наших исследований входило разработать эффективное средство дезинвазии против цист букстонелл крупного рогатого скота доступными средствами, пригодными для применения как ручным, так и механизированным способом, не оказывая коррозионное воздействие на используемое технологическое оборудование.

Решение поставленной задачи достигается тем, что в качестве средства дезинвазии против цист букстонелл крупного рогатого скота был использован составленный нами концентрированный комплексный препарат - «Цистодез», имеющий следующий состав: действующие вещества - йод кристаллический 5%, глутаровый альдегид 3% и вспомогательные компоненты - йодид калия 2,1%, спирт этиловый 11,5%, полиэтиленгликоль-400 - 20%) и вода до 100%, соответственно в соотношении масс., %: 5,0:3,0:2,1:11,5:20,0:58,4.

Из доступных заявителю источников информации не известна указанная совокупность существующих признаков, позволяющих получать указанный технический результат, поэтому заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности «новизна».

Заявителю также не известны средства аналогичного назначения, в которых были раскрыты отличительные признаки заявляемого изобретения с получением от использования его в какой-либо совокупности признаков указанного технического результата. Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности «изобретательский уровень».

Доказательства промышленной применимости заявляемого проводятся в следующих примерах:

Примеры конкретного исполнения

Пример 1. Приготовление рабочих растворов, разведений культуры цист букстонелл крупного рогатого скота и осуществление лизис-теста с разной концентрацией препарата «Цистодез»

Исследования по отмеченной проблеме проводили в лаборатории ФГБНУ «Всероссийский НИИ фундаментальной и прикладной паразитологии животных и растений им. К.И. Скрябина (г. Москва).

Раствор с разными концентрациями комбинированного препарата «Цистодез» готовили следующим образом. Брали четыре стеклянные колбы на 1 л и в первую наливали по 970 мл дистиллированной воды и 30 мл средства «Цистодез», во вторую 960 мл дистиллированной воды и 40 мл средства «Цистодез» и в третью колбу наливали 950 мл дистиллированной воды и 50 мл средства «Цистодез» тщательно размешивали в течение 10 минут, оставляли на 30 минут и к концу отмеченного времени раствор с разными концентрациями йода был готов к применению. В четвертую колбу к 500 мл дистиллированной воды добавляли 40 г фенола, размешивали, объем доводили до 1 литра, снова размешивали и раствор был готов к использованию.

Для сбора цист букстонелл крупного рогатого скота использовали свежие фекалии от зараженных животных, которых исследовали в условиях лаборатории методами последовательных промываний. Собранный материал трижды промывали дистиллированной водой и концентрировали путем центрифугирования. Для разведения культуры цист букстонелл использовали дистиллированною воду, подсчитывали их количество в 1 мл под микроскопом.

Для проведения лизис-теста все приготовленные растворы дезинфектантов и дистиллированную воду (контроль) по отдельности поместили по 50 мл в 100 мл колбы и добавили по 20 мл раствора с цистами букстонелл крупного рогатого скота в концентрации 200 цист/мл. Затем эти колбы ставили на вибростолик со скоростью вращения 100 об/мин на 2 часа. По истечении времени содержимое из колбы выливали в пластиковую бутылку с завинчивающейся крышкой объемом 1000 мл. Колбу с остатком раствора несколько раз ополаскивали и сливали в пластиковую бутылку и объем доводили до 1000 мл. Для лучшего смешивания бутылку переворачивали три раза и оставляли при комнатной температуре (20±2°С) в течение 24 часов. После этого раствор сливали до отметки 30 мл, осадок переливали в новую емкость объемом 100 мл, пластиковую бутылку ополаскивали несколько раз с использованием дистиллированной воды, доведя объем до 50 мл.

Пример 2. Биопроба по экспериментальному заражению телят для определения эффективности препарата «Цистодез» для дезинвазии

Испытание проводили в условиях ОАО «Орловское» Щелковского района Московской области на 30 телятах 6-ти месячного возраста, свободных от букстонелл, и корма их не содержали препараты против паразитических простейших. Для контроля концентрации букстонелл (200 цист/мл) в работе использовали камеру Мак Мастера и микроскоп МБС, а для разбавления дистиллированную воду с таким расчетом, чтобы было возможно ввести 5 мл суспензии каждому теленку с общим количеством букстонелл 1000 экз./голову. Телят подвергали клиническому обследованию, индивидуальной нумерации, взвешиванию и по принципу аналогов разделили на шесть групп по 5 животных в каждой.

Телятам первой, второй и третьей групп задавали по 5 мл суспензии цист букстонелл, обработанной 3; 4 и 5%-ми растворами препарата «Цистодез» внутрь при помощи мини зонда. Четвертой группе телят задавали по 5 мл суспензии цист букстонелл, обработанной 4%-м раствором фенола (базовый препарат). Телята пятой группы получали по 5 мл суспензии, содержащую цисты в количестве 200 экз./мл и служили зараженным контролем. Телята шестой группы получали по 5 мл дистиллированной воды и служили «чистым контролем».

Телята всех 6 групп за время опыта находились в аналогичных условиях содержания и имели одинаковый рацион. В течение всего периода опыта за телятами вели ежедневные клинические наблюдения за общим состоянием, их поведением, приемом корма и воды, видимыми физиологическими изменениями и другими показателями.

Для определения цист букстонелл в фекалиях от телят каждой группы отдельно с 6 по 12-е сутки ежедневно собирали все фекалии, взвешивали, добавляли воду до объема 6000 г, смешивали смесителем в течение 7 минут. Для дальнейших исследований пробы отбирали из каждой группы в количестве 50 г, которые консервировали 4%-м раствором бихромата калия и доводили до однородной массы путем размешивания миксером, затем переложили в пластиковые емкости с завинчивающейся крышкой и хранили в холодильнике при +4°С.

Цист букстонелл в фекалиях определяли методом последовательных промываний, а их количество подсчитывали с использованием камеры Мак Мастера.

Эффективность дезинвазии при назначении различных концентраций препарата «Цистодез», а также 4%-ной концентрацией базового препарата фенола определяли, исходя из процента снижения выделения цист букстонелл после воздействия на них отмеченных выше препаратов и концентраций по сравнению с телятами зараженного контроля, которым назначали по 200 цист/мл.

Кормление и условия содержания опытных телят всех групп за время испытания были одинаковые. Так, в помещении, где содержали телят температура воздуха равнялась 18°С, влажность воздуха 68±4%.

Общее состояние опытных телят после назначения суспензии букстонелл, обработанной разными концентрациями препарата «Цистодез», рекомендованной дозой фенола, а также чистой культурой цист букстонелл, оценивали по данным клинических наблюдений, которые показали наличие определенного угнетенного состояния, они были малоактивны и стояли в станке, опустив голову. Каких-либо осложнений при назначении суспензии с цистами букстонелл и после нее не отмечено. Со второго дня после начала опыта по данным общеклинических наблюдений телята, получившие суспензию цист букстонелл, обработанную разными препаратами и их концентрациями, чистой культурой цист и контрольные не отличались друг от друга.

Исследования по определению цист букстонелл в фекалиях опытных телят, собранных с 6 по 12-е сутки после назначения обработанной дезинфектантами суспензии, их находили в определенном количестве, но не во всех группах. При исследовании опытных телят 1-й группы, которым давали суспензию цист, обработанную 3%-ной концентрацией препарата «Цистодез», цист букстонелл в фекалиях находили через 3 и 5 суток в количестве 4 и 5 экз., что составляет 0,7 и 0,83 на камеру и средний показатель в 1-й камере за период исследований составил 0,22. Количество цист в 1 г фекалий составило 44 экз., что в проценте от контроля - 2,14. Отсюда, интенсэффективность «Цистодеза» в 3%-ной концентрации или процент снижения количества цист после воздействия на них препаратом составила 97,9% (табл. 1).

У телят 2 и 3-й групп, которым назначали суспензию цист, обработанную 4 и 5%-ной концентрацией «Цистодеза», при исследовании проб фекалий ни в одном случае цист не находили, что дает нам основание отметить 100%-ю эффективность «Цистодеза» в отмеченных концентрациях против цист букстонелл крупного рогатого скота.

У телят 4-й группы после дачи суспензии цист букстонелл, обработанной 4%-ной концентрацией фенола (базовый препарат), цист в фекалиях находили во все сроки исследований в количестве от 1,3 до 5,1 в камере, а средний показатель в 1-й камере за период исследований составил 3,01. Количество цист в 1 г фекалий по данной группе равнялось 602, что составляет 29,2% от контроля. Отсюда, интенсэффективность фенола в 4%-ной концентрации против цист букстонелл крупного рогатого скота составила 70,8%).

Телята 5-й группы, получавшие 200 цист/мл, во все сроки исследований с фекалиями выделяли цисты в количестве от 1,6 до 15,8 в камере и средний показатель в 1-й камере за период исследований составил 10,3. Количество цист в 1 г фекалий по этой группе составило 2060 и данный показатель нами использовался как исходный при расчете процента снижения количества цист или интенсэффективность испытанных в опыте препаратов.

Телята 6-й группы, которые получали дистиллированную воду без цист, служили незараженным контролем и во все сроки исследований оставались свободными от инвазии.

Для установления интенсэффективности использованных в своей работе дезинфектантов или процента снижения количества цист использовали следующую формулу:

, где

ИЭ - интенсэффективность средства, %;

К_ЦК - количество цист у телят контрольной группы,

К_ЦД - количество цист у телят, получавших обработанные дезинфектантом цисты.

Используя полученные нами в опыте данные, определяли интенсэффективность «Цистодеза» в 3%-ной концентрации

В концентрациях 4 и 5% «Цистодез» против цист букстонелл показал 100%-ную эффективность.

Использованный нами в качестве базового препарата фенол 4%-ный показал против цист букстонелл крупного рогатого скота

Пример 3. Производственное испытание эффективности «Цистодеза» против букстонелл крупного рогатого скота

Эффективность «Цистодеза» 4%-го против цист букстонелл крупного рогатого скота в производственном испытании устанавливали опытным путем с искусственной закладкой цист букстонелл на контрольные площадки по сравнению с базовым препаратом фенолом 4%-м при экспозиции 2 часа. Испытание проводили в условиях скотоводческого хозяйства ОАО им. Гурьянова Калужской области в августе-сентябре 2017 г. В коровнике №4, где предварительно проводили чистку и дезинфекцию, были выбраны три площадки по 1 м². Каждая площадка была отделена от другой пластиковыми рейками и площадки имели ровную поверхность для исключения подтека раствора после дезинвазии. Предварительно исследовали коров и молодняк разного возраста для установления их зараженности, собирали цист букстонелл, готовили культуру и необходимое для опыта разведение. В начале испытания на каждую опытную площадку равномерно наносили по 1000 цист букстонелл в разведении с 50 мл дистиллированной водой, используя малый пульверизатор, и оставили на 20 минут для лучшего пропитывания. По истечении времени на первую опытную площадку наносили Цистодез 4%-й, норма 0,5 л на 1 м² при экспозиции 2 часа. На вторую опытную площадку наносили раствор фенола - 4% при норме 0,5 л на 1 м² и экспозиции 2 часа. Третья площадка была контрольная и препарат для дезинвазии туда не наносили.

Через два часа из всей поверхности каждой опытной площадки брали смывы, используя кисточку и дистиллированную воду. Полученный смыв переносили в пластиковую бутылку, объем доводили до 1000 мл, перемешивали 2-3 раза и оставляли на 24 часа. Затем сливали до отметки, оставляя 30 мл раствора, который использовали для биопробы на 15 телятах 6-месячного возраста. Телята первой группы, которым давали по 5 мл суспензии цист букстонелл, обработанной на опытной площадке 4%-ным раствором «Цистодеза», имели исходную массу 95 кг. Живая масса телят второй группы, получившей суспензию букстонелл, обработанную базовым препаратом фенолом, равнялась 93 кг. У телят группы зараженного контроля средняя живая масса на день начала опыта составила 97 кг.

Оценку общего состояния опытных телят после назначения суспензии цист букстонелл, обработанной растворами «Цистодеза» и фенола, а также чистой культурой букстонелл, проводили по данным ежедневных клинических наблюдений.

Результаты наблюдений показали, что в течение 24 часов после назначения у телят было угнетенное состояние, они были малоактивны, редко подходили к кормушке, что скорее всего было вызвано стрессом, обусловленным отловом, взвешиванием и заражением путем дачи цист букстонелл. Осложнений при назначении суспензии цист и после него не было отмечено. Через день после назначения суспензии цист, обработанной «Цистодезом», фенолом и чистой культурой цист букстонелл, телята разных групп не отличались друг от друга.

При исследовании собранных с 6 по 12-е сутки после назначения цист проб фекалий из разных групп телят были выделены цисты, но их количество заметно отличалось.

У телят 1-й группы, которым назначали суспензию цист, обработанную 4%-ным раствором «Цистодеза», цист букстонелл в фекалиях находили во все сроки исследований в количестве от 0,5 до 1,5 экз., а среднее количество в одной камере за все исследования составило 0,83 экз. Количество цист в 1 г исследуемых фекалий составило 166 экз., что в проценте от зараженного контроля 7,68 (табл. 2). Далее устанавливали интенсэффективность «Цистодеза» в 4%-ной концентрации или процент снижения цист после воздействия на них препаратом, и она составила 92,32%.

У телят 2-й группы, которым давали суспензию, обработанную 4%-м раствором фенола (базовый препарат), цист в камере находили во все сроки исследований в количестве от 1,7 до 3,5 в камере и средний показатель в одной камере за период исследований составил 2,6 экз. Количество цист в 1 г фекалий от телят второй группы составило 520 экз. или в проценте от зараженного контроля 24,1. Затем определяли интенсэффективность фенола в 4%-ной концентрации или процент снижения количества цист после воздействия на них препаратом, и она составила 75,6%.

Телята 3-й контрольной группы, которым задавали по 200 цист/мл во все сроки исследований с фекалиями выделяли цисты букстонелл в количестве от 8,5 до 12,6, а средний показатель в одной камере за период исследований составил 10,8 экз. Количество цист в 1 г фекалий по данной группе зараженного контроля составило 2160 и этот показатель нами использовался как исходный при расчете снижения количества цист или интенсэффективность использованных в производственном испытании препаратов «Цистодез» и фенол.

Результаты, полученные при производственном испытании «Цистодеза» 4%-го в дозе 0,5 л на 1 м², при экспозиции 2 часа свидетельствуют о высокой эффективности испытанного средства для дезинвазии против цист букстонелл крупного рогатого скота, интенсэффективность составила 92,32%. Тогда как эффективность базового препарата фенола 4%-го равнялась 75,6%.

Таким образом, комплексный препарат «Цистодез» 4%-й для дезинвазии объектов внешней среды в скотоводческих хозяйствах в дозе 0,5 л на 1 м² при экспозиции 2 часа показал против цист букстонелл 92,32%-ю интенсэффективность. Предложенное средство, включающее в себя использование комплексного концентрированного препарата «Цистодез» против цист букстонелл, обеспечивает высокую интенсэффективность при букстонеллезе крупного рогатого скота.

Источники информации

1. Акбаев М.Ш., Василевич Ф.И., Водянов А.А. и др. Паразитология и инвазионные болезни животных. - М., 2008. - 776 с.

2. Вершинин И.И. Кокцидиозы животных и их дифференциальная диагностика. - Екатеринбург, 1996. - 264 с.

3. Крылов М.В. Определитель паразитических простейших. - СПб, 1996. - 602 с.

4. Шибитов С.К., Сафиуллин Р.Т. Распространение Buxtonella sulcate крупного рогатого скота в Центральной зоне России // Ветеринария. - М., 2016. - №8. - С. 36-38.

5. Черепанов А.А. Методические рекомендации по испытанию средств дезинвазии в ветеринарии. - М., 1999. - 16 с.