Результат интеллектуальной деятельности: Способ ингибирования нуклеарного фактора каппа В с использованием 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния L-2,6-диаминогексаноата в культуре клеток

Способ ингибирования нуклеарного фактора каппа В с использованием 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния L-2,6-диаминогексаноата в культуре клеток

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии.

По известным литературным источникам – нуклеарный фактор каппа В (NF-κB) на сегодняшний день является одной из перспективных мишеней для разработки инновационных лекарственных средств в рамках развития современной фармакологии и формирования концепции таргетной терапии [Test system for evaluation of the influence of the biological activity of substances on the signal system of NF-κB: focus on the derivatives of 3 hydroxypyridine / Skachilova S.Y., Ragulina V.A., Kostina D.A., Burda Y.E. // Research result: pharmacology and clinical pharmacology. – 2017. – Vol. 3, №2. – Р. 50-56. doi: 10.18413/2313-8971-2017-3-2-50-56].

NF-κB является одним из факторов транскрипции. Повышенный интерес к изучению биологической роли данной сигнальной системы и вкладе её в развитие сердечно-сосудистых, онкологических и аутоиммунных заболеваний очевиден [Role of nuclear factor-κB activation in acute ischaemia-reperfusion injury in myocardium / A. Kis, D.M. Yellon, G.F. Baxter // British Journal of Pharmacology. – 2003. – 138(5). – P. 894-900, doi:10.1038/sj.bjp.0705108; Nuclear factor kappa B: important transcription factor and therapeutic target. Lee JI, Burckart GJ. J Clin Pharmacol. 1998 Nov;38(11):981-93]. Целый ряд стимулов (провоспалительные цитокины: фактор некроза опухоли α, интерлейкин 1β; лиганд CD40 и др.), запускают канонический и неканонический пути активации сигнального пути NF-κB, что повышает экспрессию генов, регулирующих синтез цитокинов и хемокинов, пролиферацию и дифференцировку клеток, ангиогенез, иммунные реакции и апоптоз [Nuclear factor kappa B as a potential target for pharmacological correction endothelium-associated pathology / V.A. Ragulina, D.A. Kostina, A.P. Dovgan, Y.E. Burda, S.V. Nadezhdin // Research result: pharmacology and clinical pharmacology. – 2017. – Vol. 3, №1 – P. 114-124. DOI: 10.18413/2500-235X-2017-3-1-114-124].

Потенциальными кандидатами, снижающими активность данного транскрипционного фактора являются производные 3-оксипиридина. В связи с вышесказанным следует отметить актуальность изучения 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния L-2,6-диаминогексаноата в качестве ингибитора NF-κB in vitro с оценкой активности p65 субъединицы в мононуклеарных клетках (МНК) крови крыс линии Wistar, стимулированных бактериальным липополисахаридом.

Известен способ ингибирования NF-κB композициями тритерпенов (патент на изобретение RU 2288706, публ. 10.12.2006). Сущность его заключается в ингибировании воспаления путем обеспечения клетки монотерпеновыми композициями, которые ингибируют фактор NF-κB. Композиция может включать дополнительные химические функциональные агенты. Технический результат - повышение эффективности лечения воспалительных состояний, в частности предраковых.

Основным недостатком способа является то, что применяемые терапевтические дозы монотерпеновых/тритерпеновых соединений могут привести к значительным побочным эффектам или к другим неблагоприятным реакциям. У субъектов с далеко зашедшим заболеванием может наблюдаться определенная степень побочных эффектов при применении терапевтических доз монотерпеновых/тритерпеновых соединений.

Известно зависящее от концентрации влияние (R)- и (S)-флурбипрофена на активацию фактора транскрипции NF-κВ в RAW-клетках (патент на изобретение RU 2250103, публ. 20.04.2005). Анализ гельудерживания показывает, что липополисахарид (ЛПС) (1 мкг/мл) приводит к активации NF-κВ (комплекс р50/р65 NF-κВ). Микромолярные концентрации (R)-флурбипрофена были в состоянии ингибировать эту индуцированную ЛПС активацию NF-κВ.

Изобретение относится к области фармации, а именно к применению (R)-энантиомеров арилпропионовых кислот. Сущность изобретения - применение названных кислот для получения лекарственных средств, которые ингибируют каскад активации NF-κB. На основе их создана композиция. Технический результат - использование для лечения заболеваний, на которые может терапевтически положительно воздействовать ингибирование образования NF-κB.

Недостатком данного изобретения является то, что арилпропионовые кислоты и их производные обладают рядом побочных эффектов при их применении, а именно тошнота, анорексия, метеоризм, запор, изжога, диарея, НПВС-гастропатия, вплоть до эрозивно-язвенных поражений ЖКТ.

Наиболее близким к заявленному решению является способ ингибирования NF-κB с использованием производных 3-оксипиридина (Test system for evaluation of the influence of the biological activity of substances on the signal system of NF-κB: focus on the derivatives of 3hydroxypyridine / Skachilova S.Y., Ragulina V.A., Kostina D.A., Burda Y.E. // Research result: pharmacology and clinical pharmacology. – 2017. – Vol. 3, №2. – Р. 50-56), включающий добавление бактериального липополисахарида в концентрации 1 мкг/мл к свежевыделенным по стандартной методике на градиенте плотности фиколла МНК крови крыс Wistar, затем добавление к данной смеси исследуемого фармакологического агента, растворенного в фосфатно-солевом буфере, в соответствующей конечной концентрации, отличающийся тем, что в качестве фармакологического агента используют мексидол, этоксидол, 3-гидрокси-2-этил-6-метилпиридиния глутаминат, 3-гидрокси-2-этил-6-метилпиридиния аспарагинат, 3-гидрокси-2-этил-6-метилпиридиния 4-аминобензоат, 3-гидрокси-2-этил-6-метилпиридиния никотинат, 3-гидрокси-2-этил-6-метилпиридиния N-ацетиламиногексаноат, 3-гидрокси-2-этил-6-метилпиридиния N-ацетиламиноацетат, 3-гидрокси-2-этил-6-метилпиридиния N-ацетиламиноглутаминат, 3-гидрокси-2-этил-6-метилпиридиния ацетилсалицилат, бета-гидроксиникотиноилгидразон 2-метил-3-гидрокси-4-формил-5-оксиметилпиридина дигидрохлорид. Наибольшей ингибирующей способностью на ЛПС-индуцированную экспрессию p65 NF-κB в МНК обладали мексидол, этоксидол и бета-гидроксиникотиноилгидразон 2-метил-3-гидрокси-4-формил-5-оксиметилпиридина дигидрохлорид.

Недостатком данного решения является то, что наблюдаемая ингибирующая активность in vitro в отношении сигнального пути NF-κB мексидола, этоксидола и бета-гидроксиникотиноилгидразон 2-метил-3-гидрокси-4-формил-5-оксиметилпиридина дигидрохлорида не достигает целевых значений и более чем в 3,5 раза отличается от значений интактных крыс.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является эффективный способ ингибирования NF-κB с использованием 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния L-2,6-диаминогексаноата, подтверждаемый результатами оценки активности p65 субъединицы в МНК крови крыс Wistar, стимулированных бактериальным липополисахаридом, обладающий более благоприятным профилем безопасности по сравнению с рассмотренными аналогами и более высокой ингибирующей активностью NF-κB по сравнению с прототипом.

Задачей предлагаемого изобретения является создание эффективного способа ингибирования нуклеарного фактора каппа В с использованием 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния L-2,6-диаминогексаноата в культуре мононуклеарных клеток крови крыс Wistar.

Поставленная задача достигается тем, что предложен способ ингибирования нуклеарного фактора каппа В с использованием 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния L-2,6-диаминогексаноата в культуре клеток, включающий добавление бактериального липополисахарида в концентрации 1 мкг/мл к свежевыделенным по стандартной методике на градиенте плотности фиколла МНК крови крыс Wistar, затем добавление к данной смеси исследуемого фармакологического агента, растворенного в фосфатно-солевом буфере, в соответствующей конечной концентрации, отличающийся тем, что в качестве фармакологического агента используют 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния L-2,6-диаминогексаноат.

Основным преимуществом предлагаемого способа является то, что введение нового производного 3-оксипиридина, 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния L-2,6-диаминогексаноата, в исследуемой in vitro концентрации, 35 мкг/мл, приводит к выраженному ингибированию NF-κB в культуре клеток, что подтверждается результатами оценки активности p65 субъединицы в МНК крови крыс Wistar, стимулированных бактериальным липополисахаридом. Помимо этого, предлагаемый способ обладает более благоприятным профилем безопасности по сравнению с рассмотренными аналогами и более высокой ингибирующей активностью NF-κB по сравнению с прототипом.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 2-ЭТИЛ-6-МЕТИЛ-3-ГИДРОКСИПИРИДИНИЯ L-2,6-ДИАМИНОГЕКСАНОАТА

В трехгорлую колбу, снабженную мешалкой, термометром и обратным холодильником, загружают 30 мл этилового спирта. При перемешивании добавляют 2,74 г (0,02 м) 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина. После растворения добавляют постепенно 3,92 г (0,02 м) L-2,6-диаминогексановой кислоты. Массу нагревают до 75 °C, выдерживают при этой температуре в течение 1 часа, полученный раствор фильтруют. От фильтрата отгоняют растворитель, приливают к остатку 15 мл ацетонитрила, кристаллизуют при +5 °C в течение 8-10 часов. Кристаллы отделяют фильтрацией, сушат в вакууме при 35-40 °C, получают 5,4 г гигроскопичного мелкокристаллического вещества, растворимого в воде. C₁₄H₂₅N₃O₃

Найдено, % : C 59,21; H 8,94; N 14,79

Вычислено, % : C 59,34; H 8,89; N 14,83; O 16,94

ИК-спектр, ν см^-1: 3495 (OH); 3370, 3285 (NH₂); 2560 (N+); 1645, 1610 (C=C); 1287 (CH₂)

УФ-спектр, нм: 231, 296 (0,001% раствор в воде)

ТСХ: система бензол-ацетон (2-3), пластины Merck, Rf – 0,43

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

2-ЭТИЛ-6-МЕТИЛ-3-ГИДРОКСИПИРИДИНИЯ L-2,6-ДИАМИНОГЕКСАНОАТА

При изучении ингибирующей активности в отношении NF-κB были исследованы 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния L-2,6-диаминогексаноат и мексидол (препарат сравнения), которые добавляли к свежевыделенным по стандартной методике на градиенте плотности фиколла (ρ = 1,077, «Панэко», Россия) МНК крови крыс линии Wistar. Исследуемая in vitro концентрация каждого препарата составляет 35 мкг/мл.

В каждой экспериментальной группе 6 крыс, 3 самца и 3 самки. Для исследования взяты крысы без внешних признаков заболевания, прошедшие карантинный режим, массой 225-275 г.

Исследование активности NF-κB проводили в 2 мл пробирках типа Eppendorf (Gen Follower, Китай), куда вносили 1 мл суспензии МНК крови крыс, 1×106 клеток в 1 мл среды RPMI-1640 («Панэко», Россия) с 5% сыворотки эмбрионов коров (HiClone, США), затем добавляли бактериальный липополисахарид («Пирогенал», ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, Россия) в концентрации 1 мкг/мл, затем добавляли исследуемый препарат, растворенный в фосфатно-солевом буфере, в соответствующей конечной концентрации. Клетки инкубировали в течение 30 мин при 37°С на шейкере, после чего центрифугировали 5 мин при 200g, надосадочную жидкость удаляли, осадок МНК исследовали на активность p65 субъединицы NF-κB в строгом соответствии с инструкцией к набору NFkB p65 TotalMultispecies InstantOne™ ELISA Kit (Invitrogen / Thermo Fisher Scientific, cat. 85-86081-11).

МНК крови крыс в количестве 1×106 лизировали в 1 мл лизирующего буфера, входящего в состав набора, супернатант вносили в лунки 96-луночного планшета из указанного ИФА набора. После нескольких этапов продукты сэндвич-реакции определяли на микропланшетном ридере Multiskan FC (Thermo Fisher, Германия) при 450 нм.

Для упрощения расчетов относительного влияния исследуемых веществ были выбраны единицы оптической плотности, непосредственно получаемые с микропланшетного ридера, округленные до 2-го знака после запятой. Статистическую обработку результатов проводили в программе MS Excel 2013 с модулем Attestatv.13 с применением метода непараметрической статистики – критерия Крускала-Уоллиса, т.к. распределение активности p65 субъединицы NF-κB в клетках не являлось нормальным.

ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ

Результаты оценки ингибирующей NF-κB активности исследуемых препаратов представлены в табл. 1 (Медианы – Ме и 1, 3 квартили – Q1; Q3).

Как видно из табл. 1, наибольшей ингибирующей способностью на ЛПС-индуцированную экспрессию p65 NF-κB в МНК крови крыс Wistar в исследуемых концентрациях обладает 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния L-2,6-диаминогексаноат. Ингибирующая активность NF-κB 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния L-2,6-диаминогексаноата выше на 34,6%, чем у препарата сравнения мексидола, в конечной концентрации 35 мкг/мл при индуцированной ЛПС активации NF-κВ.