Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ В УСЛОВИЯХ РАДИАЦИОННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ

Изобретение относится к радиационной медицине и онкологии. Способ может быть использован для выявления пациентов с высоким риском развития злокачественных новообразований (ЗНО), в условиях хронического радиационного воздействия низкой интенсивности (в кумулятивной дозе до 1 Зв, низкая интенсивность - в соответствие с нормами радиационной безопасности НРБ-99 (не более 20 мЗв в год) СанПиН 2.6.1.2523-09), среди работников радиационно-опасных производств и населения, проживающего на радиоактивно-загрязненных территориях или территориях с высоким риском подобного загрязнения.

По данным Международного агентства по исследованию рака в 2000 г. злокачественными опухолями в мире заболели 10 млн. человек и умерли 8 млн. человек. По числу заболевших и умерших, на первом месте стоит рак легкого, далее в структуре заболеваемости злокачественными опухолями располагаются рак молочной железы (РМЖ), рак толстой кишки, рак желудка, рак печени (Заридзе Д.Г. Эпидемиология и скрининг злокачественных новообразований, 2002). В эпидемиологических исследованиях (Gilbert E.S. Invited Commentary: Studies of Workers Exposed to Low Doses of Radiation // American Journal of Epidemiology. 2001. Vol.53. N4. Р.319-322; Brenner D.J., Doll R., Goodhead D.T. et al. Cancer risks attributable to low doses of ionizing radiation: Assessing what we really know // PNAS. 2003. Vol.100. N24. P.13761-13766) показано существенное увеличение риска развития солидных опухолей при остром облучении в дозе 10-50 мЗв и при хроническом облучении уже в дозе 50-100 мЗв.

Усовершенствование методов генетического анализа и расшифровка человеческого генома сделали возможным определение индивидуальной генетической предрасположенности к развитию различных заболеваний, в том числе ЗНО, на основе межличностной вариации на уровне генома. Генетическая компонента подверженности, которая в значительной степени обуславливает риск развития заболевания, постоянна на всем протяжении жизни индивида и может быть диагностирована в любой момент, в том числе и задолго до проявления клинических симптомов заболевания. Определение наследственных генетических факторов предрасположенности позволит идентифицировать группы населения с высоким риском развития ЗНО. Генетическое тестирование не позволяет установить диагноз, а дает возможность выявить наличие неблагоприятных алеллей, что дает возможность на доклиническом этапе выявить существующие в геноме наследственные тенденции будущих болезней и, исходя из современного врачебного опыта, наметить пути их ранней профилактики.

Известен способ прогнозирования предрасположенности к раку легкого у лиц, проживающих в экологически неблагоприятных условиях. У лиц, проживающих в экологически неблагоприятных условиях, исследуют наличие генетического маркера иммуноглобулина Gml в сыворотке крови методом торможения агглютинации эритроцитов с последующей микроскопической оценкой. При наличии генетического маркера иммуноглобулина Gml(+) прогнозируют предрасположенность к развитию рака легкого, а при наличии генетического маркера иммуноглобулина Gml(-) - прогнозируют резистентность к развитию рака легкого. (RU, патент №2260799, G01N 33/48 опубл. 2005.09.20). Относительный риск развития рака легкого невысокий и составил RR (95% CI)=1,44(1,15-1,81).

Основным недостатком этого способа является отсутствие явной взаимосвязи исследуемого маркера с патогенезом ЗНО и, как следствие этого, низкая точность анализа.

Следующими известными способами определения предрасположенности к развитию рака являются способы, на основе определения герминальных мутаций: в гене NBS1 (US, №7,319,007, January 15, 2008) к раку предстательной железы или раку молочной железы (РМЖ), в гене циклин-зависимой киназы - CDKA (US, №5,714,329, February 3, 1998) к меланоме, в генах BRCA 1 и 2 (US, №6,733,966, May 11, 2004) к РМЖ и раку яичников. Несмотря на то, что мутации в этих генах имеют высокую пенетрантность и конкордантность при семейных формах рака, их низкая частота встречаемости в популяциях - около 0,002% (Steven A. Narod and William D. Foulkes. BRCA1 and BRCA2: 1994 and beyond. // Nature Reviews. Cancer. Vol.4, Sep. 2004 665-676) делают приемлемым эти тесты только в отношении ЗНО данных локализаций с выраженным семейным анамнезом и не приемлемыми для скрининговых исследований. Кроме того, в предложенных способах не учитывается влияние факторов внешней среды, а, как известно, онкологические заболевания по своей природе являются мультифакториальными и 80% злокачественных опухолей формируются в результате комплексного воздействия экзогенных и эндогенных факторов.

Учитывая то, что риск развития ЗНО является функцией экспозиции к факторам внешней среды, таких как ИИ, химические канцерогены, стиль жизни, и генетических факторов, определяющих индивидуальные особенности реакции на внешние воздействия, альтернативным подходом к прогнозированию генетической предрасположенности к развитию ЗНО является определение полиморфных вариантов, так называемых генов-модификаторов, эффект которых во многом определяется средовыми факторами (Баранов B.C., Баранова В.Е., Иващенко Т.Э., Асеев М.В. Геном человека и гены «предрасположенности»: (Введение в предиктивную медицину) / - Спб.; Интермедика, 2000. - 272 с, Колчанов Н.А., Ананько Е.А., Колпаков Ф.А. и др. Генные сети. // Мол. Биология. - 2000. - №4. - С.38-51.) и генов, продукты которых участвуют в патогенезе ЗНО. Эти гены имеют низкую пенетрантность, но частота встречаемости полиморфных вариантов этих генов в популяции может достигать высоких значений.

Известен способ определения генетической предрасположенности к онкологическим заболеваниям по генетическим полиморфизмам генов глутатион-S-трансфераз (GST) (Habdous M, Siest G, Herbeth В, Vincent-Viry М, Visvikis S. Glutathione S-transferases genetic polymorphisms and human diseases: overview of epidemiological studies. // Ann. Biol. Clin. (Paris). 2004 Jan-Feb; 62(1):15-24). Способ основан на генотипировании полиморфизма генов GSTT1 (+/-), GSTM1 (+/-). Продукт гена GSTT1 участвует в очистке организма от многих ксенобиотиков (в частности, хлорметанов и других промышленных канцерогенов). Продукт гена GSTM1 играет существенную роль в инактивации электрофильных органических веществ. Как показал мета-анализ в случае делеции гена GSTM1 или/и GSTT1 увеличивается риск развития рака легкого OR (95% CI)=1,17(1,07-1,27), гортани OR (95% CI)=1,44(1,23-1,68), мочевого пузыря OR (95% CI)=1,42(1,10-1,84), астроцитомы OR (95% CI)=2,36(1,41-3,94) поскольку значительно снижается способность организма избавляться от некоторых вредных соединений.

Недостатком известного способа является то, что для этих генов не показано потенциальное взаимодействие между GST генотипом и внешнесредовыми факторами и, в частности, при условиях длительного воздействия на организм одного из факторов канцерогенеза - ионизирующего излучения. Это ограничивает возможность его использования для выявления групп лиц с высоким риском развития ЗНО среди работников ядерно- и радиационно-опасных производств, а также населения, проживающего на радиоактивно-загрязненных территориях.

Наиболее близким к заявляемому способу, является способ прогнозирования развития рака молочной железы у рентгенрадиологов, которые подвергаются техногенному радиационному воздействию низкой интенсивности, по полиморфизму rs5275 гена PTGS2, кодирующего фермент циклооксигеназу-2 (СОХ-2). Этот фермент повышен в инвазивно-протоковых опухолях молочной железы и связан с рецепторным статусом опухоли (Schonfeld S.J., Bhatti P., Brown E.E., Linet M.S., Simon S.L., Weinstock R.M., Hutchinson A.A., Stovall M., Preston D.L., Alexander B.H., Doody M.M., Sigurdson A.J. Polymorphisms in oxidative stress and inflammation pathway genes, low-dose ionizing radiation, and the risk of breast cancer among US radiologic technologists. // Cancer Causes Control. 2010 November; 21(11):1857-1866. Published online 2010 August 15. doi: 10.1007/s10552-010-9613-7). Данный способ выбран в качестве прототипа. В приведенном способе прогнозирования РМЖ показано, что у носителей мутантного GG генотипа относительный риск развития рака молочной железы на 1 Гр OR (EOR)/Gy составил 5.5 (95% CI 1.2-12.5), для гетерозиготного генотипа EOR/Gy<0 (95% CI<0-3.8) and EOR/Gy<0 (95% CI<0-14.8) для гетерозиготного GC и дикого СС генотипов (р=0.04).

Недостатком известного способа является то, что установлено только связь с риском развития рака молочной железы, а другие локализации, в частности прогнозирование развития ЗНО, не учитываются. Кроме того, показан достаточно низкий уровень относительного риска OR(95% CI) развития рака молочной железы для носителей мутантного GG rs5275 гена PTGS2 на уровне 5.5 (1.2-12.5), что говорит о низкой пенетрантности выявленного генотипа для развития рака молочной железы в условиях облучения.

Задача заявляемого изобретения состоит в прогнозировании развития ЗНО с различной степенью риска в условиях длительного радиационного воздействия низкой интенсивности.

Поставленная задача решается тем, что, как и в прототипе, проводят генотипирование способом ПЦР в режиме реального времени, в отличие от прототипа проводят генотипирование полиморфных вариантов генов: GSTM1(+/-), XRCC1 280G>A, XPD1751A>С, hOGG1 326 C>G, CYP2C19681G>A, NOS3 VNTR, NOS3 774C>T, при этом используют системы праймеров и аллельспецифичные линейно-разрушаемые зонды (TaqMan), слюну обследуемых, выявляют комбинацию генотипов XRCC1280(GG) hOGG 326(CC/CG) XPD1 751(AA) GSTM1(-) NOS3 774(TT/CT) или носительство любого из мажорных генотипов XRCC1 280G>A, XPD1 751А>С, hOGG1 326 C>G, CYP2C19 681G>A и NOS3 VNTR. Для генотипирования этих полиморфизмов авторами заявленного способа разработана и впервые применена система праймеров и аллельспецифичных линейно-разрушаемых зондов (TaqMan) в прогнозировании развития ЗНО с различной степенью риска в условиях длительного радиационного воздействия низкой интенсивности.

Определяющим отличием, представленного на рассмотрение способа, по сравнению с прототипом является то, что выявлена ассоциация комплекса полиморфизмов генов: XRCC1 280G>A, XPD1 751А>С, hOGG1 326 C>G, GSTM1 (+/-), CYP2C19 681G>A, NOS3 VNTR, NOS3 774C>Т с риском развития злокачественных новообразований всех локализаций в условиях длительного радиационного воздействия низкой интенсивности, и предложено использование этого комплекса для выявления генетической предрасположенности к развитию злокачественного новообразования всех локализаций в данных условиях. При выявлении у обследуемых комбинации генотипов XRCC1 280(GG) hOGG1 326(CC/CG) XPD1 751(АА) GSTM1(-) NOS3 774(ТТ/СТ) прогнозируют высокий риск развития ЗНО, и OR(95%CI) развития ЗНО у носителей этой комбинации генотипов составляет 24,14 (3,21-502,64), при р=0,0000581, что почти в 5 раз выше, чем в прототипе и свидетельствует о высокой пенетрантности данной комбинации (для сравнения в прототипе OR(95%CI) составляет 5,5(1,2-12,5) для носителей мутантного GG rs5275 гена PTGS2). Кроме того, для генотипирования при помощи ПНР в режиме реального времени применяют лиофилизированные смеси с системой праймеров и аллельспецифичных линейно-разрушаемых зондов (TaqMan), которые является собственной разработкой СБНЦ и в качестве матрицы для ПЦР - биологическая среда организма - слюна обследуемых, что позволяет провести тестирование в течение 2 часов и даже в экспедиционных условиях.

Для выявления лиц с невысоким риском развития ЗНО определяют носительство любого из мажорных генотипов XRCC1 280G>A, XPD1 751А>С, hOGG1 326 C>G, CYP2C19 681G>A и NOS3 VNTR.

Для отбора указанных генотипов и алеллей были экспериментально изучены 13 полиморфоных вариантов генов предрасположенности к ЗНО, взятых из литературных данных и из них путем исследований отобраны те генотипы и аллели, для которых имеются статистически значимые отличия в частоте встречаемости в группе облученных больных ЗНО и отсутствуют статистически значимые отличия в группе не облученных больных ЗНО, по сравнению с группой здоровых (без ЗНО) облученных лиц. Комбинация генотипов генов-предрасположенности была установлена из условия, что ее носители встречаются в группе облученных больных ЗНО и практически не встречаются в группе не облученных больных ЗНО и в группе здоровых.

Способ осуществляют следующим образом: на первом этапе у обследуемых собирают слюну, в объеме ~50-100 мкл в отдельные пробирки. Далее проводят генотипирование, при помощи ПЦР в режиме реального времени, полиморфных вариантов генов: XRCC1 280G>A, XPD1 751А>С, hOGG1 326C>G, GSTM1(+/-), CYP2C19 681G>A, NOS3 VNTR, NOS3 774C>Т с использованием лиофилизированных смесей с системой праймеров и аллельспецифичных линейно-разрушаемых зондов (TaqMan), которые является собственной разработкой СБНЦ, используя в качестве матрицы в ПЦР, 2 мкл слюны обследуемых. Такой режим работы позволяет провести тестирование в течение 2 часов и даже в экспедиционных условиях. Если у исследованных лиц выявляется комбинация генотипов XRCC1 2SO(GG) hOGG1 326(CC/CG) XPD1 751(АА) GSTM1(-) NOS3 774(ТТ/СТ), то с высоким уровнем значимости (р=0,0000581) прогнозируют развитие злокачественных опухолей с высоким риском (OR (95% CI)-24,14 (3,21-502,64)). Если выявляют носительство любого из мажорных генотипов XRCC1 280G>A, XPD1 751A>C, hOGG1 326C>G, CYP2C19 681G>A и NOS3 VNTR, то у индивидов прогнозируют развитие злокачественных опухолей с невысоким риском OR 1,79-2,95. Определение генетически детерминированного риска развития ЗНО в условиях длительного радиационного воздействия низкой интенсивности, обусловленного наличием мажорных генотипов перечисленных генов или представленной комбинации генотипов, может быть выполнено в любом возрасте, начиная с пренатального периода.

Изобретение иллюстрируется следующим примером конкретного выполнения

Первую опытную группу составили 96 больных ЗНО работников основного производства Сибирского химического комбината (СХК) (77 мужчин и 18 женщин), которые подвергались длительному радиационному воздействию внешнего γ-излучения низкой интенсивности. Медиана кумулятивной дозы в опытной группе составила 71,3 мЗв, размах - 0,11-1631,07 мЗв и не отличалась от дозы γ-излучения в контрольной группе. Средний возраст больных составил - 64,97±7,10 года и стаж работы - 34,02±9,67 года (табл.1).

Вторую группу сравнения составили 135 больных ЗНО работников вспомогательных производств СХК (82 мужчины и 53 женщины). В процессе профессиональной деятельности они не подвергались воздействию γ-излучения. Группа сравнения не отличалась от контрольной и опытной по климатологическим, социальным условиям, по возрасту и стажу работы не отличалась от опытной группы (табл.1).

Третью - контрольную группу составили 148 практически здоровых работников основного производства Сибирского химического комбината (СХК), в том числе 103 мужчины и 45 женщин. Обследованные люди в процессе профессиональной деятельности подвергались долговременному радиационному воздействию внешнего γ-излучения. Медиана кумулятивной дозы в контрольной группе составила 74,0 мЗв, размах - 0,11-1631,07 мЗв. Средний возраст обследованных составил - 51,64±8,64 года и стаж работы - 26,44±9,42 года (табл.1).

Среди обследованных больных ЗНО было 33 - больных раком предстательной железы (РПЖ), 31 - раком желудка (РЖ), 19 - раком легкого (РЛ), 20 - раком почки, 22 - раком молочной железы (РМЖ), 24 - раком кишечника (РК) и 3 - раком печени, 15 - раком кожи, 21 - ЗНО головы и шеи, 8 - раком мочевого пузыря 35 - больных ЗНО других локализаций

Материалом для исследования служила геномная ДНК, выделенная из лейкоцитов периферической крови с помощью протеиназы К с последующей фенольно-хлороформной экстракцией и осаждением этанолом.

Обследованные индивиды были прогенотипированы по 13 полиморфизмам генов ферментов репарации ДНК (hOGG1 326C>G, XPD1 751А>С, XPG1 1104G>C, XRCC1 194C>Т, 280A>G, 399G>A), биотрансформации ксенобиотиков (GSTT1 (+/-), GSTM1 (+/-), CYP2C19 681G>A), метаболизма оксида азота (NOS3 691C>Т, 774С>Т, 894G>T, VNTRint4) (табл.2). Для типирования использована ПНР в режиме реального времени с применением лиофилизированных смесей с системой праймеров и аллельспецифичных линейно-разрушаемых зондов (TaqMan).

Для оценки ассоциации генотипов по исследованным генам с риском ЗНО использовали расчет отношения шансов (OR) с 95% доверительным интервалом (CI). Проверку статистической значимости ассоциации проводили с помощью критерия χ² Пирсона с поправкой Йетса на непрерывность (Флейс Дж. Статистические методы для изучения таблиц долей и пропорций. М.: Финансы и статистика, 1989. - 319 с).

Результаты проведенного исследования представлены в таблице 3.

Ассоциации с ЗНО в условиях облучения выявлены для полиморфизмов генов XRCC1 280G>A, XPD1 751А>С, hOGG1 326C>G, CYP2C19 681G>A и NOS3 VNTR. У носителей мажорного (GG) генотипа гена XRCC1 280G>A риск развития ЗНО в условиях долговременного радиационного воздействия внешнего γ-излучения низкой интенсивности составляет OR (95% CI)=2,79(1,09-7,42), частота встречаемости GG генотипа в опытной группе облученных больных ЗНО составляет 87/94 (92,55%), в то время как в контрольной группе здоровых - 116/142 (81,69%), а в группе сравнения не облученных больных ЗНО - 120/134 (89,55%). Различия статистически значимы (р=0,0304) между опытной группой (1) облученных больных ЗНО и контрольной группой (3) здоровых (табл.3), но не между группой сравнения (2) не облученных больных ЗНО и контрольной группой (3) здоровых. Аналогичные данные получены и для других полиморфных вариантов генов. У носителей мажорного генотипа XPD1 751(АА) риск развития ЗНО в условиях радиационного воздействия составляет OR (95% CI)=1,79(1,02-3,13). У носителей мажорного генотипа hOGG1 326(СС) риск развития ЗНО в условиях радиационного воздействия составляет OR (95% CI)=1,88 (1,03-3,43). У носителей мажорного генотипа CYP2C19 681(GG) риск ЗНО в условиях радиационного воздействия составляет OR (95% CI)=2,95 (1,34-6,55) (табл.3). У облученных работников СХК-больных ЗНО частота минорного (АА) генотипа гена NOS3 достоверно снижена, по сравнению со здоровыми (р=0,0498) и уменьшен риск возникновения ЗНО (OR (95% CI)=0,37 (0,13-1,00) (табл.3). Была показана ассоциация с риском развития ЗНО и в условиях облучения, и без облучения у носителей делеции гена GSTM1(-), мажорного генотипа гена GSTT1(-), мажорного (GG) генотипа гена XRCC1 399G>A и носителей минорного (Т) алелля гена NOS3 774C>Т. У носителей этих генотипов и алеллей риск развития ЗНО повышен и OR составляет от 1,83 до 3,51.

На основании проведенного исследования была впервые отобрана 1 комбинация, состоящая из генотипов 5 изученных полиморфных вариантов генов: XRCC1 280(GG) hOGG1 326(CC/CG) XPD1 751(АА) GSTM1(-) NOS3 774(ТТ/СТ), 3 из которых ассоциированы с риском развития ЗНО в условиях облучения и 2 - с риском развития ЗНО и в условиях облучения и без облучения. Частота встречаемости подобной комбинации в опытной группе облученных больных ЗНО работников СХК составляет 14/83 (16,87%), в группе сравнения не облученных больных ЗНО составляет 1/100 (1%) и в группе здоровых работников СХК составляет 1/119 (0,84%). У носителей подобной комбинации генотипов в условиях длительного радиационного воздействия низкой интенсивности более чем в 20 раз увеличивается риск развития ЗНО (OR (95% CI)-24,14 (3,21-502,64)) с высоким уровнем значимости (р=0,0000581) (табл.4).

Заявленное изобретение позволит провести тестирование в течение 2-х часов и даже в экспедиционных условиях, может быть использовано для выявления групп лиц с высоким риском развития ЗНО среди работников ядерно- и радиационно-опасных производств и населения, проживающего на радиоактивно-загрязненных территориях или территориях с высоким риском подобного загрязнения. В качестве дополнительного прогностического теста изобретение может быть использовано в процедурах отбора персонала для работы на производствах, деятельность на которых связана с долговременным профессиональным контактом с источниками ИИ. Если у исследованных лиц выявляется комбинация генотипов XRCC1 280(GG) hOGG1 326(CC/CG) XPD1 751(AA) GSTM1(-) NOS3 774(TT/CT), то им будет рекомендовано не работать на ядерно- и радиационно-опасных производствах атомной промышленности и энергетики, поскольку у носителей подобной комбинации генотипов более чем в 20 раз увеличивается риск развития ЗНО в условиях долговременного профессионального облучения.