Результат интеллектуальной деятельности: Способ прогнозирования развития метастазов в регионарные лимфоузлы у пациентов с аденокарциномой желудка

Изобретение относится к медицине, а именно к молекулярной биологии, онкологии, и касается способа прогнозирования вероятности развития метастазов в регионарные лимфоузлы у пациентов с аденокарциномой желудка.

Рак желудка занимает одно из ведущих мест в общей структуре онкологических заболеваний в РФ: 8,2% у мужчин и 5,4% у женщин. В структуре смертности населения России от злокачественных новообразований рак желудка занимает второе место с показателем 10,7% или 30788 человек в 2014 году (см. Под редакцией А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой // Злокачественные новообразования в России в 2015 году (заболеваемость и смертность), Москва, 2017).

Аденокарцинома желудка составляет 95% от общего числа злокачественных новообразований данного органа (см. Dicken BJ, Bigam DL, Cass С, Mackey JR, Joy AA, Hamilton SM. Gastric Adenocarcinoma: Review and Considerations for Future Directions. Annals of Surgery. 2005; 241(1):27-39. doi:10.1097/01.sla.0000149300.28588.23).

Метастазы возникают у 90% больных, при этом выживаемость составляет 65% в случае ранней диагностики заболевания и менее 15% на поздних стадиях развития онкологического процесса (см. Takuji G., Yanagisawa A., Sasako М. Ono Н, Nakanishi Y., Shimoda Т., Kato Y. Incidence in lymph node metastasis from early gastric cancer: estimation with a large number of cases at two large centers. // Gastric Cancer. - 2000. - V. 3. - P. 219-225). Поэтому поиск потенциальных молекулярных и иммуногистохимических маркеров, пригодных для прогнозирования течения этого заболевания, является актуальной задачей.

Изменение копийности генов (Copy Number Variation или CNV) является одним из основных механизмов контроля раковой клеткой ключевых для выживания и малигнизации экспрессии генов. Копийность генов - вид генетического полиморфизма, возникающий в результате несбалансированных хромосомных перестроек, таких как делеции и дупликации.

Результатом вариации может явиться снижение или повышение числа копий определенного гена и, следовательно, пониженная или повышенная экспрессия продукта гена - белка или не кодирующей РНК. CNV представляют собой критические генетические события, которые способствуют развитию и прогрессированию злокачественных новообразований у человека (см. Кит О.И., Водолажский Д.И., Кутилин Д.С., Гудуева Е.Н. Изменение копийности генетических локусов при раке желудка // Молекулярная биология. - 2015. - Т. 49, №4. - С. 658-666.).

C-erbB-2 (HER2/neu) - представитель семейства гомологичных трансмембранных рецепторов эпидермального фактора роста, обладающих тирозинкиназной активностью. Белок HER2, не имея собственного лиганда, взаимодействует с другими рецепторами и усиливает функционирование всей системы (см. Harari D., Yarden Y, Molecular mechanisms underlying ErbB2/HER2 action in breast cancer Oncogene. 2000 Dec 11; 19(53):6102-14.; см. McCormick Matthews L.H., Noble F., Tod J. et al. Systematic review and meta-analysis of immunohistochemical prognostic biomarkers in resected oesophageal adenocarcinoma. British Journal of Cancer. 2015; 113(1):107-118.). При изучении аденокарциномы пищевода отмечается отрицательный прогностический эффект при избыточной экспрессии HER2 (см. McCormick Matthews L.H. et al., 2015).

Область исследования экспрессии HER2 в последнее время значительно расширилась, охватив такие нозологии, как рак молочной железы, рак желудка и рак пищевода.

В настоящее время проводится проспективное клиническое исследование. Первичные результаты свидетельствуют о том, что чувствительность и специфичность для диагностики аденокарциномы пищевода составляют 88 и 100% соответственно, при одновременном гистохимическом определении HER2, c-myc, и анеуплоидии (см. С. Tan, X. Qian, Z. Guan, В. Yang, Y. Ge, F. Wang, J. Cai. Potential biomarkers for esophageal cancer Springerplus. 2016; 5: 467.).

Единого мнения о прогностической ценности гиперэкспрессии белка HER2 при РЖ пока нет (см. Song Y., Huang J., Wang J.W. Relationship between HER2/neu gene amplification and protein expression and prognosis in patients with advanced gastric carcinoma. Chin J Cancer. 2010; 29(1):76-81.). Большинство исследований указывает на то, что избыточная мембранная экспрессия HER2 ассоциирована с плохим прогнозом заболевания и может служить прогностическим показателем для инвазивных характеристик опухоли и метастазирования в лимфатические узлы (см. Zhang XL, Yang YS, Xu DP, Qu JH, Guo MZ, Gong Y, Huang J., Comparative study on overexpression of HER2/neu and HER3 in gastric cancer. World J Surg. 2009; 33(10):2112-8).

Особое значение в прогнозировании поведения опухоли придают ее пролиферативной активности.

Наиболее распространенным маркером пролиферации является регуляторный белок Ki 67. Несмотря на общее использование Ki 67 для индексации клеточной пролиферации его прогностическая значимость при плоскоклеточном раке пищевода остается неубедительной.

В трех исследованиях, включавших в общей сложности 192 пациента, наблюдался незначительный прогностический эффект (см. McCormick Matthews L.H., Noble F., Tod J, Jaynes E, Harris S, Primrose J N, Ottensmeier C, Thomas G J, Underwood T J. Systematic review and meta-analysis of immunohistochemical prognostic biomarkers in resected oesophageal adenocarcinoma. Br J Cancer. 2015; 113(1): 107-118.).

Напротив, исследование, проведенное Sittel С. et al. (см. Sittel С, Ruiz S, Kvasnicka H M, Volling P, Eckel H E. 2000. Prognostic relevance of proliferation marker Ki-67 (MIB 1), PCNA and p53 in combined surgically and radiologically treated cancers of the oropharynx and mouth cavity Laryngo-rhino-otologie 79 (2): 86-92.) показало, что высокая экспрессия Ki 67 является неблагоприятным фактором в прогнозе течения и общей безрецидивной выживаемости.

Антитела к Ki 67 выявляют пролиферирующие клетки, находящиеся в разных фазах цикла. Ki 67 является надежным индикатором пролиферации практически во всех опухолевых образованиях человека. Антиген Ki 67, выявляемый соответствующими моноклональными антителами, представляет собой короткоживущий протеин, он разрушается в течение 1,5-2 часов. Поэтому антитела к Ki 67 выявляют только делящиеся клетки, так как Ki-67 не успевает накапливаться и не остается в покоящихся клетках (см. Петров С.В., Райхлин Н.Т. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. Казань: Татмедиа, 2012. - 623 с.).

Транскрипционный фактор NFKB (ядерный фактор «каппа-би») контролирует экспрессию генов иммунного ответа, апоптоза и клеточного цикла. Нарушение регуляции NFKB вызывает воспаление, аутоиммунные заболевания, а также развитие рака.

Так как одним из важных свойств NFKB является его способность защищать клетку от апоптоза, гены его субъединиц относят к протоонкогенам. В норме активность сигнального пути NFKB в клетке находится под строгим контролем, однако мутации различных генов могут стать причиной его конститутивной активации. Это имеет место при лимфомах разного происхождения, множественной миеломе и раке (см. Staudt L.М. Oncogenic activation of NF-kappaB // Cold Spring Harb Perspect Biol. - 2010. - T. 2, вып. 6. - С. a000109.)

Поэтому в качестве маркеров для прогнозирования вероятности развития метастазов в лимфоузлы у пациентов с диагнозом аденокарцинома желудка адекватно комбинированное использование показателей относительной копийности генов NFKB1 и HER2 и иммуногистохимической экспрессии белков KI67 и HER2.

Анализ патентных источников показал наличие близких по тематике изобретений:

1. «Способ прогнозирования продолжительности жизни онкологических больных после радикальных операций» (см. патент RU 2101704 C1, G01N 33/49 по заявке №94005926): на основе определения онкологических индексов - измерения антропометрических данных и характеристик опухоли, показателей общего и биохимического анализов крови.

2 «Способ прогнозирования метастазов у больных раком желудка» (см. патент RU №2445632 С1, опубл. 20.03.2012, Бюл. №8): на основе иммуногистохимического исследования, маркера пролиферативной активности Ki-67 и маркеров апоптоза р53, bcl-2 у больных раком желудка.

Описанные изобретения используют в анализе способы, принципиально отличающиеся от нашего, обладающие меньшей чувствительностью или специфичностью, чем предлагаемый нами, сочетающий комбинацию молекулярно-генетического и иммуногистохимического подходов.

Изобретение «Способ прогнозирования развития метастазов у пациентов с аденокарциномой желудка на основе молекулярно-генетического и иммуногистохимического анализа» является новым, так как данная панель генов/белков и методов ранее не использовалась для заявленной в способе цели.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание нового, простого в исполнении, не дорогостоящего и более точного способа прогнозирования развития метастазов у больных аденокарциномой желудка.

Технический результат достигается тем, что осуществляют амплификацию фрагментов генетических локусов В2М, NFKB1 и HER2 NFKB1 и HER2 методом ПЦР в реальном времени с помощью высокоспецифичных праймеров на матрице выделенной ДНК, проводят количественную интерпретацию результатов амплификации и расчет относительной копийности генов по формуле rC=rC_{опухоль}/rC_норма=2^-ΔCt_{(опухоль)}/2^-ΔCt_(норма), где rC - относительная копийность гена, ΔCt - разность среднего значения сигналов флюоресценции (Ct) по трем повторам для гена мишени и среднего C_t по трем повторам для референсного гена: ΔC_t=C_t(ген мишень) - C_t(B2M), параллельно осуществляют иммуногистохимическое исследование на срезах парафиновых блоков с помощью моноклональных антител к Ki67 и HER2, сравнивают полученные значения rC с прогностическими значениями копийности, и при значениях rC_NFKB1<0,8±0,02 и rC_HER2<1,1±0,08 в комбинации с уровнем экспрессии в ядрах опухолевых клеток белка Ki67_игх<35,6±6,1 и негативной экспрессией HER2_игх(-) прогнозируют отсутствие метастазов, а при значениях rC_NFKB1>0,9±0,01 и rC_HER2>2,0±0,1 в комбинации с уровнем экспрессии в ядрах опухолевых клеток белка Ki67_игх>54,2±4,9 и позитивной экспрессией HER2_игх (+++) прогнозируют развитие метастазов.

Заявляемый способ является экономически оправданным, осуществляется в условиях стандартной лаборатории молекулярной биологии (ПЦР+ИГХ), без использования специального дорогостоящего оборудования; обладает высокой чувствительностью и специфичностью, универсален, его осуществление возможно с операционными биоптатами (парафиновыми блоками), регистрацию результатов производят однократно в конце исследования, способ занимает менее 8 часов.

Заявленный анализ основан на определении количества копий генов NFKB1 и HER2 относительно референсного локуса В2М (β-2 микроглобин) в опухолевой ткани желудка, и последующем сравнении полученных значений с интервалом копийности rC_NFKB1 и rC_HER2 характерным для развития метастазов или их отсутствия, а также на иммуногистохимическом определении экспрессии белков Ki 67 и HER2 и сравнении полученных значений с показателями ИГХ (Ki 67 и HER2) характерными для развития метастазов или их отсутствия.

Заявленный способ включает следующие приемы:

- выделение тотальной ДНК из тканевых проб или из парафиновых блоков с помощью метода фенол-хлороформной экстракции;

- определение относительной копийности генетических локусов методом ПЦР-РВ в присутствии красителя EVA-Green и специфичных праймеров на матрице выделенной ДНК;

- анализ первичных данных с помощью программного продукта амплификатора;

- расчет относительной копийности гена (rC) на основании соотношения сигналов, продуцируемых амплификатами изучаемой и референсной последовательностей,

- сравнение rC пробы с прогностическими значениями копийности rC_{стандарт}, определенными для больных раком желудка с метастазами или без метастазов в лимфоузлах.

- иммуногистохимическое исследование на срезах парафиновых блоков, предназначенных для стандартного морфологического исследования, с помощью моноклональных антител к KI67 и HER2.

- сравнение полученных значений с показателями ИГХ (KI67 и HER2) характерными для развития метастазов или их отсутствия

Заявляемый способ осуществляется следующим образом.

На первом этапе отбираются образцы опухолевой и нормальной тканей из операционного или биопсийного материала. Для транспортировки в лабораторию и хранения образцы замораживаются в жидком азоте.

Фрагменты ткани измельчаются скальпелем и/или ножницами, затем растираются в фарфоровых ступках в присутствии лизирующего SDS-содержащего буфера. К лизатам добавляется протеиназа К и инкубируется при t=56°C в течение 1 часа.

ДНК выделяется из прозрачного лизата тканей с использованием фенол-хлороформной экстракции (см. Корниенко И.В., Водолажский Д.И., Вейко В.П. и др. Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел. - Ростов-н/Д: ООО Ростиздат, 2001).

Концентрация полученных препаратов ДНК измеряется на флюориметре. Для проведения ПЦР-РВ концентрацию ДНК в каждом образце нормализуют до 2 нг/мкл.

Анализируемые последовательности генетических локусов амплифицируют в 25 мкл ПЦР-смеси, содержащей 10 нг геномной ДНК, 0,2 м М dNTPs, 2,5 мМ MgCl₂, 1х-ый ПЦР-буфер, 1 е.а. ДНК-полимеразы Thermus aquaticus («Синтол», Россия), краситель SYBR@Green I (Invitrogen, США) и по 200 нМ прямого и обратного праймеров для референсного гена (β-2 микроглобин) или гена-мишени.

Прямые и обратные праймеры были разработаны для нуклеотидных последовательностей, содержащих интронные и экзонные участки генетических локусов, с использованием данных NCBI GenBank (таблица 1).

Для оптимизации ПЦР использовали только праймеры, которые обеспечивали специфичную амплификацию необходимого количества продукта и не образовывали между собой высокоэнергетических внутренних структур: шпилек и дуплексов.

Оптимизировали такие параметры ПЦР, как концентрация MgCl₂ и праймеров в ПЦР-смеси, соотношение прямых и обратных праймеров, количество циклов амплификации, время элонгации, денатурации и отжига праймеров. В результате оптимизации подобрали одинаковую температуру отжига праймеров для всех локусов.

Количественную ПЦР-РВ амплификацию проводят на термоциклере, например, Bio-Rad CFX96 (USA), в соответствии с инструкциями производителя по следующей программе. Первичная денатурация: t=95°C в течение 3 мин. 40 циклов: t=95°C в течение 10 с, t=55°C в течение 30 с, t=72°C в течение 30 с.

Относительную копийность генетических локусов определяют по формуле rC=rC_{опухоль}/rC_норма=2^-ΔCt_{(опухоль)}/2^-ΔCt_(норма), где rC - относительная копийность гена, ΔCt - разность среднего значения сигналов флюоресценции (Ct) по трем повторам для гена мишени и среднего C_t по трем повторам для референсного гена: ΔC_t=C_t(ген мишень)-C_t(B2M).

Иммуногистохимическое исследование проводят на срезах парафиновых блоков, предназначенных для стандартного морфологического исследования, с помощью моноклональных антител к Ki67 и HER2

Депарафинизацию и дегидратацию парафиновых срезов выполняли по стандартной методике. "Демаскировку" антигенов проводили в PT-Link Thermo.

Согласно протоколу, вначале срезы подвергались предварительному нагреву до 65°C, далее происходило восстановление антигена в течение 20 минут при температуре 97°C и охлаждение до 65°C. После этого стекла промывали в течение 1-3 минут TBS-буфером (Dako) и помещали в автостейнер Thermo Scientific для окрашивания в автоматическом режиме. Визуализация иммуногистохимической реакции выполнялась с использованием системы детекции Reveal Polyvalent HRP-DAB Detection System.

Перед заключением покровных стекол под бальзам Bio-Mount срезы докрашивали гематоксилином Майера. Оценку результатов иммуногистохимической реакции проводили с применением светового микроскопа «Leica» (Германия) под увеличением ×10, ×20, ×40.

Приводим клинические примеры применения способа.

Пример №1

Больной Р., дата рождения 06.02.1950 г., госпитализирован в отделение абдоминальной онкологии №1 РНИОИ с верифицированным диагнозом рак желудка, ФГС - Cancer субкардиального отдела желудка. Атрофический анацидный (РН-5,0) Нр-не ассоциированный гастрит. Дуоденит.

При СРКТ органов грудной клетки, брюшной полости и малого таза перигастральных, периинтестинальных образований не выявлено. Легочная ткань - с обеих сторон в легких диффузный пневмосклероз, что позволило предположить до операции стадию II, T3NxM0.

19.11.2014 выполнена лапаротомия, гастрэктомия с расширенной лимфаденкэктомией. При макроскопическом исследовании в удаленном желудке обнаружена опухоль до 6 см в диаметре по малой кривизне, инфильтративно язвенного типа, увеличенные лимфоузлы вдоль левых желудочных сосудов (до 10).

Результаты оценки копийности целевых генов и параметров ИГХ в биоптате у данной пациентки: rC_NFKB1=0,95 и rC_HER2=2,6; уровень экспрессии в ядрах опухолевых клеток белка KI67_игх=59,5 и позитивная экспрессия HER2_игх (+++), находились в границах прогностического критерия развития метастазов.

По данным патоморфологического исследования после операции - аденокарцинома с изъязвлением инвазией всей толщи стенки желудка и подлежащей жировой ткани; в 1 из 10 лимфоузлов-метастаз аденокарциномы.

Таким образом, степень распространения процесса согласно классификации TNM соответствовала T3N1M0.

Пример №2

Больная П., дата рождения 20.05.1960 г., госпитализирована в отделении абдоминальной онкологии №1 РНИОИ 30.06.2015 г. с верифицированным диагнозом рак желудка. ФГДС - рак антрального отдела желудка, гистологическое исследование - малодифференцированная аденокарцинома. КТ брюшной полости и забрюшинного пространства: КТ-признаки диффузных изменений паренхимы печени по типу стеатоза, хронического холецистита, густой желчи в полости желчного пузыря, хронического панкреатита, признаков метастатического поражения не выявлено, что позволило предположить до операции стадию II, T3NxM0.

02.07.2015 была выполнена операция: дистальная субтотальная резекция желудка по Бильрот 2 с расширенной лимфаденэктомией. При макроскопическом исследовании в удаленной части желудка обнаружена опухоль в выходном отделе до 6 см в диаметре, инфильтративно-язвенного типа, на разрезе - белесоватого цвета, в большом и малом сальнике увеличенных лимфоузлов не выявлено.

Результаты оценки копийности целевых генов и параметров ИГХ в биоптате у данной пациентки: rC_NFKB1=0,65 и rC_HER2=1,0; уровень экспрессии в ядрах опухолевых клеток белка Ki 67_игх=26,2 и экспрессия HER2_игх негативная(-), находились в границах прогностического критерия отсутствия развития метастазов.

По данным патоморфологического исследования после операции - аденокарцинома с инвазией в клетчатку, метастазов опухоли в лимфоузлах нет. Таким образом, степень распространения процесса согласно классификации TNM соответствовала T4aN0M0.

Предлагаемым способом было осуществлено прогнозирование вероятности развития метастазов у 30 пациентов с диагностированной аденокарциномой желудка.

«Способ прогнозирования развития метастазов в регионарные лимфоузлы у пациентов с аденокарциномой желудка» позволяет с высокой точностью прогнозировать течение такого заболевания как аденокарцинома желудка. Заявляемый способ является экономически оправданным для уточнения особенностей течения заболевания и дает возможность скорректировать тактику лечения, осуществляется в условиях стандартной лаборатории молекулярной биологии и ИГХ, без использования специального дорогостоящего оборудования; обладает высокой чувствительностью, универсален, его осуществление возможно с операционными биоптатами, способ занимает менее 8 часов.