Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ХРОНИЧЕСКОЙ СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ ПУТЕМ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ УРОВНЕЙ МИКРОРНК

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано при диагностике хронической сердечной недостаточности (ХСН).

Несмотря на достигнутые успехи в изучении патогенеза и лечения хронической сердечной недостаточности (ХСН) прогноз при данном состоянии остается неблагоприятным и сопоставимым с таковым при различных злокачественных новообразованиях. Это связано с тем, что в последние годы не выявлены новые патогенетические схемы заболевания, являющиеся потенциальными терапевтическими мишенями.

Известен способ диагностики хронической сердечной недостаточности, включающий исследование образцов сыворотки или плазмы человека и приведения в контакт биологического образца с антителом к проBNP(1-108), детектирование проBNP(1-108) в образце и корреляцию между количеством обнаруженных комплексов антиген-антитело с клиническим состоянием субъекта.

(Патент РФ №2315773, МПК С07K 16/26, опубл. 27.01.2008 г.)

Недостатки данного способа связаны с тем, что имеется ряд других состояний, при которых повышается содержание данного вещества. Сюда относятся беременность, хроническая почечная недостаточность, тромбоэмболические осложнения. Соответственно, проведение точной дифференциальной диагностики в связи с этим затруднено. Кроме того, у ряда категорий больных, в частности у пожилых, пациентов с избыточной массой тела, содержание проBNP не увеличивается даже в случае клинически значимой хронической сердечной недостаточности.

Задачей изобретения является создание достоверного способа диагностики хронической сердечной недостаточности путем использования циркулирующих уровней микроРНК, позволяющего осуществлять раннюю диагностику ХСН и проводить контроль эффективности лечения данного заболевания.

Технический результат заключается в повышении достоверности способа и возможности проведения диагностики ХСН на ранних стадиях заболевания.

Это достигается тем, что в заявляемом способе диагностики хронической сердечной недостаточности, включающем исследование биологического образца человека, согласно изобретению, в крови человека методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации определяют циркулирующие уровни микроРНК и при концентрации микроРНК-423-5р более 35500 копий/мкл устанавливают хроническую сердечную недостаточность.

В последние годы активно изучается возможность воздействия на основные процессы регуляции внутриклеточной транскрипции, проявляющиеся в изменении процессов метаболизма и фиброза. Эти процессы закономерно меняются в процессе формирования хронической сердечной недостаточности и зависят как от стадии, так и от этиологии.

Несмотря на то, что эти процессы являются сложными, комплексными и мультимодальными, имеется возможность разновекторного влияния на них, модулируя эпигенетическую активность. Это связано с наличием систем, регулирующих данные внутриклеточные процессы на верхнем (корневом) уровне. К числу таких систем относятся микро-РНК.

МикроРНК представляют собой большое количество различных видов одноцепочечных молекул РНК, вовлеченных в процессы эпигенетической регуляции синтеза большого количества различных белков, ферментов, структурных и регуляторных молекул, а также посттранскрипционного подавления активности генов.

Перспективы использования микроРНК в диагностике сердечнососудистых заболеваний прежде всего связаны с недавним обнаружением нового класса РНК - циркулирующих микроРНК. Хотя до недавнего времени считалось, что время жизни молекул РНК вне клеток очень коротко, введение новых более чувствительных методов позволило обнаружить постоянно присутствующий в крови и физиологических жидкостях класс микроРНК. Устойчивость микроРНК к эндонуклеазам объясняется формированием надмолекулярных комплексов с белковыми молекулами, а также инкапсуляцией микроРНК в липидный слой с образованием наноструктурных комплексов, называемых экзосомами.

Осуществление способа

Образцы цельной крови собирают в пробирки, содержащие ЭДТА, и центрифугируют при 3000 g в течение 5 минут. Выделение общей РНК (длина цепи менее 1000 н.п.) производят методом адсорбционной колоночной хроматографии на смоле из 200 мкл плазмы крови. Затем осуществляют реакцию обратной транскрипции и синтеза первой цепи кДНК. Для определения уровней 5 исследуемых индивидуальных микроРНК 423-5р используют химические модификации LNA специфических праймеров и анализируют методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации «в режиме реального времени». Данные по экспрессии микроРНК нормализуют на исходный объем цельной крови.

При концентрации микроРНК-423-5р более 35500 копий/мкл устанавливают хроническую сердечную недостаточность.

Пример 1

Мужчина 62 года, в анамнезе длительно протекающая артериальная гипертония. Сочетанные заболевания - сахарный диабет, ожирение. Жалобы на одышку, снижение толерантности к физической нагрузке. На ЭхоКГ признаки диастолической дисфункции. МНП 90 пг/мл. Определение возможной сердечной недостаточности, как причины данной симптоматики, произведено согласно заявляемому способу. Концентрация микроРНК-423-5р составила 62400 копий/мкл, что превышает пороговое значение 35500 копий/мкл. В связи с этим выставлен диагноз хронической сердечной недостаточности. Назначенная терапия позволила добиться значимого улучшения клинической симптоматики.

Пример 2

Женщина 69 лет с длительным анамнезом артериальной гипертонии и курения. Сочетанное заболевание - хроническая обструктивная болезнь легких. Жалобы на одышку. Для определения возможной сердечной недостаточности как причины данной симптоматики и решения вопроса о тактике лечения определены циркулирующие уровни, согласно заявляемому способу. Концентрация микроРНК-423-5р составила 2726 копий/мкл, что меньше порогового значения 35500 копий/мкл. В связи с этим диагноз хронической сердечной недостаточности отвергнут. Назначена терапия хронической обструктивной болезни легких, на фоне которой наблюдается улучшение самочувствия

В исследование было включено 100 человек: из которых 56 больных с клинически и инструментально подтвержденной ХСН и 44 составили контрольную группу, среди которых 15 (34%) имели ранее установленное ССЗ без СН и 29 (66%) практически здоровые добровольцы. Средний возраст больных ХСН составил 59,4±11,4 и колебался от 25 до 78 лет, 40,5±17,5 лет было добровольцам. Критериями отбора пациентов, включенных в первую группу, являлись: наличие систолической ХСН (со снижением ФВ менее 40%), ХСН с сохраненной фракцией выброса ЛЖ, независимо от факта компенсации/декомпенсации на момент включения. В последнем случае для подтверждения диагноза требовалось наличие в анамнезе либо на момент включения декомпенсации СН, или превышение диагностического уровня BNP.

Основными причинами развития ХСН послужили ИБС: Постинфарктный кардиосклероз (ИБС:ПИКС) 45,5%, дилатационная кардиомиопатия (ДКМП) 18,2%, гипертоническое сердце (ГС) 14,5% и воспалительная кардиомиопатия (ВКМП) 10,9%. Небольшой процент составили пациенты с ХСН на фоне клапанного порока и тиреотоксического сердца. Тяжесть ХСН оценивалась по классификации Нью-Йоркской Ассоциации сердца (NYHA, 1964 г) и варьировала от I до IV ФК. Все пациенты получали базисную терапию в соответствии со стандартами лечения (иАПФ или АРА, β-блокаторы, антагонисты минералокортикоидных рецепторов, диуретики - по показаниям). Критериями исключения являлась СН, обусловленная ОКС, изолированная правожелудочковая недостаточность на фоне ТЭЛА. Измерение фракции выброса левого желудочка (ФВ ЛЖ), конечно-диастолического размера ЛЖ и концентрации BNP проводились только для больных ХСН.

Проводилась оценка профиля экспрессии циркулирующих микроРНК. Статистическая обработка данных исследования была проведена с помощью программного обеспечения SPSS 17.0, Microsoft Excel 2010.

Результаты

МикроРНК-423-5р была достоверно повышена у больных ХСН по сравнению с контрольной группой в 2,5 раза (р=0,003).

Расхождение кривых Капалана-Мейера при сравнении кумулятивной доли пациентов в зависимости от концентрации микроРНК-423-5р и наличия ХСН было статистически значимым как при интервальной оценке по доверительным интервалам, так и по критерию раннего расхождения Бреслау (р=0,002) и по критерию позднего расхождения Лог-Ранка.

Диагностическую значимость микроРНК-423-5р оценивали с помощью ROC-анализа. Площадь под кривой AUC составила 0,674 (ДИ 95% 0,566-0,783, р=0,003).

Пороговое значение концентрации микроРНК-423-5р по наличию ХСН в соответствии с графиком и таблицей ROC-анализа по точке с наибольшей чувствительностью и специфичностью составило 35500 копий/мкл. Чувствительность данного порогового значения составила 78,6% (95% ДИ 70,6-86,5%), специфичность 63,6% (95% ДИ 55,4-71,9%), прогностическая ценность положительного результата 73,3% (95% ДИ 64,8-81,9%)), прогностическая ценность отрицательного результата 70% (95%) ДИ 61,1-78,9%), индекс точности 72% (63,3-80,7%)). Отношение правдоподобий, оценивающее насколько вероятность наличия ХСН превышает вероятность отсутствия ХСН при концентрации микроРНК-423-5р выше или равное 35500 копий/мкл, составило 6,417 (95% ДИ 2,646-15,561).

Таким образом, заявляемый способ позволит с высокой достоверностью провести раннюю диагностику ХСН, а также контроль эффективности лечения.