Результат интеллектуальной деятельности: Средство снижения нейропатической боли

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и может быть использовано для снижения болевой чувствительности организма как при применении индивидуальной композиции алкил-глицериновых эфиров (АГЭ), так и в сочетании с другими веществами, обладающими биологическим действием.

В мировой практике в качестве антиболевых (анальгетических) средств используют наркотические анальгетики (I), а также ненаркотические анальгетики и нестероидные противовоспалительные средства (II) (Машковский М.Д. Лекарственные средства. Пособие для врачей. 16-е изд., 2012. М: Новая волна. С. 148-187).

I группа включает такие известные природные соединения как морфин, кодеин и др. их синтетические аналоги – промедол, трамадол и др.

При активации опиоидного рецептора ингибируется аденилатциклаза, которая играет важную роль при синтезе вторичного посредника цАМФ (cAMP), а также осуществляется регулирование работы ионных каналов. Закрытие потенциал-зависимых кальциевых каналов в пресинаптическом нейроне приводит к уменьшению выброса возбуждающих нейромедиаторов (таких как глутаминовая кислота), а активация калиевых каналов в постсинаптическом нейроне приводит к гиперполяризации мембраны, что уменьшает чувствительность нейрона к возбуждающим нейромедиаторам (Alan F. Schatzberg,Charles B. Nemeroff. The American Psychiatric Publishing Textbook of Psychopharmacology. — The American Psychiatric Publishing, 2009. — С. 32).

Нейрофизиологические исследования свидетельствуют об угнетении наркотическими анальгетиками таламических центров болевой чувствительности и блокировании передачи болевых импульсов к коре большого мозга. Этот эффект является, по всей вероятности, ведущим в физиологическом механизме действия анальгетиков данной группы.

II группа – ненаркотические анальгетики – синтетические производные салициловой кислоты, пиразолона, анилина и др. соединений.

Ацетилсалициловая кислота является ингибитором циклооксигеназы (ЦОГ) — фермента, участвующего в синтезе простагландинов и тромбоксанов и действует так же, как и другие нестероидные противовоспалительные препараты (в частности, диклофенак и ибупрофен).

Простагландины являются медиаторами с выраженным физиологическим эффектом («The Eicosanoids» // Ed.: Peter Curtis-Prior. 2004, Wiley. 654 p.). Несмотря на то что простагландины не являются медиаторами боли, данные соединения повышают чувствительность ноцицептивных рецепторов (сенсибилизируют их) к медиаторам боли, в частности к гистамину и брадикинину. Нестероидные противовоспалительные средства, блокируя фермент циклооксигеназу (ЦОГ), снижают выработку простагландинов, препятствуя развитию воспалительного процесса и болевых ощущений.

Таким образом, анальгетическое действие современных препаратов основано на связывании с опиоидными рецепторами или на ингибировании ферментативных систем в каскаде арахидоновой кислоты. Однако существующие группы лекарственных препаратов в большинстве случаев недостаточно эффективны в облегчении болевых симптомов, в частности при нейропатической боли, вызванной первичным повреждением нервной ткани. В связи с этим поиск новых анальгетиков, задействующих и другие биохимические механизмы, является одной из приоритетных задач медицины.

Задача, решаемая изобретением, – это создание новых эффективных антиболевых (анальгетических) средств, в частности применение алкил-глицериновых эфиров в качестве средства, снижающего нейропатическую боль.

Интерес к алкил-глицериновым эфирам проявили в 50-х годах прошлого века шведские ученые под руководством Astrid Brohult (Brohult A., Holmberg J. «Alkylglycerols in the treatment of leucopenia caused by irradiation» // Nature. – 1954. – Vol. 174. – P. 1102-1103). Было показано их активное влияние на сосудистую систему и гемопоэз, иммунный ответ и связанные с этим терапевтические возможности. Приведены результаты успешного применения алкил-глицеринов при онкологических заболеваниях, лучевых поражениях, иммунодефицитных состояниях, инфекционных патологиях и др. Позднее другие исследователи обнаружили проникновения их через гематоэнцефалический барьер и открывающиеся в связи с этим возможности (Латышев Н.А., Касьянов С.П., Блинов Ю.Г. Алкил-глицериновые эфиры морских организмов: структура распределение и биологическая активность // Известия ТИНРО, 2012. Т. 169. С. 261-277).

Как показали множественные работы, алкилсодержащие липиды значительно активизируют цитотоксические макрофаги, что приводит к усилению Fc-рецепторного фагоцитоза естественных киллеров, макрофагов и нейтрофилов. Кроме того, АГЭ ингибируют изоформы протеинкиназы С, что имеет большое значение для ряда различных клеточных процессов, включая регулирование клеточной адгезии, рост и дифференцировку клеток, развитие опухолей.

В последнее десятилетие большинство исследователей рассматривают липиды с простой эфирной связью в качестве средств лечения и профилактики нейродегенеративных заболеваний – болезней Альцгеймера, Паркинсона и др. - наиболее распространённых форм деменции. АГЭ при этом рассматриваются как предшественники для синтеза в организме физиологически активных плазмалогенов.

Сведений о проявлении алкил-глицериновыми эфирами (АГЭ) антиболевого эффекта для снятия нейропатической боли из уровня техники заявителем не найдено,

на фиг. 1, приведены структурные формулы АГЭ.

Нейропатическая боль, проявляемая рядом сенсорных симптомов, часто сопровождается нарушениями высшей нервной деятельности – ухудшением памяти, депрессией, беспокойством, ангедонией и т.д. Это подчеркивает участие супраспинальных структур, включая гиппокамп, в патогенезе нейропатической боли. В настоящей заявке рассматривается нейропатическая боль, сопровождаемая активацией микроглии и изменениями нейрогенеза в гиппокампе, а также анализируется влияние АГЭ на последствия нейропатической боли в гиппокампе.

Нейропатическая боль - это состояние, возникающее при поражении соматосенсорной нервной системы вследствие различных заболеваний центральной и периферической нервной системы. Нейропатическая боль проявляется в разнообразной комбинации положительных (аллодиния, гипералгезия) и отрицательных (гипоэстезия) сенсорных симптомов. Пациентов с невропатической болью трудно лечить, и не всегда возможно облегчить болевой синдром. Этот тип боли не поддается лечению традиционными анальгетиками, такими как наркотические анальгетики и нестероидные противовоспалительные препараты. В настоящее время, отсутствуют эффективные средства для облегчения нейропатической боли. Современные терапевтические стратегии нейропатической боли направлены на снижение возбудимости нейронов в периферической нервной системе или центральной нервной системе (ЦНС) путем модуляции активности ионных каналов (габапентин, прегабалин, карбамазепин, лидокаин и капсаицин) или путем усиления эндогенных ингибирующих механизмов (трициклические антидепрессанты, дулоксетин и опиоиды) (Scholz, J., and Woolf, C. J. The neuropathic pain triad: neurons, immune cells and glia. Nat. Neurosci., 10(11), 1361-1368, 2007). Учитывая участие иммунных клеток и глии в патогенезе нейропатических болей, разработка терапевтической стратегии, направленной на иммунную реакцию, модуляцию глиальных функций, является важным этапом в лечении нейропатической боли.

Многообещающей группой соединений, способных влиять на состояние микроглии, являются алкил-глицериновые эфиры (АГЭ), полученные из морских организмов. В настоящей заявке рассматривается нейропатическая боль, связанная с активацией микроглии и изменениями нейрогенеза гиппокампа, а также тестирование влияния АГЭ на интенсивность нейропатической боли и ее когнитивные последствия.

В экспериментах для доказательства проявления алкил-глицериновыми эфирами антиболевого эффекта, направленного на снижение нейропатической боли, использовались нижеописанные животные, у которых моделировали нейропатическую боль.

Средства и методы исследования.

Животные и хирургия

Эксперименты проводили с использованием 3-месячных самцов мыши линии C57BL/6. Животных размещали от двух до четырех на клетку с 12-часовым темно-световым циклом и свободным доступом к пище и воде. Чтобы уменьшить стресс, мышей приручали в течение 5 минут один раз в день в течение пяти последовательных дней перед экспериментами. Все процедуры были одобрены Комитетом по этике при «Национальном научном центре морской биологии» Дальневосточного отделения Российской академии наук. Нейропатическую боль моделировали с использованием модели хронического повреждения (CCI) седалищного нерва (Bennett G.J., Xie Y.K. (1988) A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain 33(1):87-107). Животных анестезировали пентобарбиталом натрия (50 мг/кг, внутрибрюшинно), затем левый седалищный нерв перевязывали с помощью 3 свободных лигатур, расположенных на расстоянии 1 мм друг от друга. В качестве контроля выступали ложнооперированные животные (ЛО) без перевязки нерва.

Приготовление алкил-глицериновых эфиров (препарат АГЭ)

Пищеварительная железа командорского кальмара Berryteuthis magister была получена из Находкинской базы активного морского рыболовства (Россия) и хранилась при -20⁰C. Экстракция общего количества липидов проводилась в соответствии с методикой Блай и Дайер (Bligh, E.G., Dyer, W. J. (1959). A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian J. of Biochem. Physiol., 37, 911-917). Омыление липидов проводили по обычной схеме (Christie, W. W. (2003). Lipid analysis: isolation, separation, identification and structural analysis of lipids / Ed. Christie W.W. Bridgwater: Oily Press. 432 p.). Липидную смесь после гидролиза и подкисления растворяли в ацетоне в соотношении 1 : 5, об./об., при комнатной температуре и выдерживали в течение 24 часов при -20° C (Ermolenko E.V., Latyshev N.A., Sultanov R.M., Kasyanov S.P. (2016). Technological approach of 1-O-alkyl-sn-glycerols separation from Berryteuthis magister squid liver oil. J. Food Sci. Technol. 53, 1722-1726). Перекристаллизация полученного осадка проводилась для полного отделения АГЭ от других липидов.

Содержание АГЭ в полученном продукте составляло более 99%, когда основным компонентом был химиловый спирт - 94% приведено в табл.

Лечение животных

АГЭ вводили мышам в виде водной эмульсии в дозе 250 мг/кг с использованием метода перорального введения зондом. Период введения составлял 2 недели со дня операции.

По окончании лечения на мышах проводили поведенческие тесты, по которым оценивались поведенческие эффекты введения АГЭ при развитии нейропатической боли. Тестирование поведенческих параметров проводилось перед выведением животных из эксперимента на 14-й и 28-й день после операции, а тестирование тепловой аллодинии проводили еженедельно.

Статистический анализ

Данные экспериментов подвергались статистическому анализу с использованием однофакторного дисперсионного анализа. p≥0,05 было принято, как статистически достоверное. Все статистические тесты выполнялись с использованием программного обеспечения Microsoft Excel. Результаты представлены как среднее±среднеквадратичное отклонение. «N» представляет количество животных для поведенческих тестов, иммуногистохимического и иммуноферментного анализа.

Изобретение иллюстрируется следующими фигурами:

на фиг. 1 приведены структурные формулы АГЭ;

на фиг. 2. представлены поведенческие эффекты лечения АГЭ при развитии нейропатической боли, где 2A. Динамика тепловой аллодинии: продолжительность подъема задней лапы над горячей пластиной (+ 48°C) за 1 мин. Среднее ± среднеквадратичное отклонение, n = 7 на группу, * p <0,05, ** p <0,01; 2Б. Спонтанная локомоторная активность в «открытом поле». Среднее ± среднеквадратичное отклонение, n = 7 на группу, * p <0,05, ** p <0,01. 2В. Рабочая память в Y-лабиринте. Среднее ± среднеквадратичное отклонение, n = 7 на группу, * p <0,05, ** p <0,01;

на фиг. 3. показаны пролиферирующие клетки и незрелые нейроны в зубчатой извилине гиппокампа, где 3A. Гистограмма, показывающая изменения количества пролиферирующих клеток (PCNA) в группах ЛО, CCI и CCI + АГЭ. Среднее ± среднеквадратичное отклонение, n = 7 на группу, * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. 3Б. Гистограмма, показывающая изменение числа незрелых нейронов (даблкортин) в зубчатой извилине в группах ЛО, CCI и CCI + АГЭ. Среднее ± среднеквадратичное отклонение, n = 7 на группу, * p <0,05. 3В. Репрезентативные изображения экспрессии PCNA. На 3Г приведены изображения даблкортина в субгранулярной зоне зубчатой извилины гиппокампа в группах ЛО, CCI и CCI + АГЭ. Шкала: 500 микрон;

на фиг. 4. показано влияние CCI и введения АГЭ на активацию микроглии, где 4A. Гистограмма плотности (клеток / мм³) Iba1-позитивных клеток в CA1 области гиппокампа на 14 и 28 день после операции. Среднее ± среднеквадратичное отклонение, n = 7 на группу, * p <0,05, *** p <0,001. 4Б. Гистограмма плотности (клеток/мм³) CD86-позитивных клеток в CA1 области гиппокампа на 14 и 28 день после операции. Среднее ± среднеквадратичное отклонение, n = 7 на группу, *** p <0,001. 4В. Репрезентативные фотографии Iba1-иммуногистохимически окрашенных срезов. 4Г. Репрезентативные фотографии CD86-иммуногистохимически окрашенных срезов. Шкала: 100 микрон;

на фиг.5 показано влияние CCI и введения АГЭ на экспрессию цитокинов гиппокампа, где 5A. Гистограмма экспрессии Il-1β в гиппокампе. Среднее ± среднеквадратичное отклонение, n = 7 на группу, * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. 5Б. Гистограмма экспрессии Il-10 в гиппокампе. Среднее ± среднеквадратичное отклонение, n = 7 на группу, ** p <0,01, *** p <0,001.

В табл. приведен состав индивидуальных алкил-глицериновых эфиров используемого препарата.

Эксперимент 1. Исследование тепловой аллодинии

Гипералгезический ответ на горячую пластину считается результатом комбинации центральных и периферических механизмов и отражает болевую чувствительность (Kanaan, S. A., Saadé, N. E., Haddad, J. J., Abdelnoor, A. M.,Atweh, S. F., Jabbur, S. J., Safieh-Garabedian, B. Endotoxin-induced local inflammation and hyperalgesia in rats and mice: a new model for inflammatory pain. Pain, 66(2), 373-379, 1996). Термическую аллодинию измеряли с использованием теста на пластине (Cold / Hot Plate Analgesia Meter No.05044 Columbus Instruments, США). Испытание проводили в камере с 30-сантиметровыми акриловыми стенками на металлической пластине 30×30 см. Температура горячей пластины составляла +48°С, а время тестирования – 60 с. Мышей помещали на горячую пластину, и регистрировали время, в течение которого поврежденная лапа находилась над пластиной. Ложнооперированные животные способны выдерживать длительное воздействие этой температуры, при этом все лапы опираются на пластину. Время контакта конечности с горячей пластиной значительно уменьшается при повреждении нерва. Все функциональные тесты выполнялись ежедневно после введения вещества, и каждое животное тестировалось три раза с интервалом в 5 мин между измерениями.

Измерение тепловой аллодинии не показало значительного увеличения общего времени подъема задней лапы в группе «CCI» на 7-й день после операции по сравнению с ЛО мышами (2,68±1,57 сек vs 0,58±0,3 сек, p = 0,18). Этот параметр резко увеличился на 14 день после операции и достиг значения 10,7±2,93 сек на 28 день у животных с нейропатической болью. В группе CCI + АГЭ этот показатель несколько увеличился с 7 по 28 день после операции и достиг значения 4,03±1,34 секунды, что свидетельствует о значительных различиях с группой CCI (p=0,039) (фиг. 2А).

По результатам эксперимента после введения препарата АГЭ наблюдается снижение болевой чувствительности у мышей с нейропатическим болевым синдромом.

Эксперимент 2. Спонтанная локомоторная активность

Локомоторную активность оценивали, помещая мышь в центр круглой арены (60 см в диаметре, высота 40 см) и оставляя на 5 минут. Площадь арены была разделена на 37 квадратов. Поведение мыши непрерывно записывалось видеокамерой, расположенной над аппаратом. Оценка локомоторной активности проводилась путем подсчета пересеченных квадратов.

Как видно из результатов тестирования, представленных на фиг. 2Б, спонтанная локомоторная активность у мышей с синдромом нейропатической боли повышается на 14 день после операции. Лечение АГЭ почти полностью нормализовало локомоторную активность у мышей с CCI (фиг. 2Б).

Таким образом, следует сделать вывод, что введение АГЭ животным с нейропатической болью нормализует нарушенную локомоторную активность.

Эксперимент 3. Рабочая память

Рабочая память экспериментальных животных изучалась методом тестирования в Y-лабиринте. Y-лабиринт представляет собой устройство с тремя равными рукавами (длина 30 см, ширина 10 см и высота 20 см), изготовленными из непрозрачного акрилового стекла. Мышь помещали в центр лабиринта и оставляли на 5 минут. Выбор рукава мышью фиксировался, когда мышь входила в него всеми четырьмя лапами. Оценивалось общее количество входов (N) и количество «правильных» альтернаций (M, последовательный выбор трех неповторяющихся рукавов). Коэффициент спонтанных альтернаций рассчитывали по формуле: R (%) = M * 100 / (N-2).

Рабочая память оценивалась путем измерения коэффициента спонтанных альтернаций в Y-лабиринте. Показатель был значительно ниже у CCI-мышей, получавших плацебо, чем у ЛО животных через 14 и 28 дней после операции (p<0,01), что отражает ухудшение рабочей памяти при развитии нейропатической боли. Лечение животных АГЭ предотвращало снижение скорости спонтанных альтернаций, демонстрируя значительные различия между группами CCI и CCI+АГЭ (p<0,05) (фиг. 2В).

Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что введение АГЭ предотвращает развитие нарушений рабочей памяти, наблюдаемых при нейропатической боли.

Эксперимент 4. Иммуногистохимическое исследование нейрогенеза и активности глиальных клеток в гиппокампе животных

Эксперимент 4а. Исследование нейрогенеза

Сбор материала для последующего иммуногистохимического исследования проводился на 14-й день и 28-й день после операции. Мышей анестезировали передозировкой тиопентала натрия и транскардиально перфузировали 100 мл ледяного физраствора (~ 4°C), а затем 100 мл холодного фиксатора (4% параформальдегида в 0,1 М фосфатном буфере), pH=7,2. Далее материал постфиксировали в течение 12 ч при 4°С в свежем буферизованном 4%-ом параформальдегиде. Образцы тканей заливали в парафиновые блоки и изготавливали срезы толщиной 10 мкм. Сагиттальные парафиновые срезы после депарафинизации инкубировали в 3%-м расвором перекиси водорода для блокирования эндогенной пероксидазы. После трех промывок в 0,1 М фосфатном буфере (рН=7,2) срезы обрабатывали в течение 60 мин в 2%-м растворе бычьего сывороточного альбумина (Santa Cruz, SC-2323, США) и 0,25% Triton X-100 (Gerbu, США). Срезы инкубировали с первичными антителами на стекле во влажной камере при 4°С в течение 24 часов. После 3 промывок срезы инкубировали в растворе вторичных антител в течение 45 мин. После промывки срезы обрабатывали в течение 5-10 мин хромогеном (Thermo Scientific, DAB Plus, США), чтобы вызвать иммунопероксидазную реакцию. Срезы промывали 0,1 М фосфатным буфером (рН=7,2), дегидратировали и заключали в гистологическую среду (Dako, CS705, США). Для оценки активности микроглии проводили иммуногистохимическое окрашивание гиппокампов мышей с использованием анти-Iba-1 кроличьих поликлональных антител (1:500, ab108539, Abcam, USA) и моноклональных антител к CD86 (1:1000, ab53004, Abcam, USA); для исследования нейрогенеза определяли PCNA-иммунореактивность (мышиные моноклональные антитела против PCNA, 1:2000, ab29) в субгранулярной зоне зубчатой извилины гиппокампа (DG SZ); определение числа новообразованных нейронов в DG SZ проводили с использованием антител против даблкортина (1:500, ab18723, Abcam, USA). Соответствующие вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (PI-1000, anti-rabbit, PI-2000, anti-mouse), использовали согласно инструкциям производителя (Vector Laboratories, USA, 1:100). Микрофотографии были сохранены в виде файлов с расширением TIFF. Изображения обрабатывались и анализировались с использованием программы ImageJ (NIH, США). Количественную оценку IL-1β- и Iba1-иммуноположительных клеток проводили на каждом шестом срезе. Количественное определение PCNA и даблкортина проводилось на каждом третьем срезе. Было рассчитано количество клеток на 1 мм³.

Определялось количество пролиферирующих клеток (PCNA-положительных) и число нейронов в процессе созревания (даблкортин-положительных) в зубчатой ​​извилине гиппокампа. Из эксперимента следует, что PCNA-меченые ядра часто присутствуют в виде кластеров (фиг. 3В). У мышей с травмой седалищного нерва показано уменьшение количества пролиферирующих клеток через 28 дней после операции. Однако через 14 дней после операции мы не обнаружили значительного снижения числа PCNA-положительных ядер в группе CCI (p=0,11). Тем не менее, в оба периода наблюдалось значительное увеличение числа пролиферирующих клеток после лечения АГЭ по сравнению с группой CCI (фиг. 3А). Подсчитано количество незрелых нейронов в субгранулярном слое зубчатой извилины, используя маркер даблкортин. Эта молекула присутствует в цитоплазме, теле клетки и в дендритах новообразованных нейронов. Мы не наблюдали значительного снижения числа незрелых нейронов в зубчатой извилине через 14 дней после операции в CCI-группе, что может быть связано с небольшим снижением интенсивности нейрогенеза у ЛО животных. При анализе количества незрелых нейронов через 28 дней после операции было обнаружено значительное снижение этого показателя в группе CCI по сравнению с ЛО животными (1414±166 клеток/мм³ в ЛО группе vs 915±67 клеток/мм³ в CCI-группе, p<0,05). Обнаружено, что введение АГЭ значительно увеличивает число незрелых нейронов через 14 дней после операции по сравнению с ЛО группой и «CCI» (p<0,05) (фиг. 3Б). На 28-й день после операции число даблкортин-положительных нейронов уменьшилось до уровня группы ЛО, но было выше, чем в группе «CCI» (p<0,05).

Эксперимент 4б. Исследование микроглиальной активности

В группах CCI и CCI+АГЭ наблюдалось увеличение Iba1-иммунопозитивного окрашивания (фиг. 4В) в CA1 области гиппокампа через 14 и 28 дней после операции (p<0,001). У мышей, получавших АГЭ, площадь окрашивания Iba1 увеличивалась на 14-й день после операции и была значительно выше, чем в группах ЛО и CCI на 28-й день после операции. Введение АГЭ вызвало незначительное повышение Iba1-позитивного окрашивания в CA1-области гиппокампа мышей с CCI через 14 дней после операции (p <0,05). На 28-й день после операции было обнаружено 2,5-кратное увеличение Iba1-позитивного окрашивания (p<0,001) по сравнению с ЛО животными (фиг. 4А). Чтобы отделить экспрессию микроглии провоспалительного фенотипа от общего пула микроглиальных клеток, проведено иммуногистохимическое выявление микроглиального маркера CD86 (фиг. 4Г). В группе CCI наблюдалось 2-кратное увеличение окрашивания CD86 как на 14-й, так и на 28-й день после операции (p<0,001). Однако на 14-й день после операции не наблюдалось увеличения экспрессии CD86 в группе «CCI+АГЭ», а на 28-й день обнаружено уменьшение этого маркера по сравнению с ЛО мышами (p<0,001) (фиг. 4Б).

Таким образом, введение АГЭ животным с нейропатическим болевым синдромом предотвращает нарушения нейрогенеза и снижает степень активации микроглии провоспалительного фенотипа.

Эксперимент 5. Экспрессия медиаторов воспаления в гиппокампе

Для количественного определения концентрации IL-1β и IL-10 в гиппокампе использовали иммуноферментный анализ. Гиппокампы извлекали из левого полушария, быстро замораживали и хранили при -70°C до использования. В соответствии с рекомендациями производителя использовались наборы для мышей IL-1β ELISA (ab100705, Abcam) и IL-10 ELISA (ab100697, Abcam). Нервную ткань гомогенизировали на льду в экстракционном буфере, рекомендованном изготовителем (100 мМ Трис, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 1 мМ EGTA, 1 мМ ЭДТА, 1% Triton X-100, 0,5% дезоксихолат натрия) с 1 мг/мл ингибитора протеазы (cOmplete, Sigma-Aldrich) и 0,01 мг/мл ингибитора фосфатазы (P5726, Sigma-Aldrich). Концентрации белка определяли с использованием набора для анализа белка BCA (Pierce, Rockford, IL). Абсорбцию при 450 нм измеряли с помощью планшетного спектрофотометра iMark (Bio-Rad).

Выработка медиаторов воспаления в гиппокампе мыши была исследована с использованием иммуноферментного анализа на 14-й и 28-й дни после операции. В группе CCI экспрессия провоспалительного цитокина IL-1β была значительно увеличена на 28-й день после операции по сравнению с ЛО животными: 52,24±3,06 и 44,45±3,29 пг/1 мг белка (р<0,05), но на 14-й день наблюдалась лишь незначительная разница (фиг. 5А). Интересно отметить, что на 14-й день применения АГЭ у животных с перевязкой седалищного нерва наблюдалось значительное снижение концентрации IL-1 в гиппокампе, как по сравнению с ЛО мышами, так и в группе CCI. Однако на 28-й день после операции (через 2 недели после окончания введения АГЭ) этот показатель соответствовал уровню группы «CCI», но был ниже, чем в группе ЛО (p<0,01). Нейропатическая боль сопровождалась значительным увеличением концентрации противовоспалительных цитокинов IL-10 как на 14-й, так и на 28-й дни после операции в CCI-группе. На 14-й день введения АГЭ после операции наблюдалось двойное увеличение концентрации IL-10 в гиппокампе по сравнению с группой CCI (p<0,001) (фиг. 5Б).

Как видно из результатов эксперимента, представленных на фиг.5, введение АГЭ животным с нейропатической болью приводит к значительному увеличению концентрации противовоспалительного цитокина IL-10 в гиппокампе и уменьшению концентрации провоспалительного цитокина IL-1β.

В совокупности все проведенные эксперименты свидетельствуют о том, что нейропатическое болевое поведение сопровождается изменениями поляризации микроглии с преобладанием провоспалительного фенотипа микроглии, тем самым способствуя нарушениям нейрогенеза и снижению когнитивных функций у подопытных животных.

Препарат алкил-глицериновых эфиров, полученный из морских липидов, уменьшает нейропатическую боль и её когнитивные последствия, за счет предотвращения активации микроглии M1 и нормализациии нейрогенеза в гиппокампе, и может быть использован в качестве средства для снижения нейропатической боли.