Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОТБОРА МАТЕРИНСКИХ РАСТЕНИЙ RHODODENDRON LEDEBOURII POJARK., ПРОДУЦИРУЮЩИХ СЕМЕННОЕ ПОТОМСТВО С РАЗНЫМ УРОВНЕМ СТАБИЛЬНОСТИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

Изобретение относится к способам выращивания растений, в частности к способам селекции, и может быть использовано для отбора материнских растений Rhododendron ledebourii Pojark., продуцирующих семенное потомство с высоким уровнем стабильности генетического материала, в частности для выделения растений-маточников.

Важнейшей составной частью современной селекционной программы является изучение исходного материала видов, оценка генетического потенциала и отбор материнских растений. Известны наиболее часто применяемые методики отбора: массовый, индивидуальный и их разновидности (индивидуально семейный и семейно-групповой отбор), основанные на анализе фенотипических признаков. Однако массовый отбор имеет и существенные недостатки, обусловленные тем, что по фенотипу трудно однозначно судить о генотипе отбираемых особей, от которого зависит эффективность отбора (Царев А.П., Погиба СП., Тренин В.В. Селекция и репродукция лесных древесных пород: Учебник / Под ред. А.П. Царева. - М.: Логос, 2003. - 520 с.). Невозможность проверки отбираемых растений по их потомству как недостаток массового отбора может быть устранен при использовании цитогенетического метода исследования семенного потомства, позволяющего осуществить оценку генетического материала. (Область использования цитогенетического метода в лесной генетике и селекции / Т.В. Вострикова // Лесное хозяйство. - 2006. - №1. - С. 30-32).

Особенностью массового отбора является его относительная односторонность, выражающаяся в отборе генотипов только по материнской линии, а также то, что все его результаты основаны на аддитивном генетическом эффекте. Использование цитогенетического метода позволяет оценивать стабильность генетического материала материнского растения и его семенного потомства (Вострикова Т.В. Цитогенетические реакции березы повислой на действие стрессовых факторов / Т.В. Вострикова, А.К. Буторина // Известия РАН. Серия биологическая. - 2006. - №2. - С. 232-238; Вострикова Т.В. Нестабильность цитогенетических показателей и нестабильность генома у березы повислой / Т.В. Вострикова // Экология. - 2007. - №2. - С. 88-92).

Применение предлагаемого способа отбора материнских растений способствует выделению любых ценных перекрестно- и самоопыляющихся растений на основании оценки цитогенетических характеристик семенного потомства. Массовый отбор не позволяет выделить из популяций наиболее ценные в селекционном отношении формы и реализовать их преимущества. Для этого используют индивидуальный отбор и смешанные методы: индивидуально семейный и семейно-групповой. Однако их огромными недостатками являются высокая длительность эксперимента (из-за поэтапной оценки потомства), ограниченность в количестве и невозможность генетической оценки отбираемых индивидов. Например, как и индивидуально-семейный, семейно-групповой отбор является очень продолжительным и для основных лесных пород требует 70-100 лет и более.

Отбор лучших (плюсовых) насаждений часто называют «групповым» (Котов М.М. Генетика и селекция: Учеб. для вузов. - Йошкар-Ола: МарГТУ, 1997. - Ч. 1. - 280 с; Ч. 2. - 108 с., Любавская А.Я. Лесная селекция и генетика. - М.: Лесная промышленность, 1982. - 288 с.), хотя по принципиальным особенностям он является типично массовым. При этом степень генетического улучшения следующей генерации зависит в первую очередь от того, насколько возможно по фенотипу отличить высокоценные наследственные качества от малоценных. Нередко хорошие наследственные качества не проявляются из-за плохих условий местопроизрастания и, наоборот, в хороших условиях более высокую ценность могут показывать фенотипы с относительно худшими наследственными качествами.

Отбор лучших деревьев (которые также называют отборными, материнскими, плюсовыми или элитными) производят без предварительной оценки их наследственных свойств, создают прививочные плантации из черенков этих деревьев. Ожидается некоторое повышение продуктивности насаждений, созданных из семян, полученных на этих плантациях. Однако эти ожидания, особенно при селекции на продуктивность по массе, не всегда оправдываются. Большим недостатком является отсутствие предварительной оценки наследственных свойств материнских растений, что может быть устранено при использовании цитогенетического метода. Данный метод активно использует способ популяционного или группового сбора семян при исследовании цитогенетических показателей проростков (Артюхов В.Г., Калаев В.Н., Карпова С.С. Цитогенетический полиморфизм семенного потомства деревьев березы повислой (Betula pendula Roth.), произрастающих в различных экологических условиях // Экологическая генетика. 2009. Т. 7. №1. С. 30-40; Калаев В.Н., Попова А.А. Цитогенетический полиморфизм проростков семян деревьев дуба черешчатого (Quercus Robur L.) на территориях с разным уровнем антропогенного загрязнения // Проблемы региональной экологии. 2014. №2. С. 176-190).

Предлагаемый нами способ отбора отличается тем, что предусматривает оценку цитогенетических характеристик семенного потомства каждого из материнских растений Rhododendron ledebourii Pojark. и отдельно каждого проростка (индивида), т.е. индивидуальный сбор данных. Это позволяет выявлять уровень нарушений генетического материала, митотическую активность клеток и ядрышковые характеристики (уровень клеток с остаточными ядрышками на стадии метафазы-телофазы митоза, площадь поверхности одиночных ядрышек), прямо или косвенно свидетельствующие о цитогенетической стабильности материнских растений и их семенного потомства. Известно использование ранее группового способа отбора проростков с разным уровнем мутабильности и выделения мутабильных и слабомутабильных групп по 16-18 цитогенетическим показателям (Артюхов В.Г., Калаев В.Н., Карпова С.С. Цитогенетический полиморфизм семенного потомства деревьев березы повислой (Betula pendula Roth.), произрастающих в различных экологических условиях // Экологическая генетика. 2009. Т. 7. №1. С. 30-40).

Для определения цитогенетических характеристик и морфологических показателей семенного потомства деревьев дуба черешчатого (Quercus robur L.) (Калаев В.Н., Попова А.А. Цитогенетические характеристики и морфологические показатели семенного потомства деревьев дуба черешчатого (Quercus robur L.), произрастающих на территориях с разным уровнем антропогенного загрязнения // Вестник Воронежского государственного университета. Серия Химия. Биология. Фармация. 2014., б. №4. С. 63-72) с каждой территории собирали около 150-200 семян, проращивали их во влажном песке, когда корешки проростков достигали длины 2-3 см, производилась их фиксация в смеси 96% этилового спирта и ледяной уксусной кислоты (3:1) в 22 ч (зимнее время), когда наблюдаются пики митотической активности и патологических митозов. После чего корешки проростков окрашивали ацетогематоксилином, изготавливали давленные препараты, проводили просмотр и на каждом препарате учитывали общее количество просмотренных клеток, количество делящихся клеток, находящихся в той или иной стадии митоза, количество и тип патологических митозов. На основании полученных данных определяли митотический индекс (доля делящихся клеток, %), долю патологических митозов среди общего числа делящихся клеток (%), распределения клеток по стадиям митоза (доля про-, мета-, ана-, телофаз, %), также была вычислена частота встречаемости различных по площади типов ядрышек (%).

В предлагаемом нами способе исследуется семенное потомство от индивидуального материнского растения и число исследуемых цитогенетических показателей, по которым адекватно оценивают уровень стабильности генетического материала проростков, уменьшено до 5 (митотический индекс, уровень патологий митоза, спектр патологий митоза, уровень клеток с остаточными ядрышками на стадии метафазы-телофазы митоза, площадь поверхности одиночных ядрышек), что значительно упрощает, ускоряет получение научных данных и позволяет быстрее внедрить результаты отбора в производство при выращивании посадочного материала.

Задача изобретения - разработка способа оценки стабильности генетического материала семенного потомства материнских экземпляров Rhododendron ledebourii Pojark.

Технический результат заключается в разработке относительно быстрого и простого способа отбора материнских растений Rhododendron ledebourii Pojark., продуцирующих семенное потомство с высоким уровнем стабильности генетического материала.

Технический результат достигается тем, что в способе отбора материнских растений Rhododendron ledebourii Pojark., продуцирующих семенное потомство с разным уровнем стабильности генетического материала, включающем сбор и проращивание семян фенотипически здоровых материнских растений Rhododendron ledebourii Pojark., приготовление из корешка каждого проростка длиной 0,5-1 см постоянно-давленного микропрепарата, анализ следующих цитогенетические показателей каждого микропрепарата: «митотическая активность» как отношение числа делящихся клеток к общему числу подсчитанных клеток (%), «уровень патологий митоза» как отношение числа клеток с нарушениями митоза к общему числу делящихся клеток (%), «спектр патологий митоза» как отношение числа клеток с определенным типом нарушений деления к числу делящихся клеток с аберрациями (%), «уровень клеток с остаточными ядрышками» на стадии метафазы-телофазы митоза как отношение числа клеток с остаточными ядрышками к общему числу клеток на указанных стадиях (%), «средняя площадь поверхности одиночных ядрышек» (в мкм²), согласно изобретению проводят анализ не менее 19 микропрепаратов и не менее 500 клеток каждого микропрепарата, «средняя площадь поверхности одиночных ядрышек» определяется по 200 клеткам на каждом микропрепарате, полученные значения цитогенетических показателей сравнивают со значениями для мутабильной или слабомутабильной группы, причем показатель «митотическая активность» относится к мутабильной группе при значении не более 8%, «уровень патологий митоза» - при значении более 2,5%, «спектр патологий митоза» представлен нарушениями, связанными с повреждением хромосом (более 50% отставаний хромосом в анафазе и метакинезе), «уровень клеток с остаточными ядрышками» - более 8%, «площадь поверхности одиночных ядрышек» - при значении не менее 76 мкм², в противном случае показатели относятся к слабомутабильной группе; если более 2 показателей оказались в мутабильной группе, то и проросток относят к мутабильной группе, а если 2 и менее, то к слабомутабильной; если не менее половины проростков оказались в слабомутабильной группе, уровень стабильности генетического материала материнского растения оценивается как высокий, если менее - то как низкий.

На фиг. 1 приведена Таблица 1 цитогенетических характеристик семенного потомства Rhododendron ledebourii Pojark. с разной стабильностью генетического материала.

На фиг. 2 и фиг. 3 приведены Таблицы 2 и 3 цитогенетических характеристик семенного потомства материнского растения Rhododendron ledebourii Pojark. №1 и материнского растения Rhododendron ledebourii Pojark. №2, где № пр - № препарата; МИ, % - митотический индекс, подсчитанный с учетом стадии профазы; ПМ, % - уровень патологий митоза; ОЯ, % - уровень клеток с остаточными ядрышками; площадь - площадь поверхности одиночных ядрышек, мкм²; № гр - № группы: 1 - мутабильная, 2 - слабомутабильная.

В заявленном способе определяют цитогенетические показатели проростков семян от каждого материнского растения в отдельности: митотическую активность, ядрышковые характеристики (уровень клеток с остаточными ядрышками на стадии метафазы-телофазы митоза, площадь поверхности одиночных ядрышек), уровень и спектр патологий митоза, на основании которых семенное потомство разделяют на группы по цитогенетической стабильности, после чего делают вывод по цитогенетическим характеристикам большинства проростков о том, какое семенное потомство по стабильности генетического материала продуцируют материнские растения.

Предлагаемый способ отбора материнских растений видов рода Rhododendron по цитогенетическим показателям семенного потомства позволяет относительно быстро и просто оценить стабильность генетического материала семенного потомства материнского растения. При использовании предлагаемого способа отбора происходит экономия времени исследования, которое может занимать всего лишь несколько месяцев, включая сбор семян, их проращивание, изготовление микропрепаратов, анализ и оценку полученных результатов.

Пример

Для цитогенетического исследования семенного потомства Rhododendron ledebourii Pojark. используют зрелые семена, собранные от каждого в отдельности фенотипически здорового материнского растения (без визуальных повреждений паразитами) на экологически чистой территории. Семена проращивают в чашках Петри при температуре +25°С. По достижении корешками длины 0,5-1 см их фиксируют в 9 часов утра в ацетоалкоголе - смеси 96% этилового спирта и ледяной уксусной кислоты (3:1), после чего материал хранят в холодильнике при температуре +4°С. Из корешков проростков готовят постоянно-давленные микропрепараты с использованием жидкости Гойера, описанной ранее (Вострикова Т.В. Изучение суточной митотической активности у березы повислой / Т.В. Вострикова, А.К. Буторина // Цитология. - 2004. - Т. 46. - №6. - С. 520-524). Корешки проростков подвергают мацерации в 18% растворе HCl при 60°С в течение 1-2 минут. Затем промывают в растворе 45% уксусной кислоты 15 минут. Корешки окрашивают ацетогематоксилином в течение 1-1,5 часов, ополаскивают дистиллированной водой и готовят давленные микропрепараты с использованием жидкости Гойера по методике: 1) отделить кончик корешка проростка (1-3 мм) препаровальной иглой; 2) поместить его на предметное стекло в каплю жидкости Гойера; 3) накрыть покровным стеклом и слегка подогреть над пламенем спиртовки (для лучшего распределения клеток); 4) придавить кончик корешка, постукивая легкими ударами ручкой препаровальной иглы.

Анализируют цитогенетические характеристики нечетного числа проростков семян от каждого экземпляра материнского растения, не менее 19. Препараты изучают с помощью микроскопа LABOVAL-4 (Carl Zeiss, Jena) при общем увеличении 40×1,5×10. В каждом микропрепарате (1 препарат соответствует 1 корешку и одному проростку) анализируют около 500-700 клеток.

На микропрепаратах подсчитывают общее число клеток, число митотически делящихся клеток; число клеток с нарушениями деления (число делящихся клеток с аберрациями); число клеток с остаточными ядрышками на стадии метафазы-телофазы митоза, измеряют площадь поверхности ядрышек. Остаточные ядрышки выглядят как отдельные круглые или каплеобразные тельца, соединенные с хромосомами на стадии метафазы-телофазы митоза.

Для изучения ядрышковых характеристик в клетках корневой меристемы семенного потомства Rhododendron ledebourii Pojark. производят измерение диаметра одиночных ядрышек с помощью окулярмикрометра (анализируют по 200 клеток на каждом препарате) и высчитывают среднюю площадь поверхности одиночных ядрышек (в мкм²).

На основании проведенных подсчетов и измерений вычисляют следующие цитогенетические показатели: митотическую активность, показателем которой является митотический индекс (МИ) - отношение числа делящихся клеток к общему числу подсчитанных клеток (в %), уровень патологий митоза (ПМ) (как отношение числа клеток с нарушениями митоза к общему числу делящихся клеток, в %), уровень клеток с остаточными ядрышками на стадии метафазы-телофазы митоза (как отношение числа клеток с остаточными ядрышками к общему числу клеток на указанных стадиях, %). Классификацию патологических митозов проводят по Алову (Алов И.А. Цитофизиология и патология митоза. М.: Медицина, 1972. 264 с.). В спектре патологий митоза высчитывают отношение числа клеток с определенным типом нарушений деления к числу делящихся клеток с аберрациями (в %).

В качестве критериев отбора материнских растений используется совокупность цитогенетических характеристик семенного потомства (митотический индекс, уровень и спектр патологий митоза, уровень клеток с остаточными ядрышками на стадии метафазы-телофазы митоза, площадь поверхности одиночных ядрышек).

Результаты анализа цитогенетических характеристик семенного потомства материнских растений представили в виде таблицы (таблицы 2-3).

Полученные цитогенетические показатели каждого проростка сравнивают со значениями, представленными в таблице 1, и относят проросток к мутабильной или слабомутабильной группе. Если по некоторым цитогенетическим показателям проросток можно отнести к одной группе, а по другим к другой, то проросток относят к мутабильной или слабомутабильной группе по большинству исследованных цитогенетических характеристик.

Стабильность генетического материала материнских растений оценивается по количеству мутабильных и слабомутабильных экземпляров у семенного потомства. При преобладании мутабильных проростков материнское растение относится к экземплярам, продуцирующим мутабильное потомство. Если большинство проростков относится к слабомутабильной группе, то материнский экземпляр можно считать продуцирующим слабомутабильное потомство.

Например, проростки №3, 12, 13 материнского экземпляра №1 (табл. 2) включены в слабомутабильную группу по большинству цитогенетических показателей (уровню и спектру патологий митоза, уровню клеток с остаточными ядрышками, площади поверхности одиночных ядрышек), хотя их митотический индекс - 7,4; 7,1; 7,7% (менее или равен 8%) позволяет их отнести к мутабильной группе (табл. 2).

Проросток №13 материнского экземпляра №2 (табл. 3) включен в мутабильную группу по большинству исследованных цитогенетических характеристик, поскольку его митотический индекс - 7,8% (менее или равен 8%), уровень клеток с остаточными ядрышками - 20,2% (более 8%), отставания хромосом (54%) преобладают над мостами (46%), площадь поверхности одиночных ядрышек - 82,8 мкм², хотя он имеет уровень патологий митоза - 2,5%, соответствующий слабомутабильной группе.

Таким образом, среди семенного потомства материнского растения №1 все проростки оказались слабомутабильными, поэтому материнское растение №1 можно назвать маточником, продуцирующим слабомутабильное семенное потомство. Все проростки от другого исследуемого материнского растения (№2) отнесены к мутабильной группе, поэтому данное растение можно назвать маточником, продуцирующим мутабильное семенное потомство.

Таким образом, способ отбора материнских растений Rhododendron ledebourii Pojark. с применением цитогенетического метода позволяет выявлять маточники, продуцирующие мутабильное и слабомутабильное потомство.

В дальнейшем родительские особи, продуцирующие потомство с разной стабильностью генетического материала, могут быть использованы в генетико-селекционных работах.