Результат интеллектуальной деятельности: Способ сбора и фиксации нематод, паразитирующих в сычуге и тонком кишечнике жвачных животных

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности - ветеринарной гельминтологии, и может быть использовано для диагностики нематодозов жвачных животных.

Нематодозы широко распространены у жвачных как в России, так и в других странах. Ущерб от нематодозов складывается из ухудшения усвояемости корма, снижения темпов развития молодняка, повышения восприимчивости к инфекционным заболеваниям, снижения продуктивности [1, 3, 5]. Нематоды, паразитирующие в сычуге и тонком кишечнике, по современной классификации принадлежат в основном к надсемейству Trichostrongyloidea и насчитывают несколько десятков видов [7]. Эти виды отличаются как по особенностям биологии, так и по устойчивости к антигельминтным препаратам [6]. Методы прижизненной диагностики гельминтозов (копроовоскопия, копролярвоскопия) не позволяют точно определить таксономический состав нематод, паразитирующих у жвачных в сычуге и тонком кишечнике. В большинстве случаев при копроовоскопии таксономическая принадлежность таких нематод может быть определена только до уровня подотряда, а при копролярвоскопии - до рода. Посмертная диагностика (гельминтологическое вскрытие) дает возможность точно определить видовой состав нематод, однако существующий способ сбора и фиксации нематод имеет недостатки.

Наиболее широко применяемым способом сбора и фиксации нематод, паразитирующих в сычуге и тонком кишечнике, до сих пор является способ, предложенный в 1928 году [4], или его модификация 1971 года [2]. Согласно этому способу, для промывания от слизи и пищеварительных соков предлагается помещать содержимое сычуга и тонкого кишечника в мешок из мельничного газа или марли (с ячеей 0,2-0,4 мм²), завязывать и затем промывать под струей воды или прополаскивать в емкости с водой или водоеме. При этом гельминтологический материал часто оказывается не полностью отмытым от пищеварительных соков, что может вызвать разрушение нематод. В ряде случаев мешки разрываются, что ведет к потере собранного материала. Некоторое количество нематод застревает в складках и швах мешка, что невозможно определить при визуальном осмотре, однако при повторном использовании мешка такие нематоды могут попасть в материал от другого животного, что исказит получаемые научные данные. Используемая для фиксации нематод жидкость Барбагалло (3%-ный раствор формалина (40%-ного формальдегида) на 0,8%-ном растворе хлорида натрия) разрушает ДНК, что делает невозможным использование образцов нематод для молекулярной диагностики и молекулярной таксономии.

В связи с этим, в задачу данного исследования входило создание способа сбора и фиксации нематод, обеспечивающего достаточное промывание нематод от пищеварительных соков, минимизирующего потери образцов при сборе, предотвращающего смешивание образцов от разных животных, а также позволяющего использовать собранных нематод для ДНК-исследований.

Предлагаемый способ сбора и фиксации нематод включает в себя: 1. вскрытие сычуга и тонкого кишечника (без разделения); 2. визуальный осмотр их содержимого и извлечение крупных гельминтов; 3. перенос содержимого в пластиковую, металлическую или стеклянную емкость объемом 5-10 литров; 4. добавление воды в соотношении 1:1 по объему; 5. перемешивание; 6. отстаивание в течение 10-15 минут; 7. слив надосадочной жидкости. Действия с 4 по 7 повторяются 3-5 раз, пока надосадочная жидкость не станет прозрачной. После этого осадок (матрикс) фиксируют 96%-ным этанолом в соотношении 1:1.

Предлагаемый способ обладает следующими преимуществами:

1. Простота применения - нет необходимости изготавливать мешок из марли или мельничного газа, в качестве емкости для промывания может быть использовано пластиковое или металлическое ведро, стеклянная банка и т.п.

2. Минимизируются потери образцов при сборе.

3. Исключено смешивание образцов от разных животных.

4. Фиксация материала в 96%-ном этаноле позволяет в дальнейшем использовать обнаруженных нематод для ДНК-исследований.

Перечисленные положительные признаки предлагаемого способа по сравнению с прототипом обеспечивают соответствие технического решения критерию «новизна» и это позволяет сделать вывод о соответствии технического решения критерию «существенные отличия».

Эффективность предлагаемого способа демонстрируется следующими примерами:

Пример 1. Сбор и фиксация нематод при гельминтологическом вскрытии сычуга и тонкого кишечника крупного рогатого скота.

После вскрытия брюшной полости на сычуг (на границе с книжкой) и тонкий кишечник (на расстоянии около 100 см от сычуга) накладывали лигатуры для предотвращения вытекания содержимого, затем сычуг и тонкий кишечник, без разделения друг от друга, отрезали от других частей пищеварительной системы. После этого сычуг и тонкий кишечник выдерживали 1 час при температуре +4°C и затем разрезали вдоль с помощью ножниц. Проводили визуальный осмотр внутреннего содержимого на наличие крупных гельминтов, затем содержимое (объем которого составил около 3 л) помещали в пластиковое ведро, заливали 3 л водопроводной воды, перемешивали. Слизистую оболочку сычуга и тонкого кишечника осматривали на наличие нематод, соскабливали скальпелем и смывали водой в ведро с содержимым. После отстаивания в течение 10-15 минут, надосадочную жидкость сливали, к осадку вновь добавляли 3 л воды, перемешивали и отстаивали. Промывание осадка повторяли 3-5 раз, пока надосадочная жидкость не становилась прозрачной. После этого осадок (матрикс) фиксировали 96%-ным этанолом в соотношении 1:1 по объему и переливали в другой сосуд для хранения. Емкость, в которой проводили промывание осадка, тщательно ополаскивали водопроводной водой, чтобы исключить контаминацию следующих исследуемых образцов.

В дальнейшем матрикс просматривали в лаборатории под бинокулярной лупой типа МБИ-15. Для этого порции матрикса по 1-2 мл помещали в чашку Петри, просматривали при 12,5-25-кратном увеличении. Обнаруженных нематод извлекали и помещали в пробирки или флаконы с 96%-ным этанолом. При микроскопировании обнаруженных нематод установлено, что 96%-ный этанол не оказывает разрушающего действия на их морфологические структуры, а при проведении ДНК-исследований были успешно получены различные фрагменты рибосомальной и митохондриальной ДНК размером порядка 700 нуклеотидов, что является достаточным для диагностических и таксономических исследований.

Пример 2. Сбор и фиксация нематод при гельминтологическом вскрытии сычуга и тонкого кишечника овцы.

Аналогично примеру 1 проводилось вскрытие брюшной полости овцы, отделение сычуга и участка тонкого кишечника (в данном случае длиной около 50 см), их выдерживание 1 час при температуре +4°C, разрезание, перенос содержимого в пластиковое ведро. Объем содержимого составил около 1 л, к нему добавляли 1 л воды, далее порядок действии был аналогичен указанным в примере 1. У собранных и зафиксированных нематод овцы морфологические структуры сохранились пригодными для микроскопирования, при проведении ДНК-исследований этих образцов были успешно получены фрагменты рибосомальной и митохондриальной ДНК размером порядка 700 нуклеотидов.

Пример 3. Сбор и фиксация нематод при гельминтологическом вскрытии сычуга и тонкого кишечника европейской косули.

Аналогично примерам 1 и 2 проводилось вскрытие брюшной полости европейской косули, отделение сычуга и участка тонкого кишечника (в данном случае длиной около 30 см), их выдерживание 1 час при температуре +4°C, разрезание, перенос содержимого в пластиковое ведро. Объем содержимого составил около 0,5 л, к нему добавляли 0,5 л воды, далее порядок действий был аналогичен указанным в примере 1. Собранные и зафиксированные образцы нематод европейской косули были пригодны для микроскопирования и ДНК-исследований.

Полученные результаты показывают, что предлагаемый «Способ сбора и фиксации нематод, паразитирующих в сычуге и тонком кишечнике жвачных животных», по сравнению с прототипом - методом полного гельминтологического вскрытия, является более простым в применении, минимизирует потери образцов при сборе, исключает смешивание образцов от разных животных, обеспечивает хорошую сохранность морфологических структур нематод и позволяет исследовать ДНК собранных образцов.

Литература

1. Акбаев М.Ш., Водянов А.А., Косминков Н.Е., А.И. Ятусевич, Пашкин П.И., Василевич Ф.И. Паразитология и инвазионные болезни животных. - М.: Колос. - 1998. - 743 с.

2. Ивашкин В.М., Контримавичус В.Н., Назарова Н.С. Методы сбора и изучения гельминтов наземных млекопитающих. - М.: Наука. - 1971. - 124 с.

3. Сафиуллин Р.Т. Распространение и экономический ущерб от основных гельминтозов жвачных животных // Ветеринария. - 1997. - №6. - С. 28-32.

4. Скрябин К.И. Метод полных гельминтологических вскрытий позвоночных, включая и человека. - М.: Изд-во МГУ, 1928. - 45 с.

5. Скрябин К.И., Петров A.M. Основы ветеринарной нематодологии. - М.: Колос - 1964. - 527 с.

6. Cintra M.C.R., Teixeira V.N., Nascimento L.V., Sotomaior C.S. Lack of efficacy of monepantel against Trichostrongylus colubriformis in sheep in Brazil // Veterinary Parasitology. - 2016. - V. 216. - P. 4-6.

7. Durette-Desset M.C., Hugot J.P. A cladistic analysis of the Trichostrongyloidea (Nematoda) // Int. J. Parasitol. - 1999. - V. 29 (7). - P. 1065-1086.