Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ И ТЕСТ-СИСТЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ ИММУННЫХ КОМПЛЕКСОВ

Изобретение относится к клинической иммунологии, и может быть использовано для определения содержания циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови человека.

Проблема определения уровня ЦИК в сыворотке крови человека остается в настоящее время актуальной в связи с тем, что в лабораторной диагностике отсутствуют доступные, точные тест-системы для рутинных исследований, которые абсолютно необходимы для ранней диагностики аутоиммунных заболеваний на доклинической стадии.

Известен способ определения ЦИК в сыворотке крови преципитацией их 3,5% раствором полиэтиленгликоля (ПЭГ)-6000. Изменение мутности раствора регистрируют спектрофотометрически. Считается, что 3,5% ПЭГ-6000 флокулирует наиболее распространенные «промежуточные» иммунные комплексы [1].

Недостатком этого способа являются преципитация липопротеинов низкой и очень низкой плотности вместе с ЦИК, противоречивость результатов при тяжелых аутоиммунных заболеваниях, недостаточная точность.

Задачей изобретения является разработка способа и тест-системы определения уровня ЦИК для рутинных исследований с высокой точностью.

Эта задача решается тем, что специфическую преципитацию ЦИК сыворотки крови человека проводят путем обработки ее буферным раствором, содержащим ПЭГ-3350, инкубируют при комнатной температуре, преципитат осаждают центрифугированием, отмывают, растворяют в буфере и определяют содержание ЦИК либо спетрофотометрически при длинах волн 280 нм и 260 нм, рассчитывают по известной формуле, либо по методу Лоури. При уровне содержания ЦИК свыше 1,0 мг/мл констатируют повышенный уровень.

Тест-система содержит следующее:

1. Буфер для преципитации ЦИК, 10% полиэтиленгликоль с молекулярной массой 3350 в 0,01М Трис-HCl-буфере, рН 7,4, содержащем 0,15 М NaCl;

2. Буфер для растворения преципитата ЦИК, 0,01М Трис-HCl-буфер, рН 7,4, содержащий 0,15 М NaCl.

3. Калибровочный раствор, сывороточный альбумин человека с концентрацией 6 г/л в 0,01 М Трис-HCl-буфере, рН 7,4, содержащем 0,15 М NaCl.

Способ определения циркулирующих иммунных комплексов осуществляют следующим образом. Проводят забор крови натощак, готовят сыворотку и определяют уровень циркулирующих иммунных комплексов путем обработки сыворотки крови буфером для преципитации ЦИК в соотношении 1:1, инкубации при комнатной температуре в течение 10 мин, осаждения преципитата центрифугированием, отмывки, растворения в буфере для растворения преципитата ЦИК, уровень ЦИК определяют либо по оптической плотности при длинах волн 280 нм и 260 нм, либо по методу Лоури, и при содержании ЦИК свыше 1,0 мг/мл констатируют повышенный уровень.

Комплементсвязывающую способность ПЭГ-преципитата исследовали с помощью гемолитических тестов с использованием комплемента морской свинки, эритроцитов барана (1,5×10⁸ кл/мл), сенсибилизированных кроличьими антителами (ЕА), в вероналовом солевом буфере, содержащем 0,5 мМ MgCl₂ и 0,15 мМ CaCl₂ (VBS²⁺). Уровень содержания комплементсвязывающих ЦИК определяли по калибровочному графику, как описано в работе [2].

Этап 1. Определение оптимальной концентрации ПЭГ-3350 для осаждения иммунных комплексов из пулированной сыворотки крови здоровых доноров.

1.1. Приготовление преципитата сыворотки крови при различных концентрациях ПЭГ-3350. К 50 мкл пулированной сыворотки крови здоровых доноров добавляли от 25 до 200 мкл буфера, содержащего 10% ПЭГ (молекуляная масса 3350), тщательно перемешивали и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Образовавшийся преципитат осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 3000 об/мин. Супернатант декантировали, и осадок 2 раза отмывали буфером, содержащим 5% ПЭГ-3350. Осадок растворяли в исходном объеме 0,01 М трис-HCl-буфера, содержащего 0,15 М NaCl, рН 7,4.

1.2. Определение холестерина, триглицеридов и общих белков в ПЭГ-преципитатах, приготовленных при разных концентрациях ПЭГ-3350. В ПЭГ-преципитатах после двукратной отмывки и растворения в 50 мкл буфера определяли содержание холестерина, триглицеридов, общего белка с использованием наборов реагентов фирмы «Диакон-ДС» (Россия), а также содержание белка определяли в ПЭГ-преципитате спектрофотометрически при длинах волн 280 нм и 260 нм и рассчитывали по формуле: Концентрация белка (мг/мл)=1,55A₂₈₀-0,76А₂₆₀. Общий белок в ПЭГ-преципитате представляет собой циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК), включающие как комплементсвязывающие, так и не связывающие иммунные комплексы. Полученные результаты представлены в таблице 1.

1.3. Определение комплементсвязывающих циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК-1) в ПЭГ-преципитатах. К 10 мкл растворов ПЭГ-преципитатов, разбавленных в соотношении 1:99 буфером VBS²⁺, полученных при различных концентрациях ПЭГ 3350, добавляли 20 мкл раствора разбавленного 1:19 комплемента морской свинки. Общий объем доводили до 0,3 мл буфером VBS²⁺и инкубировали 20 мин при 37°С. После предварительной инкубации добавляли 200 мкл ЕА и повторно инкубировали 30 мин при 37°С. После 30-минутной инкубации реакцию останавливали добавлением 2,5 мл холодного раствора 0,15 М NaCl, центрифугировали и определяли величину лизиса эритроцитов по выходу гемоглобина в супернатант. Контрольная проба не содержала ПЭГ-преципитата. Пониженный гемолиз в опытных пробах по сравнению с контролем свидетельствовал о наличии связывания комплемента. Степень лизиса эритроцитов (У) определяли по формуле:

У(%)=[(X-R)/(H-R)×l00],

где Н, R и Х - величины оптической плотности А₄₁₂ в гемолитических системах контрольной пробы, в контроле спонтанного лизиса ЕА и в опытной пробе, соответственно. Степень связывания комплемента (ССК) определяли по формуле:

ССК(%)=100-У. Содержание ЦИК-1 в ПЭГ-преципитатах определены по калибровочному графику, как описано в работе [2], и представлены в таблице 1.

1.4. Определение ЦИК, не связывающих комплемент (ЦИК-2). ЦИК-2 рассчитывали как разность между общим белком ПЭГ-преципитата (ЦИК) и ЦИК-1. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Из данных, представленных в таблице 1, следует, что при концентрации ПЭГ-3350 до 5,0% в системе не наблюдается агрегация и преципитация липопротеинов низкой (ЛПНП) и очень низкой плотности (ЛПОНП). Показателями преципитации ЛПНП и ЛПОНП являются содержание холестерина и триглицеридов в ПЭГ-преципитате. Дальнейшее увеличение концентрации ПЭГ выше 5% в системе приводит к преципитации нативных ЛПНП и ЛПОНП.

Таким образом, при концентрации 5% ПЭГ-3350 из пулированной сыворотки контрольных доноров наблюдается избирательная преципитация циркулирующих иммунных комплексов и не наблюдается агрегация и преципитация нативных липопротеинов низкой плотности.

Этап 2. Определение оптимальной концентрации ПЭГ-3350 для осаждения иммунных комплексов из пулированной сыворотки крови больных ИБС.

2.1. Приготовление преципитата сыворотки крови при различных концентрациях ПЭГ-3350. К 50 мкл пулированной сыворотки крови больных ИБС добавляли от 25 до 200 мкл раствора 10% ПЭГ (молекуляная масса 3350), тщательно перемешивали и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Образовавшийся преципитат осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 3000 об/мин. Супернатант декантировали, и осадок 2 раза отмывали раствором ПЭГ-3350 с соответствующей концентрацией, при которой преципитат был получен. Осадок растворяли в исходном объеме 0,01 М трис-HCl-буфера, содержащего 0,15 М NaCl, рН 7,4.

2.2. Определение холестерина, триглицеридов и общих белков в ПЭГ-преципитатах, приготовленных при разных концентрациях ПЭГ-3350 проводили, как описано выше. Результаты представлены в таблице 2.

2.3. Определение комплементсвязывающих циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК-1) в ПЭГ-преципитатах из пулированной сыворотки больных ИБС проводили, как описано выше. Полученные результаты представлены в таблице 2.

2.4. Определение ЦИК, не связывающих комплемент (ЦИК-2). ЦИК-2 рассчитывали как разность между общим белком ПЭГ-преципитата (ЦИК) и ЦИК-1. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Из пулированной сыворотки больных ИБС при концентрации 5% ПЭГ-3350 начинают преципитировать модифицированные липопротеины плотности, обладающие комплементсвязывающими свойствами. Увеличение концентрации ПЭГ-3350 выше 5% приводит к преципитации нативных липопротеинов. Об этом свидетельствует стабильный уровень ЦИК при возрастании уровня холестерина и триглицеридов в преципитате. При концентрации 5% ПЭГ-3350 в системе эффективно также преципитируют циркулирующие иммунные комплексы, причем преимущественно не связывающие систему комплемента.

Таким образом, при концентрации 5% ПЭГ-3350 из пулированной сыворотки больных ИБС наблюдается избирательная преципитация циркулирующих иммунных комплексов и не наблюдается агрегация и преципитация нативных липопротеинов низкой и очень низкой плотности.

Этап 3. Определение содержания циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови доноров и больных ишемической болезнью сердца.

3.1. Приготовление преципитата сыворотки крови при условиях 5% ПЭГ-3350. К 50 мкл сыворотки крови больных ИБС и доноров добавляли 50 мкл буфера, содержащего 10% ПЭГ (молекуляная масса 3350) в 0,01М Трис-HCl-буфере, рН 7,4, содержащем 0,15М NaCl, тщательно перемешивали и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Образовавшийся преципитат осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 3000 об/мин. Супернатант декантировали, и осадок 2 раза отмывали буфером, содержащим 5% ПЭГ-3350. Осадок растворяли в исходном объеме 0,01 М трис-HCl-буфера, содержащего 0,15 М NaCl, рН 7,4.

3.2. Определение циркулирующих иммунных комплексов (общих белков) в 5% ПЭГ-преципитатах, приготовленных из сыворотки 15 больных ИБС и 15 здоровых доноров. В ПЭГ-преципитатах после двукратной отмывки и растворения в 50 мкл буфера определяли содержание общего белка с использованием набора «Общий белок» фирмы «Эколаб» (Россия), а также белок определяли в ПЭГ-преципитате спектрофотометрически при длинах волн 280 нм и 260 нм и рассчитывали по формуле. Общий белок в ПЭГ-преципитате представляет собой циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК), включающие как комплементсвязывающие, так и не связывающие иммунные комплексы. Полученные результаты представлены в таблице 3.

3.3. Определение комплементсвязывающих циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК-1) в ПЭГ-преципитатах. Комплементсвязывающие циркулирующие иммунные комплексы определяли в тесте связывания комплемента, как описано выше. Данные содержания ЦИК-1 представлены в таблице 3.

3.4. Определение ЦИК, не связывающих комплемент (ЦИК-2). ЦИК-2 рассчитывали как разность между общим белком ПЭГ-преципитата (ЦИК) и ЦИК-1. Полученные результаты представлены в таблице 3.

Как видно из таблицы 3, в группе доноров средний уровень ЦИК составил 0,80±0,12 (0,72±0,13) мг/мл, колебания составили от 0,53 до 1,04 мг/мл. Средний уровень ЦИК у больных ИБС равнялся 2,13±0,68 (2,14±0,76) мг/мл, колебания составили от 1,4 до 3,54 мг/мл.

Таким образом, способ позволяет повысить точность количественного определения циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови. Доступность реагентов и простота теста определения ЦИК в лабораторной практике позволит проводить углубленное исследование патогенеза хронических заболеваний, сопровождающихся накоплением ЦИК в органах и тканях, что приводит к системной и органной патологии. С другой стороны, реализация изобретения позволит контролировать эффективность проводимого лечения и выявлять доклинические состояния вторичных иммунодефицитов, аутоиммунных и опухолевых процессов.

Литература

1. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / Меньшиков В.В., Делеторская Л.Н., Золотницкая Р.П. и др./ Под ред. В.В.Меньшикова. - М.: Медицина, 1987 - 368 с.

2. Шойбонов Б.Б., Борголов В.М., Сониев В.М., Зинченко А.А., Федоров А.А., Петрова В.Д., Буянова С.Н. Способ определения циркулирующих иммунных комплексов // Патент РФ №2343484 от 10.01.2009 г.