Результат интеллектуальной деятельности: Способ выделения биологически активных проантоцианидинов

Изобретение относится к способам выделения биологически активных веществ из растительного сырья, конкретно для получения проантоцианидинов, обладающих различной биологической активностью, и может быть использовано в медицинской, косметической и пищевой промышленности.

Проантоцианидины, известные так же, как процианидины, олигомерные проантоцианидины, лейкоцианидины, лейкоантоцианидины и конденсированные танины принадлежат к семейству флавоноидов и представляют собой олигомеры флаван-3-олов и/или флаван-3,4-диолов. В порядке возрастания степени полимеризации проантоцианидины представляют собой мономеры (катехин, эпикатехин), а также их эфиры по положению 3, олигомеры со степенью полимеризации от двух до пяти и полимеры со степенью полимеризации более шести. Проантоцианидины могут содержать в среднем от двух до 30 флаваноидных мономеров, так называемых полигидроксифлаван-3-олов, которые включают катехин, эпикатехин, галлокатехин, эпигаллокатехин и им подобные, связанные интерфлаваноидными связями между C4 и C6 или между C4 и C8. Полимеры включают димеры, тримеры, тетрамеры, пентамеры, олигомеры и длинные полимеры из флавоноидных мономерных единиц до тех пор, пока эти полимеры проявляют указанную активность.

Известно большое количество растений, содержащих проантоцианидины, и любое из этих растений может быть использовано для их получения. Проантоцианидин-содержащие растения входят в класс Coniferiae, включая растения из разряда Coniferales из семейства Pinacea (включая сосны); члены семейства Filices (включая пальмы); однодольные растения, образующие класс Arecales, включая членов семейств Pandanales, Arales, Najadales, Restonales, Poales (включая зерновые, такие как сорго, ячмень и др.), Juncalaes, Cyperales (включая кипарис), Typhales, Zingiverales, Liliales (включая лилии); двудольные растения из отрядов Laurales (включая лавровый лист, корицу), Fagales (включая дуб), Casual-males, Dilleniales, Malviales (включая хлопок), Salicales, Ericales (включая клюкву, голубику, рододендрон), Ebenales, Resales (включая розы, боярышник, шиповник, черемуху, ежевику и другие аналогичные ягоды, яблоки, персики, сливы), Fabales (включая бобовые), Myrtales, Proteales, Rhamnales (включая виноград), Sapindales, Caprifoliaceae (включая калину, жимолость и другие аналогичные ягоды). В настоящее время в качестве растительного источника для получения проантоцианидинов используют, как правило, Caprifoliaceae, включающие виды Viburnum, Rosaceae и Vitaceae, которые включают виды Vitis и хвойные семейства Pinaceae, как содержащие наибольшее количество проантоцианидинов.

В основном олигомерные проантоцианидины применяют как природные антиоксиданты, обладающие широким спектром биологической активности. Они являются не только мощными антиоксидантами и ловушками свободных радикалов (US 4797421), но еще и обладают антибактериальной (US 6210681), противоопухолевой, антивоспалительной, антиаллергенной и сосудорасслабляющей активностью. Доказана противовирусная активность проантоцианидинов, выделенных из сабельника болотного Comarum palustre L. и туи западной Thuja occidentalis L. (Вестник ВГМУ 2015, т. 14, №2, с. 107-112). Проантоцианидины ингибируют процессы перекисного окисления липидов, агрегацию тромбоцитов, снижают хрупкость и проницаемость капилляров (US 6294190), а также влияют на активность ряда ферментных систем, способствуя предотвращению или уменьшению стресс-индуцированного повреждения желудка (US 6291517). Показано, что такими свойствами обладают как индивидуальные проантоцианидины, так и их смеси, а также экстракты их содержащие, при этом использование проантоцианидинов осуществляют в различной форме в виде фармацевтической композиции, пищевых добавок и пищевых продуктов, а также напитков.

Обычно получение проантоцианидинов основано на процессе их экстракции из растительного сырья, хотя возможно получение олигомерных проантоцианидинов и путем синтеза входящих в их состав органических соединений (RU 2281943). Экстракция проантоцианидинов из растительного материала проводится различными известными методами. Например, исходный растительный материал измельчается и экстрагируется растворителем, одним или несколькими. Гидрофильные или липофильные растворители могут быть использованы отдельно, последовательно или в комбинации. Предпочтительными из таких растворителей являются вода, спирты (этанол, метанол, изопропанол), кетоны (ацетон, метилэтилкетон) и эфиры (метилацетат и этилацетат). Температура экстракции в общем от 0 до 100°C, предпочтительнее от 10 до 55°C (СА 2302743, US 5912363, US 6440471, RU 2435579, RU 2375070).

Для выделения более узких фракций олигомерных проантоцианидинов используют метод флэш-хроматографии и ВЭЖХ (US 2006073220, JAgricFoodChem, 55(17), 2007, 6970) или, например, ультрафильтрацию через поры определенного размера (US 20150313267).

В работе Takeshita М. et al. (JBiolChem, 284(3.2), 2009, 21165-21176) на примере выделения проантоцианидинов из листьев голубики показано, что методом ВЭЖХ при трехкратной последовательной хроматографии можно добиться увеличения эффективности вытяжек проантоцианидинов.

Задачей данного изобретения является усовершенствование метода выделения определенных фракций проантоцианидинов, обладающих биологической активностью. Данная задача решена применением дополнительной экстракции спиртовой вытяжки помимо хлороформа так же этилацетатом и эфиром, и подбором элюента для хроматографировании на колонке с силикагелем с размером частиц 0,040-0,063 мм.

Пример 1.

В круглодонную колбу на 1 литр загружают 50 г сухих листьев голубики измельченных до размера частиц 1-3 мм, заливают 500 мл метанола и перемешивают при температуре 30-35°C в течение 3 часов. Отфильтровывают от осадка, маточник концентрируют на РВИ до объема 50 мл, и разбавляют 200 мл воды. Полученную суспензию экстрагируют последовательно 100 мл хлороформа, 50 мл этилового эфира и 50 мл этилацетата. Отделяют взвесь на центрифуге и маточник упаривают на РВИ. Получают 9.1 г коричневого осадка, который хроматографируют на колонке 300 г силикагеля с размером частиц 0,040-0,063 мм, например, выпускаемом фирмой Merck. Выбор данного сорбента объясняется как его высокими хроматографическими свойствами, так и экономичностью использования за счет возможности его эффективной регенерации. В качестве элюента используют смесь хлористого метилена с метанолом, взятых в соотношении 1:1 (схема).

Получают 4,53 г фракции с R_f 0,29 (пластинки Merck TLC Silica gel 60 F254, элюент хлористый метилен-метанол 1:1).

Выделенная фракция идентична по R_f биологически активной фракции LC3, полученной по методике из работы Takeshita М. et al. (JBiolChem, 284(32), 2009, 21165-21176).

Подтверждением того, что выделены именно проантоцианидины, является характерная для них реакция образования антоцианидинов. Нагревание проантоцианидинов в кислых растворах (этиловый спирт, содержащий 4-7% соляной кислоты) приводит к образованию цианидина, продельфинидины соответственно образуют дельфинидин (М.Н. Запрометов. Фенольные соединения. Распространение, метаболизм и функции в растениях. Москва. «Наука», 1993. - 272 с.).

Таким образом, предложенный способ выделения проантоцианидинов позволяет получать определенную биологически активную фракцию проантоцианидинов.