МИКРООРГАНИЗМ, ОБЛАДАЮЩИЙ УЛУЧШЕННОЙ СПОСОБНОСТЬЮ К ПРОДУЦИРОВАНИЮ L-ЛИЗИНА, И СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА L-ЛИЗИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДАННОГО МИКРООРГАНИЗМА

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к микроорганизму, обладающему повышенной способностью продуцировать L-лизин, и к способу производства L-лизина с использованием данного микроорганизма.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

L-лизин используют в производстве кормов для животных, лекарственных средств и косметических товаров для человека, и его получают ферментацией с использованием микроорганизмов рода Corynebacterium или рода Escherichia. В последние годы были проведены исследования для создания высокоэффективных штаммов-продуцентов и методов ферментации.

Было проведено множество исследований с целью контролирования пенообразования в процессе ферментации дрожжей, которые используют в производстве пива и вина, и в недавних исследованиях были идентифицированы гены (AWA1, FPG1 и CFG1), влияющие на пенообразование (Shimoi H. et al., 2002, Appl. Environ. Microbiol. 68: 2018-25; Blasco L. et al., Yeast. 2011, 28: 437-51; Blasco L. et al., J. Agric. Food Chem. 2012, 60: 10796-07). В данных исследованиях было установлено, что при использовании штамма, в котором эти гены инактивированы, пенообразование значительно уменьшается по сравнению с использованием исходного штамма, в то время как при использовании штамма, избыточно экспрессирующего данные гены, пенообразование увеличивается.

Пенообразование при культивировании дрожжей включает ряд следующих процессов. Во-первых, маннопротеин смешивается с мелкими пузырьками газа, возникающими в процессе ферментации. В это время пузырьки газа изнутри становятся гидрофобными, а снаружи пузырьки газа становятся гидрофильными. Вследствие этого, вязкость культуральной среды увеличивается, так что не только различные белки, но и клетки смешиваются, что приводит к образованию пены (Swart C. W. et al., FEMS Yeast Res. 2012, 12: 867-69).

При производстве пива с использованием дрожжей соответствующая степень пенообразования необходима, однако при ферментации микроорганизмов, используемых для производства больших количеств полезных продуктов, таких как аминокислоты, пенообразование следует подавлять. Если при культивировании образуется избыточное количество пены, вязкость культуральной среды будет увеличиваться и, следовательно, скорость переноса кислорода (СПК) в культуральной среде будет снижаться, и в серьезных случаях будет происходить лизис клеток. Использование большого количества антивспенивателя для подавления пенообразования может увеличивать производственные затраты в промышленных условиях и может оказывать неблагоприятный эффект на рост клеток.

Соответственно, авторы настоящего изобретения провели скрининг генов микроорганизмов рода Corynebacterium, связанных с повышенным пенообразованием, и обнаружили, что при инактивации таких генов пенообразование эффективно контролируется, так что способность к продуцированию L-лизина у штамма возрастает, что и составило настоящее изобретение.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническая задача

Целью настоящего изобретения является предоставление микроорганизма рода Corynebacterium, обладающего повышенной способностью к продуцированию L-лизина.

Другой целью настоящего изобретения является предложение способа производства L-лизина с использованием микроорганизма рода Corynebacterium.

Техническое решение

Для достижения вышеуказанных целей в одном аспекте нестоящего изобретения предложен микроорганизм рода Corynebacterium, в котором инактивирован по меньшей мере один секреторный белок, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NOs: 1, 7 и 13.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу производства L-лизина путем культивирования микроорганизма рода Corynebacterium.

Полезные эффекты

Микроорганизм по настоящему изобретению представляет собой микроорганизм, в котором секреторные белки, вовлеченные в пенообразование, инактивированы, так что способность данного штамма к продуцированию L-лизина возрастает. При использовании данного штамма пенообразование уменьшается, его можно культивировать без необходимости увеличения или без необходимости добавления большого количества антивспенивателя, и при этом способность штамма к продуцированию L-лизина может возрастать. Кроме того, в условиях промышленного производства могут быть достигнуты такие эффекты, как упрощение производственного процесса и снижение производственных затрат, а также эффективное производство L-лизина.

Способ по изобретению

Далее настоящее изобретение описано более подробно.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к микроорганизму рода Corynebacterium, в котором инактивирован по меньшей мере один секреторный белок, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NOs: 1, 7 и 13. Если при массовом культивировании микроорганизмов с целью производства L-лизина образуется избыточное количество пены, вязкость культуральной среды будет увеличиваться, так что скорость переноса кислорода (СПК) в культуральной среде будет снижаться, и в серьезных случаях также будет происходить лизис клеток. Иными словами, считалось, что инактивация секреторных белков, являющихся причиной пенообразования, с целью контроля пенообразования будет оказывать благоприятный эффект на производство лизина.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения для усовершенствования процесса ферментации при производстве L-лизина и для проведения скрининга основных секреторных белков, являющихся причиной пенообразования, которые не важны для продуцирования лизина, проводили культивирование Corynebacterium glutamicum KCCM11016P (данный микроорганизм был описан как KFCC10881 и повторно депонирован в Международном органе по депонированию в соответствии с Будапештским договором под учетным № KCCM11016P; корейский патент № 10-0159812) и затем выделяли пену, образующуюся в процессе ферментации, получая пептиды. Полученные пептиды анализировали и выбирали три белка, обнаруженные в наибольших количествах, таким образом, отбирая пептиды, кодируемые генами с учетными номерами NCBI NCgl0336, NCgl0717 и NCgl2912 для Corynebacterium glutamicum ATCC13032.

В настоящем изобретении пептид, кодируемый геном NCgl0336, представляет собой эстеразу, эндогенно существующую в Corynebacterium glutamicum. В частности, пептид может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и белок с аминокислотной последовательностью, имеющей гомологию по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, особенно предпочтительно по меньшей мере 97% с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, также охвачен понятием «секреторный белок по настоящему изобретению» при условии, что он представляет собой белок, имеющий эстеразную активность. Однако секреторный белок, используемый по настоящему изобретению, не ограничивается ими, поскольку аминокислотная последовательность белка, проявляющего эстеразную активность, может отличаться в зависимости от вида или штамма микроорганизмов. Кроме того, очевидно, что белок с аминокислотной последовательностью, содержащей делецию, модификацию, замену или делецию одной или нескольких аминокислот в одном или более положениях аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, также входит в объем настоящего изобретения при условии, что он обладает последовательностью, имеющей гомологию с последовательностью SEQ ID NO: 1, и обладает биологической активностью, практически равной или сходной с активностью белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.

В настоящем изобретении ген NCgl0336 имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, и нуклеотидная последовательность, имеющая гомологию по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно 95%, особенно предпочтительно 97% с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2, также входит в объем настоящего изобретения. Кроме того, варианты последовательности, которые кодируют ту же аминокислоту вследствие вырожденности генетического кода, также входят в объем настоящего изобретения. Более того, полинуклеотид, кодирующий NCgl0336 по настоящему изобретению, может представлять собой вариант, кодирующий NCgl0336, который может гибридизоваться с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2 или зондом, полученным из нуклеотидной последовательности, в строгих условиях и который нормально функционирует.

В настоящем изобретении пептид, кодируемый геном NCgl0717, представляет собой эстеразу, эндогенно существующую в Corynebacterium glutamicum. В частности, пептид может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и белок с аминокислотной последовательностью, имеющей гомологию по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, особенно предпочтительно по меньшей мере 97% с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7, также охвачен понятием «секреторный белок по настоящему изобретению» при условии, что он представляет собой белок, имеющий эстеразную активность. Однако секреторный белок, используемый по настоящему изобретению, не ограничивается ими, поскольку аминокислотная последовательность белка, проявляющего эстеразную активность, может отличаться в зависимости от вида или штамма микроорганизмов. Кроме того, очевидно, что белок с аминокислотной последовательностью, содержащей делецию, модификацию, замену или делецию одной или нескольких аминокислот в одном или более положениях аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, также входит в объем настоящего изобретения при условии, что он обладает последовательностью, имеющей гомологию с последовательностью SEQ ID NO: 7, и обладает биологической активностью, практически равной или сходной с активностью белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7.

В настоящем изобретении ген NCgl0717 имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 8, и нуклеотидная последовательность, имеющая гомологию по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно 95%, особенно предпочтительно 97% с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 8, также входит в объем настоящего изобретения. Кроме того, варианты последовательности, которые кодируют ту же аминокислоту вследствие вырожденности генетического кода, также входят в объем настоящего изобретения. Более того, полинуклеотид, кодирующий NCgl0717 по настоящему изобретению, может представлять собой вариант, кодирующий NCgl0717, который может гибридизоваться с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 8 или зондом, полученным из нуклеотидной последовательности, в строгих условиях и который нормально функционирует.

В настоящем изобретении пептид, кодируемый геном NCgl2912, представляет собой эстеразу, эндогенно существующую в Corynebacterium glutamicum. В частности, пептид может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и белок с аминокислотной последовательностью, имеющей гомологию по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, особенно предпочтительно по меньшей мере 97% с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 13, также охвачен понятием «секреторный белок по настоящему изобретению» при условии, что он представляет собой белок, имеющий эстеразную активность. Однако секреторный белок, используемый по настоящему изобретению, не ограничивается ими, поскольку аминокислотная последовательность белка, проявляющего эстеразную активность, может отличаться в зависимости от вида или штамма микроорганизмов. Кроме того, очевидно, что белок с аминокислотной последовательностью, содержащей делецию, модификацию, замену или делецию одной или нескольких аминокислот в одном или более положениях аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13, также входит в объем настоящего изобретения при условии, что он обладает последовательностью, имеющей гомологию с последовательностью SEQ ID NO: 13, и обладает биологической активностью, практически равной или сходной с активностью белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13.

В настоящем изобретении ген NCgl2912 имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 14, и нуклеотидная последовательность, имеющая гомологию по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно 95%, особенно предпочтительно 97% с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 14, также входит в объем настоящего изобретения. Кроме того, варианты последовательности, которые кодируют ту же аминокислоту вследствие вырожденности генетического кода, также входят в объем настоящего изобретения. Более того, полинуклеотид, кодирующий NCgl2912 по настоящему изобретению, может представлять собой вариант, кодирующий NCgl2912, который может гибридизоваться с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 14 или зондом, полученным из нуклеотидной последовательности, в строгих условиях и который нормально функционирует.

Используемый в настоящем документе термин «гомология» означает идентичность с конкретной аминокислотной последовательностью или нуклеотидной последовательностью, и она может быть выражена в процентах. В спецификации гомологичная последовательность, имеющая активность, равную или аналогичную активности конкретной аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности, характеризуется «% гомологии». Гомологию аминокислотной последовательности можно определять с использованием, например, алгоритма BLAST (смотри Karlin and Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)) или FASTA, описанного Pearson (смотри Methods Enzymol., 183, 63 (1990)). Программы, называемые BLASTN и BLASTX, были разработаны на основе данного алгоритма BLAST (смотри www.ncbi.nlm.nih.gov).

Используемый в настоящем документе термин «строгие условия» означает условия, допускающие специфическую гибридизацию между полинуклеотидами. Например, такие строгие условия описаны подробно в сборниках J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2е издание, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York.

Описанную в настоящем документе «инактивацию» можно осуществлять любыми способами инактивации, известными в данной области. В настоящем документе «инактивация» означает, что экспрессия эндогенного гена снижена по сравнению с экспрессией в штамме дикого типа или ген не экспрессируется, либо ген неактивен или имеет сниженную активность, даже если он экспрессируется. Инактивацию можно осуществлять за счет мутации всей или части нуклеотидной последовательности, либо всей или части последовательности, регулирующей ее экспрессию, путем делеции, замены, вставки или их сочетания.

В качестве конкретного примера, микроорганизм с инактивированным эндогенным геном можно получать путем трансформации микроорганизма рода Corynebacterium рекомбинантным вектором, содержащим фрагмент гена, полученный в результате удаления открытой рамки считывания эндогенного гена, тем самым внося делецию или мутацию в эндогенный ген. Вставку гена в хромосому можно осуществлять любым способом, известным в данной области.

Используемый в настоящем документе термин «эндогенные» фермент и активность относится к ферменту, исходно присутствующему в микроорганизме или клетке, и к активности данного фермента. А именно, термин означает фермент и его активность до того, как фермент и активность были модифицированы.

Используемый в настоящем документе термин «рекомбинантный вектор» означает конструкт ДНК, содержащий нуклеотидную последовательность гена, кодирующего целевой белок, функционально связанную с соответствующей регуляторной последовательностью таким образом, чтобы была возможной экспрессия целевого гена в соответствующей клетке-хозяине. Регуляторная последовательность включает промотор, способный инициировать транскрипцию, любой оператор для регуляции этой транскрипции, последовательность, кодирующую соответствующий сайт связывания рибосомы на мРНК, и последовательность для регулирования терминации транскрипции и трансляции. После введения трансформацией в соответствующего хозяина вектор может реплицироваться или функционировать независимо от генома хозяина, или сам может встраиваться в геном. Вектор, используемый по настоящему изобретению, не имеет конкретных ограничений и может быть любым вектором, известным в данной области, при условии, что он способен реплицироваться в хозяине.

Примеры вектора, используемого в конструировании рекомбинантного вектора, включают природные или рекомбинантные плазмиды, космиды, вирусы и бактериофаги. Например, фаговый вектор или космидный вектор, используемый по настоящему изобретению, может представлять собой pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, Charon21A или тому подобное, и плазмидный вектор, используемый по настоящему изобретению, может быть pDZ типа, pBR типа, pUC типа, pBluescriptII типа, pGEM типа, pTZ типа, pCL типа, pET типа или тому подобным. Вектор, который можно использовать по настоящему изобретению, не имеет конкретных ограничений, и любой известный экспрессионный вектор можно использовать по настоящему изобретению.

Используемый в настоящем документе термин «трансформация» означает введение вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий целевой белок, в клетку-хозяина для создания возможности экспрессии белка, кодируемого полинуклеотидом, в клетке-хозяине. Введенный полинуклеотид может быть вставлен и расположен в хромосоме клетки-хозяина или расположен вне хромосомы при условии, что он может быть экспрессирован в клетке-хозяине. Кроме того, полинуклеотиды включают ДНК и РНК, которые кодируют целевой белок. При условии, что полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина и экспрессирован в ней, он может быть введен в любой форме. Например, полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в форме экспрессионной кассеты, которая представляет собой полинуклеотидный конструкт, содержащий все элементы, необходимые для самоэкспрессии. Экспрессионная кассета, как правило, содержит промотор, который функционально связан с открытой рамкой считывания (далее в настоящем документе сокращенно называемой «ОРС») гена, сигнал терминации транскрипции, сайт связывания рибосомы и сигнал терминации трансляции. Экспрессионная кассета может быть в форме самореплицирующегося экспрессионного вектора. Кроме того, полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина сам по себе и быть функционально связан с последовательностью, необходимой для экспрессии в клетке-хозяине.

В качестве исходного штамма, в который будет введен рекомбинантный вектор, можно использовать любой микроорганизм, обладающий способностью к продуцированию L-лизина, без ограничений. В частности, можно использовать микроорганизм рода Corynebacterium или рода Brevibacterium. Более конкретно, можно использовать микроорганизм Corynebacterium glutamicum.

Используемое в настоящем документе выражение «микроорганизм, обладающий способностью к продуцированию L-лизина» относится к микроорганизму, полученному путем манипуляций, как правило, с известным геном для того, чтобы сделать возможным продуцирование L-лизина. Например, микроорганизм может представлять собой микроорганизм, полученный либо путем вставки одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из aspB (ген, кодирующий аспартат-аминотрансферазу), lysC (ген, кодирующий аспартат-киназу), asd (ген, кодирующий аспартат-полуальдегид-дегидрогеназу), dapA (ген, кодирующий дигидродипиколинат-синтазу), dapB (ген, кодирующий дигидродипиколинат-редуктазу) и lysA (ген, кодирующий диаминопимелат-декарбоксилазу), которые являются эндогенными в микроорганизме рода Corynebacterium и участвуют в продуцировании L-аминокислот, либо путем воздействия на ауксотрофный по L-лейцину мутантный штамм N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидином (NTG).

Более конкретно, микроорганизмы рода Corynebacterium, используемые по настоящему изобретению, представляют собой Corynebacterium glutamicum KCCM11016P (данный микроорганизм был описан как KFCC10881 и повторно депонирован в Международном органе по депонированию в соответствии с Будапештским договором под учетным № KCCM11016P; корейский патент № 10-0159812), Corynebacterium glutamicum KCCM10770P (корейский патент № 10-0924065), Corynebacterium glutamicum L-лизин-продуцирующий штамм KCCM11347P (данный микроорганизм был описан как KFCC10750 и повторно депонирован в Международном органе по депонированию в соответствии с Будапештским договором под учетным № KCCM11347P; корейский патент № 10-0073610) и Corynebacterium glutamicum штамм CJ3P (Binder et al., Genome Biology 2012, 13: R40), но не ограничиваются ими.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения микроорганизм, трансформированный в соответствии с настоящим изобретением, может представлять собой Corynebacterium glutamicum KCCM11502P, KCCM11481P или KCCM11482P.

В другом аспекте настоящее изобретение также относится к способу производства L-лизина с использованием трансформированного микроорганизма. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу производства L-лизина, включающему этапы: культивирования микроорганизма по настоящему изобретению для продуцирования L-лизина в культуре или клетке микроорганизма; и извлечения L-лизина из культуральной среды.

В способе по настоящему изобретению культивирование микроорганизма рода Corynebacterium можно проводить с использованием любых условий культивирования и метода культивирования, которые известны в данной области.

Например, среда, которую можно использовать для культивирования микроорганизма рода Corynebacterium, описана в сборнике Manual of Methods for General Bacteriology, выпущенном Американским обществом бактериологов (Washington D.C., USA, 1981).

Источники сахаров, которые можно использовать в среде, включают сахара и углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, крахмал или целлюлоза; масла и жиры, такие как соевое масло, подсолнечное масло, касторовое масло или кокосовое масло; жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота или линолевая кислота; спирты, такие как глицерин или этанол, а также органические кислоты, такие как уксусная кислота. Эти вещества можно использовать отдельно или в смеси.

Источники азота, которые можно использовать, включают соединения, содержащие органический азот, такие как пептон, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, солодовый экстракт, кукурузный экстракт, соевая мука и мочевина, или неорганические соединения, такие как сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония. Источники азота также можно использовать отдельно или в виде смеси.

Источники фосфора, которые можно использовать, включают дигидрофосфат калия или гидрофосфат дикалия, либо соответствующие соли натрия. Кроме того, культуральная среда должна содержать соли металлов, такие как сульфат магния или сульфат железа, которые необходимы для роста. И наконец, в дополнение к вышеуказанным веществам можно использовать такие необходимые для роста вещества, как аминокислоты и витамины. Более того, в культуральную среду можно добавлять соответствующие предшественники. Указанные вещества можно добавлять в культуру отдельными порциями или непрерывно в процессе культивирования, используя подходящий метод.

pH культуры можно контролировать соответствующим образом, используя щелочные соединения, такие как гидроксид натрия, гидроксид калия, аммиак или водный раствор аммиака, либо кислые соединения, такие как фосфорная кислота или серная кислота. Пенообразование можно контролировать с помощью антивспенивателей, таких как сложные эфиры жирных кислот и полигликолей. Аэробные условия поддерживают за счет подачи в культуру кислорода или кислородсодержащих газовых смесей (например, воздуха). Температура культуры, как правило, составляет от 20°C до 45°C, предпочтительно от 25°C до 40°C. Культивирование можно продолжать до того, как будет произведено нужное количество L-лизина. В частности, время культивирования составляет 10-160 часов.

В способе по настоящему изобретению культивирование можно выполнять непрерывным или периодическим методом, либо путем периодической подпитки или повторяющейся периодической подпитки культуры. Такое культивирование можно осуществлять любым методом, хорошо известным в данной области.

Далее настоящее изобретение описано более подробно со ссылкой на примеры. Однако следует понимать, что эти примеры предназначены исключительно для иллюстративных целей и не должны ограничивать объем настоящего изобретения.

Примеры

Пример 1: Скрининг секреторных белков, связанных с пенообразованием в процессе культивирования

В данном примере для скрининга секреторных белков, являющихся причиной пенообразования, проводили эксперимент следующим образом.

Во-первых, Corynebacterium glutamicum KCCM11016P (данный микроорганизм был описан как KFCC10881 и повторно депонирован в Международном органе по депонированию в соответствии с Будапештским договором под учетным № KCCM11016P; корейский патент № 10-0159812) культивировали, используя 1-л ферментер, и затем только пену, образовавшуюся в процессе ферментации, выделяли и концентрировали в 15-мл пробирке.

Для идентификации белков, содержащихся в концентрированном образце пены, соответствующее количество красителя-«свидетеля», содержащего сурфактант, добавляли к образцу, который затем подвергали электрофорезу в 8% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. После электрофореза полиакриламидный гель с додецилсульфатом натрия окрашивали красителем Кумасси голубым. Затем окрашенные полосы белка вырезали, проводили расщепление трипсином для получения пептидов и аминокислотные последовательности полученных пептидов анализировали методом ЖХ-МС/МС.

Анализируемые пептиды идентифицировали путем поиска генов микроорганизма рода Corynebacterium, используя исследовательский алгоритм Blast, предоставленный Национальным центром биотехнологической информации (NCBI). Среди идентифицированных пептидов были выбраны три белка, обнаруженные в наибольших количествах, и в конечном итоге были выбраны гены, кодирующие данные белки. Выбранные гены имели учетные номера NCBI NCgl0336, NCgl0717 и NCgl2912.

Пример 2: Конструирование рекомбинантной плазмиды для инактивации гена секреторного белка NCgl0336

Для конструирования рекомбинантной плазмиды, способной инактивировать ген NCgl0336 на хромосоме Corynebacterium, получали аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 1) и нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 2) NCgl0336 на основании нуклеотидной последовательности, депонированной в Genbank NIH. Для получения фрагмента гена путем удаления открытой рамки считывания NCgl0336 были сконструированы праймеры SEQ ID NOs: 3-6, исходя из последовательности SEQ ID NO: 2.

SEQ ID NO. 3: 5'-atcctctagagtcgacGAAGCCTCTGCACCTCGCTG-3';

SEQ ID NO. 4: 5'-TATAGTTCGGTTCCGCGTCTCCAACGCATCCGGCC-3';

SEQ ID NO. 5: 5'-CGGAACCGAACTATACCACCGAGGGACGCATTCTC-3';

SEQ ID NO. 6: 5'-atgcctgcaggtcgacGCTCAAACGCACGAGCGAAG-3'.

Используя геномную ДНК Corynebacterium glutamicum в качестве матрицы, проводили ПЦР с использованием набора праймеров SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, и набора праймеров SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6 [Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories]. Проводили 30 циклов ПЦР, каждый из которых состоял из денатурации при 95°C в течение 30 секунд, отжига при 50°C в течение 30 секунд и полимеризации при 72°C в течение 1 минуты.

В результате были получены NCgl0336-A и NCgl0336-B, которые являются фрагментами ДНК, представляющими собой 342-п.н. фрагмент гена NCgl0336 и 315-п.н. фрагмент гена NCgl0336, соответственно. Фрагмент ДНК, полученный методом ПЦР-амплификации, лигировали в плазмиду pDZ (корейский патент № 10-0924065) с использованием набора Infusion cloning kit (Invitrogen), затем вводили трансформацией в E. coli DH5α и высевали клетки на твердую среду LB, содержащую 25 мг/л канамицина. Колонию, трансформированную плазмидой, в которую был вставлен нужный ген, отбирали с помощью ПЦР и затем плазмиду выделяли с использованием общеизвестной методики выделения плазмид. Плазмида была названа «pDZ-ΔNCgl0336». pDZ-ΔNCgl0336 представляет собой плазмиду, в которой 503-п.н. фрагмент гена NCgl0336 был делетирован.

Пример 3: Конструирование рекомбинантной плазмиды для инактивации гена секреторного белка NCgl0717

Для конструирования рекомбинантной плазмиды, способной инактивировать ген NCgl0717 на хромосоме Corynebacterium, получали аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 7) и нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 8) NCgl0717 на основании нуклеотидной последовательности, депонированной в Genbank NIH. Для получения фрагмента гена путем удаления открытой рамки считывания NCgl0717 были сконструированы праймеры SEQ ID NOs: 9-12, исходя из последовательности SEQ ID NO: 8.

SEQ ID NO. 9: 5'-CCGGGGATCCTCTAGAGTTCGCGGATAAATGGG-3';

SEQ ID NO. 10: 5'-CACGTGAAATTCAGGTCGCGTGGTTCACCTCCGAAG-3';

SEQ ID NO. 11: 5'-CTTCGGAGGTGAACCACGCGACCTGAATTTCACGTG-3';

SEQ ID NO. 12: 5'-GCAGGTCGACTCTAGAGGTCCCATGATTGTTCTG-3'.

Используя геномную ДНК Corynebacterium glutamicum в качестве матрицы, проводили ПЦР с использованием набора праймеров SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, и набора праймеров SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12. Проводили 30 циклов ПЦР, каждый из которых состоял из денатурации при 95°C в течение 30 секунд, отжига при 50°C в течение 30 секунд и полимеризации при 72°C в течение 1 минуты.

В результате были получены NCgl0717-A и NCgl0717-B, которые являются фрагментами ДНК, представляющими собой 493-п.н. фрагмент гена NCgl0717 и 491-п.н. фрагмент гена NCgl0717, соответственно. Фрагмент ДНК, полученный методом ПЦР-амплификации, лигировали в плазмиду pDZ с использованием набора Infusion cloning kit (Invitrogen), затем вводили трансформацией в E. coli DH5α и высевали клетки на твердую среду LB, содержащую 25 мг/л канамицина. Колонию, трансформированную плазмидой, в которую был вставлен нужный ген, отбирали с помощью ПЦР и затем плазмиду выделяли с использованием общеизвестной методики выделения плазмид. Плазмида была названа «pDZ-ΔNCgl0717». pDZ-ΔNCgl0717 представляет собой плазмиду, в которой 786-п.н. фрагмент гена NCgl0717 был делетирован.

Пример 4: Конструирование рекомбинантной плазмиды для инактивации гена секреторного белка NCgl2912

Для конструирования рекомбинантной плазмиды, способной инактивировать ген NCg2912 на хромосоме Corynebacterium, получали аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 13) и нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 14) NCgl2912 на основании нуклеотидной последовательности, депонированной в Genbank NIH. Для получения фрагмента гена путем удаления открытой рамки считывания NCgl2912 были сконструированы праймеры SEQ ID NOs: 15-18, исходя из последовательности SEQ ID NO: 14.

SEQ ID NO. 15: 5'-CCGGGGATCCTCTAGAGCTGCAAGAAGTGCGAC-3';

SEQ ID NO. 16: 5'-CTCGTAGTCGCTAGCACCTATTACGGGAGGTC-3';

SEQ ID NO. 17: 5'-GACCTCCCGTAATAGGTGCTAGCGACTACGAG-3';

SEQ ID NO. 18: 5'-GCAGGTCGACTCTAGACCCGAGCTATCTAACAC-3'.

Используя геномную ДНК Corynebacterium glutamicum в качестве матрицы, проводили ПЦР с использованием набора праймеров SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16, и набора праймеров SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18. Проводили 30 циклов ПЦР, каждый из которых состоял из денатурации при 95°C в течение 30 секунд, отжига при 50°C в течение 30 секунд и полимеризации при 72°C в течение 1 минуты.

В результате были получены NCgl2912-A и NCgl2912-B, которые являются фрагментами ДНК, представляющими собой 444-п.н. фрагмент гена NCgl2912 и 636-п.н. фрагмент гена NCgl2912, соответственно. Фрагмент ДНК, полученный методом ПЦР-амплификации, лигировали в плазмиду pDZ с использованием набора Infusion cloning kit (Invitrogen), затем вводили трансформацией в E. coli DH5α и высевали клетки на твердую среду LB, содержащую 25 мг/л канамицина. Колонию, трансформированную плазмидой, в которую был вставлен нужный ген, отбирали с помощью ПЦР и затем плазмиду выделяли с использованием общеизвестной методики выделения плазмид. Плазмида была названа «pDZ-ΔNCgl2912». pDZ-ΔNCgl2912 представляет собой плазмиду, в которой 128-п.н. фрагмент гена NCgl2912 был делетирован.

Пример 5: Конструирование и оценка штаммов с инактивированными генами секреторных белков, полученных из продуцирующего лизин штамма KCCM11016P

Каждую из трех рекомбинантных плазмид (pDZ-ΔNCgl0336, pDZ-ΔNCgl0717 и pDZ-ΔNCgl2912), сконструированных в примерах 2, 3 и 4, вводили трансформацией в Corynebacterium glutamicum KCCM11016P методом, основанным на применении электрического импульса, и штаммы, в которых целевой ген был инактивирован за счет гомологичной рекомбинации, получали методом ПЦР. Полученные штаммы были названы «KCCM11016P-ΔNCgl0336», «KCCM11016P-ΔNCgl0717» и «KCCM11016P-ΔNCgl2912», соответственно.

Каждый из трех штаммов и контрольный штамм инокулировали в 25-мл колбу с угловыми перегородками, содержащую 25 мл среды для посева, приведенной ниже, и культивировали со встряхиванием при 200 об/мин и при температуре 30°C в течение 20 часов. Затем 1 мл этой культуры для посева инокулировали в 250-мл колбу с угловыми перегородками, содержащую 24 мл среды для продуцирования, приведенной ниже, и культивировали со встряхиванием при 200 об/мин и при температуре 37°C в течение 96 часов. Состав среды для посева и среды для продуцирования был следующим.

Среда для посева (pH 7,0)

20 г глюкозы, 10 г (NH₄)₂SO₄, 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 1,5 г мочевины, 4 г KH₂PO₄, 8 г K₂HPO₄, 0,5 г MgSO₄·7H₂O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамина HCl, 2000 мкг кальция пантотената и 2000 мкг никотинамида (на литр дистиллированной воды).

Среда для продуцирования (pH 7,0)

100 г глюкозы, 40 г (NH₄)₂SO₄, 2,5 г соевого белка, 5 г кукурузного экстракта (твердые вещества), 3 г мочевины, 1 г KH₂PO₄, 0,5 г MgSO₄·7H₂O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамина HCl, 2000 мкг кальция пантотената, 3000 мкг никотинамида и 30 г CaCO₃ (на литр дистиллированной воды).

После завершения процесса культивирования культуру переносили в градуированный цилиндр и измеряли высоту образовавшейся пены в культуре, а также измеряли концентрацию L-лизина в культуре методом ВЭЖХ. Результаты измерения приведены в таблице 1, ниже. Результаты в таблице 1 представляют собой результаты трех повторных экспериментов, и продуцирование L-лизина оценивали на основании средних значений.

Таблица 1

Как показано в таблице 1, выше, продуцирование L-лизина штаммом в случае, когда каждый из генов NCgl0336, NCgl0717 и NCgl2912 был инактивирован, возрастало примерно на 6% по сравнению с таковым у исходного штамма KCCM11016P. Кроме того, пена в культуре штамма в случае, когда каждый из генов NCgl0336, NCgl0717 и NCgl2912 был инактивирован, уменьшалась примерно на 6-15% по сравнению с пеной в культуре исходного штамма.

Таким образом, было установлено, что при инактивации основных секреторных белков микроорганизма Corynebacterium sp., которые не важны для продуцирования лизина, образование пены в процессе культивирования микроорганизма можно эффективно контролировать, тем самым повышая уровень продуцирования L-лизина.

Пример 6: Конструирование и оценка штаммов с инактивированными секреторными белками, полученных из продуцирующего лизин штамма KCCM11016P

Для изучения того, являются ли эффекты инактивации секреторных белков в продуцирующем L-лизин штамме Corynebacterium glutamicum KCCM10770P (корейский патент № 10-0924065), имеющем более эффективный биосинтетический путь продуцирования лизина, аналогичными результатам эксперимента примера 5, штаммы, в которых каждый из трех секреторных белков был инактивирован, конструировали таким же образом, как описано в примере 5. Сконструированные штаммы были названы «KCCM10770P-ΔNCgl0336», «KCCM10770P-ΔNCgl0717» и «KCCM10770P-ΔNCgl2912». Для каждого из сконструированных штаммов определяли количество продуцированного L-лизина, наряду с количеством образовавшейся пены.

Для изучения продуцирования лизина штаммами каждый из штаммов, наряду с контрольным штаммом, культивировали таким же образом, как описано в примере 5. После завершения культивирования измеряли количество образовавшейся пены таким же образом, как описано в примере 5, и концентрацию L-лизина измеряли методом ВЭЖХ. Результаты измерения приведены в таблице 2, ниже. Результаты в таблице 2 представляют собой результаты трех повторных экспериментов, и продуцирование L-лизина оценивали на основании средних значений.

Таблица 2

Как показано в таблице 2, выше, продуцирование L-лизина штаммом в случае, когда каждый из генов NCgl0336, NCgl0717 и NCgl2912 был инактивирован, возрастало примерно на 4% по сравнению с таковым у исходного штамма KCCM11016P. Кроме того, пена в культуре штамма в случае, когда каждый из генов NCgl0336, NCgl0717 и NCgl2912 был инактивирован, уменьшалась примерно на 4-18% по сравнению с пеной в культуре исходного штамма.

Таким образом, было установлено, что при инактивации основных секреторных белков Corynebacterium glutamicum KCCM10770P (корейский патент № 10-0924065), которые не важны для продуцирования лизина, образование пены в процессе культивирования микроорганизмов можно эффективно контролировать, тем самым повышая уровень продуцирования L-лизина, аналогично результатам примера 4.

Пример 7: Конструирование и оценка штаммов с инактивированными секреторными белками, полученных из продуцирующего L-лизин штамма KCCM11347P

Для изучения эффектов инактивации секреторных белков в продуцирующем L-лизин штамме Corynebacterium glutamicum KCCM11347P (данный микроорганизм был описан как KFCC10750 и повторно депонирован в Международном органе по депонированию в соответствии с Будапештским договором под учетным № KCCM11347P; корейский патент № 10-0073610), сконструированном путем искусственной мутации, были сконструированы штаммы, в которых каждый из трех секреторных белков был инактивирован, таким же образом, как описано в примере 5 или 6. Сконструированные штаммы были названы «KCCM11347P-ΔNCgl0336», «KCCM11347P-ΔNCgl0717» и «KCCM11347P-ΔNCgl2912». Для каждого из сконструированных штаммов определяли количество продуцированного L-лизина, наряду с количеством образовавшейся пены.

Для изучения продуцирования лизина штаммами каждый из штаммов, наряду с контрольным штаммом, культивировали таким же образом, как описано в примере 5 или 6. После завершения культивирования измеряли количество образовавшейся пены таким же образом, как описано в примере 5 или 6, и концентрацию L-лизина измеряли методом ВЭЖХ. Результаты измерения приведены в таблице 3, ниже. Результаты в таблице 3 представляют собой результаты трех повторных экспериментов, и продуцирование L-лизина оценивали на основании средних значений.

Таблица 3

Как показано в таблице 3, выше, продуцирование лизина штаммом в случае, когда каждый из генов NCgl0336, NCgl0717 и NCgl2912 был инактивирован, возрастало примерно на 5% по сравнению с таковым у исходного штамма KCCM11347P. Кроме того, пена в культуре штамма в случае, когда каждый из генов NCgl0336, NCgl0717 и NCgl2912 был инактивирован, уменьшалась примерно на 4-15% по сравнению с пеной у исходного штамма.

Таким образом, было установлено, что при инактивации основных секреторных белков Corynebacterium glutamicum KCCM11347P (корейский патент № 94-0001307), которые не важны для продуцирования лизина, образование пены в процессе культивирования микроорганизмов можно эффективно контролировать, тем самым повышая уровень продуцирования L-лизина, аналогично результатам примеров 5 и 6.

Пример 8: Конструирование и оценка штаммов с инактивированными секреторными белками, полученных из продуцирующего L-лизин штамма CJ3P

Для изучения эффектов инактивации секреторных белков в штамме Corynebacterium glutamicum CJ3P (Binder et al. Genome Biology 2012, 13: R40), обладающем способностью к продуцированию L-лизина, который сконструирован путем внесения трех мутаций [pyc(P458S), hom(V59A) и lysC(T311I)] в штамм дикого типа, аналогично примерам 5, 6 и 7 были сконструированы штаммы, в которых каждый из трех секреторных белков был инактивирован таким же образом, как описано в примере 5, 6 или 7. Сконструированные штаммы были названы «CJ3P-ΔNCgl0336», «CJ3P-ΔNCgl0717» и «CJ3P-ΔNCgl2912». Для каждого из сконструированных штаммов определяли количество продуцированного L-лизина, наряду с количеством образовавшейся пены.

Для изучения продуцирования лизина штаммами каждый из штаммов, наряду с контрольным штаммом, культивировали таким же образом, как описано в примере 5, 6 или 7. После завершения культивирования измеряли количество образовавшейся пены таким же образом, как описано в примере 5, 6 или 7, и концентрацию L-лизина измеряли методом ВЭЖХ. Результаты измерения приведены в таблице 4, ниже. Результаты в таблице 4 представляют собой результаты трех повторных экспериментов, и продуцирование L-лизина оценивали на основании средних значений.

Таблица 4

Как показано в таблице 4, выше, продуцирование лизина штаммом в случае, когда каждый из генов NCgl0336, NCgl0717 и NCgl2912 был инактивирован, возрастало примерно на 8% по сравнению с таковым у исходного штамма CJ3P. Кроме того, пена в культуре штамма в случае, когда каждый из генов NCgl0336, NCgl0717 и NCgl2912 был инактивирован, уменьшалась примерно на 5-17% по сравнению с пеной у исходного штамма.

Таким образом, было установлено, что при инактивации основных секреторных белков Corynebacterium glutamicum CJ3P, которые не важны для продуцирования лизина, образование пены в процессе культивирования микроорганизма можно эффективно контролировать, тем самым повышая уровень продуцирования L-лизина, аналогично результатам примеров 5, 6 и 7.

Пример 9: Конструирование и оценка штаммов с инактивированными секреторными белками, полученных из продуцирующего L-лизин штамма KCCM11016P

Для изучения эффектов совместной инактивации секреторных белков в продуцирующем L-лизин штамме Corynebacterium glutamicum KCCM11016P были сконструированы три штамма, в которых гены секреторных белков были совместно инактивированы таким же образом, как описано в примерах 5, 6, 7 и 8. Сконструированные штаммы, в которых была проведена инактивация сочетания генов, были названы «KCCM11016P-ΔNCgl0336/ΔNCgl0717», «KCCM11016P-ΔNCgl0336/ΔNCgl2912» и «KCCM11016P-ΔNCgl0717/ΔNCgl2912», и для каждого из сконструированных штаммов было измерено количество продуцированного L-лизина, наряду с количеством образовавшейся пены.

Для сравнения продуцирования лизина штаммами каждый из штаммов, наряду с контрольным штаммом, культивировали таким же образом, как описано в примере 5, 6, 7 или 8. После завершения культивирования измеряли количество образовавшейся пены таким же образом, как описано в примере 5, 6, 7 или 8, и концентрацию L-лизина измеряли методом ВЭЖХ. Результаты измерения приведены в таблице 5, ниже. Результаты в таблице 5 представляют собой результаты трех повторных экспериментов, и продуцирование L-лизина оценивали на основании средних значений.

Таблица 5

Как показано в таблице 5, выше, продуцирование лизина штаммом, в котором гены NCgl0336/NCgl0717, NCgl0336/NCgl2912 или NCgl0717/NCgl2912 были совместно инактивированы, возрастало примерно на 5% по сравнению с таковым у исходного штамма KCCM11016P. Кроме того, пена в культуре штамма, в котором гены NCgl0336/NCgl0717, NCgl0336/NCgl2912 или NCgl0717/NCgl2912 были совместно инактивированы, уменьшалась примерно на 10-14% по сравнению с пеной у исходного штамма.

Таким образом, было установлено, что при инактивации основных секреторных белков микроорганизма рода Corynebacterium, которые не важны для продуцирования лизина, образование пены в процессе культивирования микроорганизма можно эффективно контролировать, тем самым повышая уровень продуцирования L-лизина.

Пример 10: Конструирование и оценка штамма, в котором все секреторные белки инактивированы, полученного из продуцирующего L-лизин штамма KCCM11016P

Для изучения эффектов инактивации всех секреторных белков в продуцирующем L-лизин штамме Corynebacterium glutamicum KCCM11016P был сконструирован штамм, в котором все три секреторных белка были инактивированы таким же образом, как описано в примере 5, 6, 7, 8 или 9. Штамм был назван «KCCM11016P-ΔNCgl0336/ΔNCgl0717/ΔNCgl2912». Для сконструированного штамма определяли количество продуцированного L-лизина, наряду с количеством образовавшейся пены.

Для изучения продуцирования лизина штаммом данный штамм, наряду с контрольным штаммом, культивировали таким же образом, как описано в примере 5, 6, 7, 8 или 9. После завершения культивирования измеряли количество образовавшейся пены таким же образом, как описано в примере 5, 6, 7, 8 или 9, и концентрацию L-лизина измеряли методом ВЭЖХ. Результаты измерения приведены в таблице 6, ниже. Результаты в таблице 6 представляют собой результаты трех повторных экспериментов, и продуцирование L-лизина оценивали на основании средних значений.

Таблица 6

Как показано в таблице 6, выше, продуцирование лизина штаммом, в котором все гены NCgl0336, NCgl0717 и NCgl2912 были инактивированы, возрастало примерно на 7% по сравнению с таковым у исходного штамма KCCM11016P. Кроме того, пена в культуре штамма, в котором все гены NCgl0336, NCgl0717 и NCgl2912 были инактивированы, уменьшалась примерно на 17% по сравнению с пеной у исходного штамма.

Таким образом, было установлено, что при инактивации основных секреторных белков микроорганизма рода Corynebacterium, которые не важны для продуцирования лизина, образование пены в процессе культивирования микроорганизма можно эффективно контролировать, тем самым повышая уровень продуцирования L-лизина.

На основании вышеописанных результатов установлено, что инактивация основных секреторных белков в продуцирующем L-лизин штамме имеет эффект контролирования пены, избыточно образующейся при культивировании, за счет этого повышается способность к продуцированию L-лизина, наряду с ростом клеток. Штаммы KCCM11016P-ΔNCgl0336, KCCM11016P-ΔNCgl0717 и KCCM11016P-ΔNCgl2912 были названы «CA01-2281», «CA01-2279» и «CA01-2280», соответственно. Штаммы CA01-2279 и CA01-2280 были депонированы по форме «международное патентное депонирование» в Корейском центре культур микроорганизмов 22 ноября 2013 г. под учетными номерами KCCM11481P (CA01-2279) и KCCM11482P (CA01-2280), соответственно, и штамм CA01-2281 был депонирован по форме «международное патентное депонирование» в Корейском центре культур микроорганизмов 13 декабря 2013 г. под учетным номером KCCM11502P (CA01-2281).

Учетные номера

Депозитарный орган: Корейский центр культур микроорганизмов;

Учетный номер: KCCM11481P;

Дата депонирования: 22 ноября 2013 г.

Депозитарный орган: Корейский центр культур микроорганизмов;

Учетный номер: KCCM11482P;

Дата депонирования: 22 ноября 2013 г.

Депозитарный орган: Корейский центр культур микроорганизмов;

Учетный номер: KCCM11502P;

Дата депонирования: 13 декабря 2013 г.

УКАЗАНИЯ, ОТНОСЯЩИЕСЯ К ДЕПОНИРОВАННОМУ МИКРООРГАНИЗМУ ИЛИ ДРУГОМУ БИОЛОГИЧЕСКОМУ МАТЕРИАЛУ

(PCT Правило 13bis)

Форма PCT/RO/134 (июль 1998 г.; репринт январь 2004 г.)

УКАЗАНИЯ, ОТНОСЯЩИЕСЯ К ДЕПОНИРОВАННОМУ МИКРООРГАНИЗМУ ИЛИ ДРУГОМУ БИОЛОГИЧЕСКОМУ МАТЕРИАЛУ

(PCT Правило 13bis)

Форма PCT/RO/134 (июль 1998 г.; репринт январь 2004 г.)

УКАЗАНИЯ, ОТНОСЯЩИЕСЯ К ДЕПОНИРОВАННОМУ МИКРООРГАНИЗМУ ИЛИ ДРУГОМУ БИОЛОГИЧЕСКОМУ МАТЕРИАЛУ

(PCT Правило 13bis)

Форма PCT/RO/134 (июль 1998 г.; репринт январь 2004 г.)