Результат интеллектуальной деятельности: Способ получения нафтохинонов из морских ежей

Изобретение относится к биотехнологии, фармацевтической и пищевой отраслям промышленности, к получению биологически активных соединений, в частности нафтохинонов, и может быть использовано для получения водорастворимой формы спинохромов, которые могут найти применение при коррекции патологических нарушений липидного, углеводного обмена и антиоксидантного статуса организма.

Морские беспозвоночные являются одним из перспективных объектов мирового промысла: на их долю приходится до 8,5% улова. Известно около 800 видов съедобных морских беспозвоночных, которые широко используются для приготовления пищевой, технической, кормовой продукции, а также в лечебно-профилактических целях [Справочник по химическому составу и технологическим свойствам водорослей, беспозвоночных и морских млекопитающих / Под ред. В.П. Быкова. - М.: Изд-во ВНИРО, 1999. - 262 с].

Морские ежи привлекают к себе устойчивое внимание в связи с высокой экологической адаптабельностью и значительным регенеративным потенциалом.

Известно, что нафтохиноновые пигменты, синтезируемые морскими ежами, обладают антиоксидантными и антибактериальными свойствами. К ним относятся эхинохром А и спинохромы - родственные гидроксилированные производные 5,8-дигидрокси-1,4-нафтохиноны.

В медицине успешно применяется природный нафтохинон - эхинохром А, обладающий противоишемической и противоинфарктной активностью. Его активность обусловлена способностью улучшать снабжение периферийной ткани кислородом в результате взаимодействия как с клетками, так и с отдельными ферментными системами [Н.П. Мищенко, С.А. Федореев, В.Л. Багирова. Новый оригинальный отечественный препарат Гистохром // Хим.-фарм. журнал 2003. Том 37, вып. 8, с. 49-53; А.В. Швилкин, Л.И. Серебрякова, О.В. Цкитишвили. Влияние эхинохрома на экспериментальное реперфузионное повреждение миокарда // Кардиология. 1991. Том 31, №11, с. 79-81].

Аналогичную активность могут проявлять и другие нафтохиноны, входящие в состав оболочных клеток панцирей и игл морских ежей, которые изучены в меньшей степени, чем эхинохром А, в частности спинохром А [С.W.J. Chang, J.C. Moore. Pigments from Some Marine Speciments. Journal of Chemical Education, vol. 50, p. 102, 1973].

Известен метод экстракции нафтохинонов из консервированных плоских морских ежей раствором неорганической кислоты (соляной, фосфорной) в спирте с последующей хроматографической очисткой экстракта на колонке с хитозаном в -OH форме, элюировании эхинохрома А подкисленным этиловым спиртом, нейтрализации элюата, удалении растворителя, перерастворении остатка в хлороформе или ацетоне, перекристаллизации из этилового спирта и сушке продукта [RU 2352554 C1, МПК C07C 50/32, C07C 46/10, опубл. 20.04.2007].

Известен способ получения нафтохинонов (хиноидных пигментов) из панциря морского ежа, который включает в себя следующие этапы: очистка и сушка панциря морского ежа, после удаления гонад и внутренних органов, измельчение до размера частиц не более 0.1 мм; истирание измельченного панциря с сухой лимонной кислотой или однозамещенным натрий фосфатом в течение 60 мин; замачивание и экстракция в растворе кислоты (15 объемов) при комнатной температуре в течение 5 часов, фильтрация и концентрирование в вакууме с получением маточного раствора. Маточный раствор экстрагируется водным раствором кислоты в органическом растворителе, где в качестве кислоты может использоваться муравьиная или соляная кислота; а в качестве органического растворителя - метанол, этиловый спирт или ацетон. Смесь помещается в экстракционную емкость аппарата для суперкритической экстракции углекислым газом. Разделение производится при 30-60°С при давлении от 20 до 50 МПа. Экстрагированный продукт замораживается и сушится. Для дальнейшей очистки производится хроматография на колонке с макропористой смолой, а затем на колонке с обращенной фазой [CN 101812242 В, МПК A23L 1/275; С09В 61/00; С09В 67/04; С09В 67/10; С09В 67/54, опубл. 2012.09.05].

Известен метод переработки панцирей морского ежа, очищенных от остатков внутренностей и высушенных для получения пигментного комплекса (нафтохинов). Для достижения поставленной цели панцири измельчают, деминерализуют при температуре 40-90°С небольшим стехиометрическим избытком слабой органической кислоты, используя 10-80%-ный водный раствор кислоты. Полученную смесь центрифугируют, соль органической кислоты осаждают добавлением органического растворителя, смешивающегося с водой, отфильтровывают. Фильтрат концентрируют, нейтрализуют до pH 4-7 добавлением водорастворимых солей натрия, калия или подобных, концентрируют под вакуумом при температуре не выше 60°С, лиофильно высушивают, антиоксидантный пигментный комплекс (смесь нафтохинов) перерастворяют из органического растворителя [RU 2441661 C1, A61K 35/56, B01D 11/02, опубл. 10.02.2012].

Недостатками вышеперечисленных методов являются длительность и многоэтапность процесса, низкий выход пигментного комплекса и высокое содержание органических примесей в целевом продукте (липидов, смолистых веществ), использование сложной, дорогостоящей аппаратуры при хроматографии. Поскольку кальциевые и магниевые комплексы панцирей и игл морских ежей, в которых содержатся нафтохиноны, являются устойчивыми соединениями, это требует использования высокоактивных растворителей для их выделения. Используются такие коррозионные вещества, как соляная и серная кислота, а также дорогостоящие реактивы, в том числе токсичных веществ (метанол, диоксан), что требует последующей многоступенчатой очистки экстрактов от токсинов с неизбежной потерей конечного продукта.

Также недостатком вышеописанных методов является нерациональное использование биологического сырья.

Известен способ комплексной переработки морских ежей (RU №2432956 C1, МПК A61R 35/56, B01D 11/02, опубл. 10.11.2011), выбранный в качестве прототипа. Способ комплексной переработки морских ежей, при котором морских ежей предварительно разделывают на четыре фракции, получают икру, целомическую жидкость, внутренности и панцирь, далее проводят извлечение целевых продуктов: пептидно-аминокислотного комплекса из целомической жидкости; ганглиозидов и фосфолипидного концентрата из икры; суммы хиноидных пигментов, кальция и магния из панциря; ферментов из внутренностей.

В данном способе сумму хиноидных пигментов, включающую эхинохром А, получают из панциря с иголками, а целомическая жидкость используется только для получения веществ белковой природы: пептидно-аминокислотного комплекса и белкового концентрата. Для этого к целомической жидкости прибавляют 1,5-3 объема спирта этилового (предпочтительно 2-2,5 объема), оставляют на ночь при температуре 3-15°С (предпочтительно 8-12°С) и затем отфильтровывают выпавший осадок (белковый концентрат). Полученный экстракт концентрируют до 0,2-0,5 объемов, декантируют липидный слой, замораживают и лиофильно высушивают. Получают пептидно-аминокислотный комплекс. Белковый концентрат высушивают.

К сожалению, концентрация целомоцитов и биологически-активных веществ в целомической жидкости невелика, что не позволяет сделать переработку целомической жидкости экономически-рентабельной.

Таким образом, одна из важных тканей морского ежа, которая в настоящее время не используется для производства полигидроксинафтохинонов, - это целомическая жидкость, которая заполняет внутренние полости и омывает внутренние органы, солевой состав которой близок к составу морской воды (Barrington, 1979), но содержит повышенную концентрацию хлористого калия, липидов, белков, сахаров и целомоцитов (Smith, 1981; Chia, Xing, 1996).

Задача, решаемая изобретением, - разработка простого способа получения из морских ежей нафтохинонов in vivo.

Технический результат, достигаемый заявленным изобретением, совпадает с поставленной задачей - разработка простого способа получения из морских ежей нафтохинонов in vivo.

Разработанный способ получения нафтохинов из морских ежей заключается в том, что в качестве сырья используют целомическую жидкость морских ежей, перед взятием целомической жидкости морских ежей подвергают воздействию стрессом путем содержания их в условиях гипоксии, с последующим выделением из нее целевого продукта.

Для способа могут использоваться различные виды морских ежей, в частности зеленый морской еж Strongylocentrotus droebachiensis, черный морской еж Mesocentrotus nudus, морские ежи семейства Strongylocentrotidae - красный морской еж Mesocentrotus franciscanus; семейства Echinarachnidae отряда Clypeasteroida - плоский щитообразный морской еж Echinarachnius parma; семейства Arbaciidae отряда Arbacioida: Arbacia lixula и Arb. Punctulata.

Выделение целевого продукта - натохинонов - из целомической жидкости осуществляют известными методами, например сублимированием целомической жидкости, после ее предварительной фильтрации или центрифугирования.

Использование в качестве сырья для получения нафтохинонов целомической жидкости из морских ежей не требует применения дорогостоящего оборудования и различных токсических веществ и тем самым обеспечивает разработку не только просто способа получения нафтохинонов, но и щадящего, рационального, поскольку одни и те же особи морских ежей используются для извлечения целомической жидкости неоднократно.

Содержание морских ежей перед извлечением из них целомической жидкости повышает количество клеток-продуцентов и концентрацию нафтохинонов в целомической жидкости, что, в конечном результате, позволяет предложить целомическую жидкость в качестве сырья для получения нафтохинонов.

Стрессовые условия создаются, в частности, содержанием морских ежей в морской воде, покрывающей панцири морских ежей на уровне от 1/3 до 2/3, при температуре 4-15°С, выдержка на воздухе при комнатной температуре, содержанием морских ежей в морской воде, покрывающей панцири морских ежей на уровне от 1/3 до 2/3, при комнатной температуре.

В стрессовых условиях морских ежей целесообразно выдерживать не более 6 суток, поскольку пребывание в таких условиях более 6 суток приводит к гибели морских ежей.

Способ иллюстрируется следующими чертежами.

Фиг. 1 - цвет целомической жидкости, собранной из морского ежа Strongylocentrotus droebachiensis: (а) контроль; (b) морской еж экспонировался при 15°С в течение 72 часов в кюветах с морской водой, покрывающей особи животных на 1/3; (с) морской еж экспонировался на воздухе при 4°С в течение 144 часов.

Фиг. 2: (А) - целомическая жидкость интактного морского ежа Mesocentrotus nudus; (В) - целомическая жидкость морского ежа после выдерживания в течение 96 часов в условиях гипоксии.

Фиг. 3 - ¹Н (300 МГц) ЯМР-спектр целомической жидкости черного морского ежа Mesocentrotus (=Strongylocentrotus) nudus. 1. Верхний спектр - интактный морской еж. 2. Средний спектр - морской еж после экспонирования в течение 96 часов в условиях гипоксии. 3. Нижний спектр - контрольный препарат Кардио-Гистохром, содержащий эхинохром А.

Фиг. 4 - технология получения нафтохинонов из целомической жидкости морских ежей.

Фиг. 5 - целомическая жидкость морских ежей Strongylocentrotus intermedius: 1 - ежи после выдерживания в условиях стресса, 2 - целомическая жидкость контрольных животных.

Таблица 1 - средние значения рН, концентрации молочной кислоты, твердых частиц и мутности целомической жидкости из зеленых морских ежей, которые содержались в воде при 15°С в течение 72 часов; при 4°С в течении 144 часов в воде или на воздухе (концентрация молочной кислоты приводится в ммоль/л, значения мутности приводятся в NTU (нефелометрических единиц мутности), общее количество целомоцитов - в миллионах клеток, содержание нафтохинонов в (мкг/мл)).

Таблица 2 - интенсивность сигналов (469 и 260, 5 нм), соответствующих группе нафтохинонов.

Таблица 3 - среднее значение интенсивности красного, зеленого и синего цветов целомических жидкостей интактного и подвергшегося гипоксии морских ежей Mesocentrotus nudus, определенной в программе ColorPix.

Таблица 4 - максимумы в УФ-спектрах в интервале от 190 до 550 нм. Эхинохрома (препарат Кардио-Гистохром, содержащий эхинохром А) целомической жидкости интактного морского ежа, целомической жидкости морского ежа после выдерживания в течение 144 часов в условиях гипоксии.

Способ осуществляют следующим образом.

Все эксперименты проводились с двумя видами морских ежей - зеленым морским ежом (Strongylocentrotus droebachiensis) и черным морским ежом (Mesocentrotus nudus), выловленными с июня по октябрь 2015 г.

Морских ежей доставляли в лабораторию в живом виде в течение 24 часов после вылова.

Для транспортировки морских ежей были использованы обычные сумки-холодильники. На дно сумки помещается слой льда, приготовленного из морской воды, затем помещают морских ежей (в количестве, занимающем не более 2/3 объема сумки при неплотной упаковке), заливают ежей холодной морской водой, сверху кладут еще один слой морского льда и закрывают сумку.

После транспортировки морских ежей содержали в аквариумах с непрерывной аэрацией. В этих условиях при температуре воды 2-6° удавалось сохранять морских ежей в пригодном для работы состоянии нескольких недель (до 4 недель).

Пример 1

В исследовании использовали 6 контрольных особей Strongylocentrotus droebachiensis и 18 экспериментальных животных. Животные были выловлены в заливе Анива (о. Сахалин).

Контрольные животные содержались в аэрируемых аквариумах с проточной морской водой. Экспериментальные животные были разделены на три группы.

Перед извлечением целомической жидкости первую группу из 6 особей помещали в кюветы с морской водой, покрывающей особи животных на 1/3, и выдерживали при температуре 15°С в течение 72 часов.

Вторая экспериментальная группа (6 особей) помещалась в кюветы с морской водой, покрывающей морских ежей на 2/3 панциря, и выдерживали при температуре 4°С в течение 144 часа.

Третья экспериментальная группа (6 особей) экспонировалась в холодильнике при температуре 4°С в течение 144 часов.

По завершении выдержки в стрессовых условиях, обусловленных недостатком кислорода (гипоксия), был произведен отбор целомической (полостной) жидкости экспериментальных животных. У контрольных животных также была взята целомическая жидкость. После отбора целомической жидкости морских ежей возвращали в аэрируемые аквариумы. Они сохраняли жизнеспособность и через 10-14 дней могли быть повторно использованы для взятия целомической жидкости.

Образцы полостной жидкости были получены с использованием стерильной иглы 26 калибра (Pst 5) (внешний диаметр 0,45 мм, длина 13 мм, с заваренным кончиком конической формы и боковым выходным отверстием, предназначена для лучшей защиты от засорения при прокалывании материалов), при помощи одноразового шприца. Чтобы игла не попала в полость Аристотелева фонаря ее следует вводить в перистомальную мембрану под некоторым углом к оси тела.

Внешний вид образцов целомической жидкости, собранных из разных групп морского ежа Strongylocentrotus droebachiensis, приведен на Фиг. 1. Из представленной фиг.1 наглядно видно, что целомическая жидкость экспериментальных животных по сравнению с контролем имеет интенсивную окраску.

Было изучено влияние экспозиции ежей S. droebachiensis на воздухе или в воде при 4 или 15°С на цветность и pH целомической жидкости, содержание в ней молочной кислоты, уровень мутности, процент твердых веществ, содержание нафтохинонов, а также количество целомоцитов.

Измерение молочной кислоты в виде D-лактата производилось с использованием Lactate Pro™-метр (Arkray Inc, Киото, Япония).

Измерение уровня мутности целомической жидкости производилось после центрифугирования (1.5 мл) образца при 10000 g в течение 10 минут и поглощение супернатанта производилось при 600 нм на спектрофотометре СФ-256УВИ (ОАО ЛОМО, Спб, Россия).

Процент твердых частиц, присутствующих в растворе, измерялся ручным рефрактометром (Atago Co., Ltd, Итабаши, Япония).

pH целомической жидкости определялся с использованием pH-метра Orion SA 720 со стеклянным электродом при 0°С.

Подсчет количества целомоцитов во внутриполостной жидкости производился с использованием светового микроскопа по стандартной методике с помощью гемоцитометра.

Анализ нафтохинонов в полостной жидкости производился по нижеприведенной методике.

Целомическую жидкость (5 мл) сразу же после выхода из ежа помещали в охлажденную пробирку, центрифугировали в течение 10 мин при 2000 g и супернатант отбрасывали. Эхинохром А экстрагировали из осадка клеток 5 мл смеси 50% ацетона, 45% этанола и 5% 0,1 N HCl. После перемешивания в течение 30 мин пробирку центрифугировали в течение 10 мин при 2000 g. Супернатант, использовали для спектрофотометрии при 475 нм. Экстрагент использовался в качестве контроля, а раствор, содержащий 20 мкг/мл смеси нафтохинонов, в качестве образца сравнения.

Для получения ¹H ядерно-магниторезонасных спектров был использован спектрометр фирмы Bruker с резонансной частотой протонов 300 МГц. Для подавления сигнала воды был использован метод преднасыщения и использована импульсная последовательность zgpr. Для настройки однородности поля в образец добавляли 10% дейтерированной воды (D₂O).

Данные об изменении параметров светометрии образцов были получены с помощью спектрофотометра UV-1600. Образцы исследовались в чистом виде без добавления каких-либо растворителей.

Результаты анализов представлены в таблице 1. Из представленной таблицы следует, что при выдерживании ежей в стрессовых условиях количество нафтохинонов увеличивается в 1,9-5,4 раза.

Пример 2. Брали 10 контрольных особей япономорского морского ежа Mesocentrotus nudus и 10 экспериментальных особей. Животные были собраны в заливе Восток залива Петра Великого Японского моря.

Экспериментальных животных помещали в кюветы с морской водой, покрывающей панцири морских ежей не полностью при температуре 22°С. Контрольных животных содержали в аэрируемых аквариумах с проточной морской водой.

Через сутки у морских ежей была взята целомическая жидкость, при этом обнаружено, что визуально целомическая жидкость экспериментальных животных визуально не отличается от целомической жидкости контрольных животных. Однако в УФ-спектрах целомической жидкости морского ежа, находящегося в условиях гипоксии в течение 24 часов, появляется область поглощения при длине волны 469,0 нм. Аналогичная область поглощения наблюдается и при анализе контрольного препарата Кардио-Гистохром, который содержит водорастворимую форму эхинохрома А. В таблице 2 приведена интенсивность сигналов (469 и 260, 5 нм), соответствующих группе нафтохинонов, как контрольных, так и экспериментальных животных.

Как видно из таблицы 2, способ позволяет вызвать стимуляцию синтеза нафтохинонов в целомической жидкости без использования какого-либо дополнительного оборудования.

Пример 3

Брали 10 контрольных особей япономорского морского ежа Mesocentrotus nudus и 10 экспериментальных особей. Экспериментальных животных помещали в кюветы с морской водой, не полностью покрывающей панцирь морских ежей, и выдерживали в течение 4 суток при температуре 4°С для замедления их метаболизма и лучшей выживаемости в условиях стресса. Контрольных животных при этом содержали в аэрируемых аквариумах с проточной морской водой. Через четверо суток из морских ежей извлекают целомическую жидкость. Различие в цвете целомической жидкости экспериментальных и контрольных животных становится визуально различимо (см. Фиг. 2, где А - целомическая жидкость интактного морского ежа Mesocentrotus nudus; Б - целомическая жидкость морского ежа после выдерживания в течение 96 часов в условиях гипоксии). Как следует из таблицы 3, в которой представлено среднее значение интенсивности красного, зеленого и синего цветов целомических жидкостей интактного и подвергшегося гипоксии морских ежей Mesocentrotus nudus, определенной в программе ColorPix, наиболее заметное изменение наблюдается в красном диапазоне на 19 единиц, что свидетельствует о появлении в целомической жидкости хиноидных пигментов (нафтохинонов).

В УФ-спектрах целомической жидкости морских ежей, находящихся в условиях гипоксии в течение 96 часов (целомическая жидкость для анализа была взята у животных, выдержанных в условиях примера 3), в отличие от целомической жидкости интактных ежей появляется область поглощения при длине волны 469,0 нм, которая имеется и в спектре препарата Кардио-Гистохром, содержащего эхинохром А. В таблице 4 приведены максимумы в УФ-спектрах в интервале от 190 до 550 нм. Эхинохрома (препарат Кардио-Гистохром, содержащий эхинохром А) целомической жидкости интактного морского ежа, целомической жидкости морского ежа после выдерживания в течение 96 часов в условиях гипоксии.

Приведенные УФ-спектры также подтверждают наличие нафтохинонов в целомической жидкости ежа, подвергшегося стрессу, вызванному гипоксией.

У интактных морских ежей, находящихся в физиологически комфортных условиях, в тканях, в частности в целомической жидкости, концентрация хиноидных пигментов ниже уровня чувствительности большинства аналитических приборов, т.е. ниже уровня шума. После содержания морских ежей в условиях стресса, вызванного недостатком кислорода, растворенного в воде, концентрация нафтохинонов становится сравнимой с естественными метаболитами и может превышать 0,1 ммоль/л, что делает его доступным для выделения. Методом ЯМР спектроскопии четко обнаруживаются сигналы от этильных и метильных групп нафтохинонов в целомической жидкости подверженных стрессу морских ежей. На фиг. 3 приведены - ¹Н (300 Мгц) ЯМР-спектр целомической жидкости черного морского ежа Mesocentrotus (=Strongylocentrotus) nudus, где 1. Верхний спектр - интактный морской еж; 2. Средний спектр - морской еж после экспонирования в течение 144 часов в условиях гипоксии; 3. Нижний спектр - контрольный препарат Кардио-Гистохром, содержащий эхинохром А.

Пример 4

Принципиальная схема получения смеси биологически активных нафтохинонов приводится на Фиг. 4.

Берут 50 особей зеленого морского ежа S. droebachiensis и экспонируют на воздухе при 4°С в течение 144 часов. По завершении экспонирования из особей извлекают целомическую жидкость. Для чего промывают перистомальную область морского ежа стерильной морской водой и производят надрез перистомальной мембраны. Целомическую жидкость собирают в чистую пластиковую емкость без добавления антикоагулянта. Объем собранной целомической жидкости составил около 2.5 литра. К ней добавляют такое же количество экстрагирующей смеси, содержащей 50% ацетона, 45% этанола и 5% 0,1 N HCl. Полученную жидкость перемешивают механической мешалкой при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем смесь центрифугируют при 3000 g в течение 15 минут. Супернатант нейтрализуют пищевой содой до рН 4.0-4.5, упаривают до полного удаления органических растворителей и лиофилизируют. Лиофилизат растворяют в 96% этиловом спирте, фильтруют и упаривают до полного удаления растворителя.

Сухой остаток растворяют в ацетоне, фильтруют и снова упаривают. Полученный мелкий порошок кристаллизуют из этилового спирта и сушат в вакуумном сушильном шкафу до постоянного веса. В результате было получено 263 мг нафтохинона.

Пример 5

Брали 10 контрольных особей япономорского серого морского ежа Strongylocentrotus intermedius и 10 экспериментальных особей. Экспериментальных животных помещали в кюветы с морской водой так, чтобы вода покрывала до 1/3 панциря. Больше половины животного оказывалось на воздухе. Контрольных животных содержали в аэрируемых аквариумах с проточной морской водой. Витальность ежей определяли по их способности перемещаться с помощью амбулакральных ножек и игл.

Экспериментальных животных выдерживали в течение 4-х суток при температуре 4°С для замедления их метаболизма и лучшей выживаемости животных в условиях стресса. Через четверо суток различие в цвете целомической жидкости экспериментальных и контрольных животных становится визуально различимым (см. Фиг. 5). Наиболее заметное изменение наблюдается в красном диапазоне.

Пример 6

В исследовании также использовали 10 контрольных особей плоского морского ежа Scaphechinus mirabilis и 10 подопытных особей. Экспериментальных животных помещали в кюветы с морской водой. Контрольных животных содержали в аэрируемых аквариумах с проточной морской водой.

Экспериментальных животных выдерживали в течение 4 суток при температуре 6°С для замедления их метаболизма и лучшей выживаемости животных условиях стресса. Через четверо суток различие в цвете целомической жидкости экспериментальных и контрольных животных становится визуально различимым (Фиг. 5). Наиболее заметное изменение наблюдается в красном диапазоне.

Заявленный способ предлагает для получения нафтохинонов новое сырье, которое до сегодняшнего для этих целей не использовалось. Нафтохиноны морских ежей получают из целомической жидкости, которая содержится в полости тела морских ежей, ограниченной их биоминеральным панцирем, покрытым изнутри целомическим эпителием. В интактных особях целомическая жидкость прозрачная и практически не содержит пигментов. В целомической жидкости морских ежей, подвергнутых стрессу при их выдерживании в условиях гипоксии, появляются пигменты. Это водорастворимая форма нафтохинонов, которую можно выделить, например, сублимированием целомической жидкости после ее предварительной фильтрации или центрифугирования. Способ прост в исполнении, не требует дорогостоящего оборудования и является рациональным и ресурсосберегающим, поскольку особи морских ежей после извлечения из них целомической жидкости могут быть либо выпущены в природную среду обитания, либо использованы для получения целомической жидкости повторно.