Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ С3-КОНВЕРТАЗЫ АЛЬТЕРНАТИВНОГО ПУТИ АКТИВАЦИИ КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА

Изобретение относится к клинической иммунологии и может быть использовано для определения функциональной активности С3-конвертазы альтернативного пути активации комплемента человека.

Проблема оценки состояния иммунной системы организма человека остается в настоящее время актуальной в связи с тем, что многие соматические заболевания характеризуются иммунодефицитом, и соответствующая иммунокорригирующая терапия позволит более рационально и эффективно проводить терапию этих состояний.

Система комплемента является частью иммунной системы и состоит из более чем 40 компонентов, которые действуют посредством каскадной активации. Эта система играет ключевую роль как в клиренсе ИК, так и в иммунном ответе на инфекционные агенты, чужеродные антигены, опухолевые и вирус-инфицированные клетки [Rittirsch D., Redl H., and Huber-Lang M. Roleof Complementin Multiorgan Failure // Clinical and Developmental Immunology. - 2012; 2012:962927. doi: 10.1155/2012/962927.].

Известны три пути активации системы комплемента: классический, альтернативный и лектиновый, отличающиеся способом образования С3-конвертаз. Субстратом С3-конвертаз всех трех путей активации системы комплемента является компонент С3, при расщеплении которого образуются С3а и C3b. Присоединение дополнительных молекул C3b к С3-конвертазам приводит к образованию С5-конвертаз, которые запускают реакцию формирования мембрано-атакующего комплекса (МАК).

Альтернативный путь активации системы комплемента инициируется при спонтанном гидролизе компонента С3, который происходит при расщеплении тиоэфирной связи с образованием С3(Н₂О) и формировании первоначальных жидкофазных С3-конвертаз после связывания фактора В и активации его фактором D (С3(H₂O)Bb. Эта С3-конвертаза расщепляет молекулы С3 на С3а и C3b. C3b молекулы связываются ковалентно с патогенами или с любой поверхностью. Далее иммобилизованный C3b на поверхности взаимодействует с фактором В с образованием мембрано-связанной С3-конвертазы (C3bBb) альтернативного пути. Фактор В несет каталитический участок С3-конвертазы, C3bBb, которая является высокоспецифичной и эффективно регулируемой сериновой протеазой. С3-конвертаза стабилизируется при связывании пропердина, который также служит платформой для сборки С3-конвертазы на поверхности микроорганизмов, апоптозных или злокачественных клеток [Hourcade D.Е. Therole of properdinin the assembly of the alternative pathway C3 convertase of complement // J.Biol.Chem. - 2006. - V. 28, №4. - Р. 2128-2132]. Отрицательными регуляторами (ингибиторами) данного ферментного комплекса являются - фактор Н, мембранный кофакторный белок (МСР, CD46) и фактор ускоряющий распад (DAF, CD55). Все они, с одной стороны, поддерживают время функционирования С3-конвертазы альтернативного пути в пределах нескольких минут, с другой стороны, они предотвращают отложение С3 и формирование С3-конвертазы на здоровых клетках хозяина.

Избыточная (неконтролируемая) активация системы комплемента является частью патогенеза большого числа воспалительных заболеваний. Патологические эффекты могут быть обусловлены повышенной продолжительной активацией, например, вызванной присутствием иммунных комплексов (такой как системная красная волчанка и связанные с ней заболевания), а также или сниженной экспрессией или функция различных ингибиторов комплемента, или комбинацией этих двух факторов [Carroll M.V., R.В. Sim R.B. Complement in health and disease // Advanced Drug Delivery Reviews. - 2011. - V. 63, №12. - P. 965-975].

Ишемия и последующая реперфузия органов и тканей наблюдается при таких состояниях как инфаркт миокарда или инсульт. Активация комплемента и недостаточная регуляция играет важную роль при реперфузионном повреждении и активация всех трех путей комплемента участвует в данном процессе. Результатом является мультифункциональный воспалительный процесс, вовлекающий генерацию анафилатоксинов, повышенную экспрессию адгезивных белков и тканевых факторов на эндотелиальных клетках и выход из сосудов полиморфно-ядерных лейкоцитов [Banz Y., Rieben R. Role of complement and perspectives for intervention in ischemia-reperfusion damage // Annals of Medicine. - 2012. - V. 44, №3. - P. 205-217].

Мембрано-пролиферативный гломерулонефрит (МГТГН) тип II связан с С3 нефритическим фактором (С3НФ) [Sethi S., Nester С.М., Smith R.J. Membranoproliferative glomerulonephritis and С3 glomerulopathy: resolving the confusion // Kidney International. - 2012. - V. 81, №5. - P. 434-141.]. С3НФ является аутоантителом, связывающимся с С3-конверазой альтернативного пути, при этом взаимодействии наблюдается значительное возрастание времени полураспада конвертазы C3bBb. Результатом этих процессов является полное потребление (гидролиз) компонента С3, приводящее к функциональному дефициту С3. В результате тяжелого дефицита С3 может возрастать риск развития бактериальной инфекции.

Атипический гемолитический уремический синдром (АГУС) является заболеванием, которое встречается у детей и характеризуется микроангиопатической гемолитической анемией, тромбоцитопенией и острой почечной недостаточностью в результате МПГН. В случае этих заболеваний нарушается активация комплемента вследствие мутации фактора Н, фактора I, МСР, или фактор Н связанных белков (ФНСБ) 1, 3 или 5, которые нарушают функционирование этих ингибиторов. Кроме того, имеет значение мутации С3 и фактора В, которые приводят к нарушению регуляции активации [Sartz L., Olin A.I., Kristoffersson А.С., and Stahl A.L. A novel C3 mutation causing increased formation of the C3 convertase in familial atypical hemolytic uremic syndrome // J. of Immunol. - 2012. - V. 188, №4. - P. 2030-2037].

В настоящее время не существует доступных тест-систем для определения функциональной активности С3-конвертазы альтернативного пути активации системы комплемента.

Из уровня техники и наиболее близким является способ определения активности С3-конвертазы (C3bBb) альтернативного пути комплемента, основанный на гемолизе эритроцитов кролика (Е_К) с использованием 2 разных сывороток в качестве источников компонентов комплемента: на первом этапе С3-конвертаза альтернативного пути активации системы комплемента (C3bBb) генерируется предварительно на поверхности эритроцитов кролика (Е_К) с использованием исследуемой (первой) сыворотки и специфических ингибиторов компонента С5 (OmCI, ингибитор С5, выделенный из клеща Ornitodorosmoubata и рекомбинантно продуцированный из Е. Coli [Nunn M.A., Sharma A., PaesenG.C, et al. Complement inhibitorof C5 activation from the softtick Ornitodorosmoubata // J. Immunol. - 2005. - V. 174. - P. 2084-2091] или eculizumab, моноклональные антитела к C5 [Kaplan M. Eculizumab (Alexion) // Curr.Opinlnvestig Drugs. - 2002. - V. 3. - P. 1017-1023] для предотвращения формирования мебрано-атакующего комплекса (C5b-9, МАК). После, эритроциты кролика с иммобилизованными комплексами С3-конвертазы осаждают центрифугированием, супернатант декантируют и преципитированные комплексы, E_KC3bBb, ресуспендируют в вероналовом буфере, содержащем ЭДТА и сыворотку морской свинки. Целью второй стадии теста является формирование МАК с использованием платформы конвертазы, образованной на первой стадии. После второй инкубации оставшиеся клетки осаждают центрифугированием, в супернатанте определяют выход гемоглобина спектрофотометрически при длине волны 405 нм. [Blom AM, Volokhina EV, Franson V, Stromberg P, et al. A novel method for direct measurement of complement convertases activity in human serum // Clinical and Experimental Immunology. - 2014. - V. 178. - P. 142-153].

Недостатком этого способа является длительность, трудоемкость, недостаточная точность в связи с тем, что используются две разные сыворотки, в которых присутствуют дополнительные ингибиторы или стабилизирующие С3-конвертазу аутоантитела к этим ингибиторам, а также потребность использования моноклональных антител (eculizumab) к компоненту С5 или специфических ингибиторов компонента С5 (OmCI).

Техническим результатом предлагаемого способа является повышение точности метода исследования функциональной активности С3-конвертазы альтернативного пути активации системы комплемента с использованием сыворотки крови только одного человека, а также адаптация метода для рутинных скрининг-исследований в условиях клинико-диагностических лабораторий практического здравоохранения.

Указанный результат достигается тем, что функциональную активности С3-конвертазы альтернативного пути системы комплемента определяют путем проведения реакции лизиса эритроцитов кролика сывороткой крови человека в условиях VBS-Mg²⁺-EGTA при температуре 37,0±0,5°С с последующим определением степени лизиса эритроцитов спектрофотометрически при длине волны 405 нм, отличающийся тем, что лизис эритроцитов кролика проводят 3,5% сывороткой крови человека в течение 10 мин, реакцию активации комплемента останавливают добавлением 100 мкл вероналового буфера, содержащего 10 мМ ЭДТА, в контрольную пробу сразу добавляют 2,4 мл охлажденного раствора 0,15 М NaCl, центрифугируют и определяют степень лизиса эритроцитов [У(контроль),%], опытную пробу повторно инкубируют в течение 30 мин при 37°С, определяют степень лизиса эритроцитов [У(опыт),%]. Функциональную активность С3-конвертазы определяют как разность между степенью лизиса эритроцитов в опытной и контрольной пробах. При разнице степени лизиса между опытной и контрольной пробами не более 15% принимают функциональную активность С3-конвертазы альтернативного пути комплемента в сыворотке крови обследуемого за нормальную величину.

Заявленное изобретение поясняется фиг. 1 на которой представлена активность альтернативного пути активации пулированной сыворотки крови человека в зависимости от концентрации.

Способ осуществляют следующим образом. Проводят забор крови, приготовление сыворотки, проведение гемолитического теста и расчет разности степени лизиса эритроцитов между опытной и контрольной пробами. Гемолитический тест проводят с использованием стандартизованных эритроцитов кролика (1,5×10⁸ кл/мл) (Е_К) в вероналовом солевом буфере (VBS), содержащем 7 мМ MgCl₂ и 10 мМ этиленгликольтетрауксусную кислоту (VBS-Mg²⁺-EGTA). Время проведения экспресс-способа 40 мин.

Титрование пулированной сыворотки крови человека на активность альтернативного пути активации системы комплемента. Предварительно от 5 до 30 мкл пулированной сыворотки крови от 10 здоровых доноров были разведены до конечного объема 300 мкл буфером VBS-Mg²⁺-EGTA. Затем 200 мкл стандартизированных эритроцитов кролика (1,5×10⁸ кл/мл) были добавлены и инкубированы в течение 30 мин при 37°С. После инкубации реакцию лизиса эритроцитов останавливали добавлением 2,5 мл холодного раствора 0,15М NaCl, центрифугировали 10 мин при 2500 об/мин для осаждения оставшихся Е_К и степень лизиса эритроцитов определяли по выходу гемоглобина в супернатант спектрофотометрически при длине волны 405 нм. В качестве контроля были использованы бланк (спонтанный лизис эритроцитов) (200 мкл Е_К + 300 мкл VBS-Mg-EGTA) и полный лизис эритроцитов (200 Е_К + 300 мкл H₂O). Степень лизиса эритроцитов (У) определяли по формуле:

У(%)=[(X-R)/(H-R)]×100,

где Н, R и X - величины оптической плотности А₄₀₅ супернатанта в гемолитических системах при полном лизисе эритроцитов, в контроле спонтанного лизиса Е_К и в опытной пробе соответственно. Полученные результаты представлены на фиг. 1. Как видно из фиг. 1, степень лизиса эритроцитов от 10 до 90% зависит линейно от концентрации сыворотки. Степень лизиса эритроцитов Е_К на уровне 50% наблюдается при концентрации сыворотки, равной 17,5 мкл в гемолитической системе, что составляет 3,5% сыворотки. Таким образом, для дальнейших исследований нами использовалась 3,5% концентрация сыворотки в тесте.

Определение гемолитической активности альтернативного пути активации системы комплемента в сыворотках крови беременных женщин. 200 мкл эритроцитов кролика (Е_К) (1,5×10⁸ кл/мл) инкубировали с 17,5 мкл сыворотки крови человека, в общем объеме 500 мкл, доведенном буфером VBS-Mg²⁺-EGTA (концентрация сыворотки 3,5%). Одновременно ставили контроль на спонтанный лизис эритроцитов Е_К (200 мкл Е_К + 300 мкл VBS-Mg²⁺-EGTA) и контроль на полный лизис эритроцитов (200 мкл Е_К + 300 мкл H₂O). Пробирки встряхивали и инкубировали 30 мин при 37°С. После инкубации в пробы добавляли по 2,5 мл холодного раствора 0,15 М NaCl, центрифугировали и определяли степень лизиса эритроцитов по величине А₄₀₅ супернатанта. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Как видно из данных, представленных в таблице 1, гемолитическая активность АПАК колебалась от 13% до 74%, что укладывается в калибровочный график (см. фиг. 1). По уровню активности АПАК тестированные пробы можно распределить на 3 группы: 1 группа - активность АПАК до 25% лизиса эритроцитов Е_К (8 проб, что составляет 36,4%)); 2 группа - от 26% до 40% лизиса эритроцитов (также 8 проб, 36,4%); 3 группа лизис эритроцитов от 41% и выше (6 проб, 27,2%).

Определение оптимальной концентрации вероналового буфера, содержащего 10 мМ ЭДТА (VBSE) для полного ингибирования системы комплемента по альтернативному пути. К 200 мкл суспензии эритроцитов кролика (ЕК) (1,5×10⁸ кл/мл) добавляли 17,5 мкл пулированной сыворотки крови человека от 10 здоровых доноров и 20-100 мкл VBSE (интервал концентрации 0,4-2,0 ммоль/л ЭДТА в системе), доводили объем до 500 мкл буфером VBS-Mg²⁺-EGTA и инкубировали 30 мин при 37°С. Одновременно ставили контроль на спонтанный (200 мкл Е_К + 200 мкл VBS-Mg²⁺-EGTA) и полный лизис эритроцитов Е_К (200 мкл Е_К + 200 мкл H₂O). После инкубации останавливали реакцию лизиса эритроцитов добавлением 2,5 мл охлажденного 0,15 М раствора NaCl, центрифугировали 10 мин. при 2500 об/мин и определяли степень лизиса эритроцитов по величине А₄₀₅ супернатанта, как описано выше.

Степень ингибирования альтернативного пути активации комплемента определяли как разность показателей лизиса эритроцитов контрольной пробе и в опытных пробах, содержащих возрастающие концентрации VBS-ЭДТА, по формуле:

СИ АПАК (%)=(100-У),

где 100 - степень лизиса эритроцитов в контрольной пробе, У - степень лизиса эритроцитов в опытных пробах. Полученные данные приведены ниже (таблица 2).

Как видно из данных, представленных в таблице 2, лизис эритроцитов кролика ингибируется дозозависимо при повышении концентрации ЭДТА в гемолитической системе. Таким образом, при концентрации ЭДТА в системе выше 1,4 мМоль/л наблюдается полное ингибирование гемолитической активности системы комплемента по альтернативному пути за счет хелатирования ионов магния.

Пример 1. Определение функциональной активности С3-конвертазы альтернативного пути системы комплемента. Определение ФА С3-конвертазы АПАК основано на том, что после 10 мин инкубации 200 мкл (1,5×10⁸ кл/мл) эритроцитов кролика с 17,5 мкл сыворотки крови человека в конечном объеме 500 мкл, доведенном буфером VBS-Mg²⁺-EGTA, реакцию активации комплемента останавливают добавлением 100 мкл вероналового буфера, содержащего 10 мМ ЭДТА (VBSE). В контрольную пробу сразу добавляют 2,4 мл охлажденного раствора 0,15 М NaCl, центрифугируют и определяют степень лизиса эритроцитов [У(контроль),%], как описано выше. Опытную пробу повторно инкубируют в течение 30 мин при 37°С. После инкубации определяют степень лизиса эритроцитов [У(опыт),%]. ФА С3-конвертазы АПАК определяют как разность между степенью лизиса эритроцитов в опытной и контрольной пробах. Проведены исследования ФА С3-конвертазы АПАК в сыворотке крови 20 здоровых доноров. Полученные результаты представлены в таблице 3.

Как видно из данных, представленных в таблице 3, во всех исследованных сыворотках ФА С3-конвертазы АПАК была не более 15% (колебания от 1 до 15%). Известно, что период полураспада С3-конвертазы составляет несколько минут, и при добавлении вероналового буфера, содержащего ЭДТА, при связывании ионов Mg²⁺ полностью ингибируется дальнейшая активация комплемента по всем трем путям. ФА С3-конвертазы на уровне 15% и ниже нами предварительно принято за нормальную величину.

Пример 2. Определение ФА С3-конвертазы АПАК в сыворотках крови беременных женщин. Предлагаемым способом были тестированы сыворотки крови 22 беременных женщин, пациентов отделения патологии. Полученные результаты представлены в таблице 4.

Определение ФА С3-конвертазы АПАК в этих же пробах показало, что только в 9 пробах (41%) данный показатель в пределах нормальных величин (до 15% лизиса эритроцитов Е_К), предварительно полученных в группе доноров (пример 1). В остальных 13 пробах ФА С3-конвертазы АПАК существенно различалась. В 6 пробах (27%) ФА С3-конвертазы АПАК варьировала от 16 до 28%), а в 7 пробах (32%) - лизис эритроцитов от 29% и выше.

Анализ полученных данных показывает, что скорость лимитирующей стадией активации альтернативного пути системы комплемента является функционирование С3-конвертазы, C3bBb. Только в одной пробе №19 высокая функциональная активность С3-конвертазы не дала повышенного лизиса эритроцитов по альтернативному пути (см. таблицу 1). Данный факт прямо свидетельствует о снижении уровня компонента С3, т.е. мы наблюдаем повышенное потребление за счет стабилизации С3-конвертазы. В остальных же пробах высокая ФА С3-конвертазы, возможно компенсируется повышенным синтезом компонента С3.

Таким образом, предлагаемый способ определения ФА С3-конвертазы АПАК по сравнению с известными имеет преимущества, которые заключаются в повышении точности диагностики нарушений иммунного статуса, упрощении, сокращении длительности процедуры исследования до 40 минут, удешевлении, возможности использования в рутинных исследованиях. Реализация изобретения позволит выявлять доклинические состояния вторичных иммунодефицитов, а также контролировать эффективность проводимого лечения.