Способ получения биологически активных веществ из грибов

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается способа получения биологически активных веществ (БАВ) из мицелия и плодовых тел грибов. На протяжении столетий человечество ценило грибы в качестве источника пищи и лекарственных препаратов. В последнее десятилетие наблюдается усиление интереса к лекарственным веществам, получаемым из базидиальных грибов, направленных на лечение и профилактику ряда тяжелых и трудноизлечимых заболеваний. Фармакологическое действие высших грибов, базидиомицетов, отличается большим разнообразием при низкой токсичности для человека. Во многих видах грибов было идентифицировано множество биоактивных молекул, включая противоопухолевые вещества. Известно около 200 видов грибов (Auricularia polytrichia, Cordiceps sinensis, Flammulina velutipes, Grifola frondosa, Ganoderma lucidum, Hipzigus marmoreus, Hericium erinaceus, Inonotus obliquus, Lentinus edodes, Poria cocos, Pleurotus ostreatus, Polyporus umbellatus, Trametes versicolor и др.), компоненты которых оказывают иммуномодулирующее, противоопухолевое, противовирусное, антидиабетическое воздействие на организм человека (Stames P. Fungi perfecti. The best in gourment and medicinal mushrooms. Olympia: Olympiapress, 1999. - 38 p.).

Полисахариды - наиболее хорошо изученные сильнодействующие вещества, извлеченные из грибов, обладающих противоопухолевыми и иммуномодулирующими свойствами. В частности, показано, что полисахаридные фракции, выделенные из клеточных стенок плодовых тел вешенки Pleurotus ostreatus, ингибируют рост саркомы-180 у мышей, а также активны в отношении вируса иммунодефицита человека и вируса гриппа (Теплякова Т.В., Косогова Т.А. Высшие грибы Западной Сибири - перспективные объекты для биотехнологии лекарственных препаратов. Новосибирск, 2014. - 298 с.).

Известен способ получения фракции полисахаридов, обладающей иммуномодулирующими свойствами, из сухого порошка плодовых тел Pleurotus ostreatus (патент РФ 2189825, МПК А61К 36/06, опубл. 27.09.2002). Полисахаридную фракцию выделяли посредством двукратной обработки 100 г порошка в 350 мл кипящей дистиллированной воды в течение 3-х часов с последующей очисткой диализом и гель-фильтрацией. Выход целевого продукта, биологически активных полисахаридов, составил 5,8% от массы исходного сырья.

Недостатком данной технологии является низкий выход полисахаридов, обусловленный неполным извлечением целевого продукта.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является способ выделения полифенолкарбонового комплекса (ПФК) из склероциев чаги (патент РФ №2502516, МПК А61К 36/06, опубл. 27.12.2013), в котором измельченную чагу заливают водой в массовом соотношении (0,5-1,5)-(3,5-4,5), замораживают при температуре минус 16±3°C в течение 1-4 часов, настаивают 1-2 часа при температуре 65-75°C, фильтруют, фильтрат подкисляют 25% хлористоводородной кислотой до pH 1,0-2,0, перемешивают, отстаивают 12-15 часов и фильтруют. Максимальный выход ПФК, полученного данным способом, составил 35% от сухого веса сырья.

Однако способ-прототип обеспечивает неполное извлечение ПФК из сырья.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является увеличение выхода целевых биологически активных веществ из грибного сырья.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения биологически активных веществ из грибов, включающем измельчение грибного сырья до размера частиц не более 0,2 мм, смешивание измельченного грибного сырья с жидким экстрагентом и выдерживание смеси в течение времени, температуре и давлении, достаточными для наибольшего выхода целевых биологически активных веществ из сырья и растворения их в жидком экстрагенте с последующим отделением целевого продукта от экстрагента, согласно изобретению после измельчения грибное сырье замораживают, а перед смешиванием с жидким экстрагентом измельченное и замороженное грибное сырье облучают дозой 16-20 Мрад потоком ускоренных электронов, полученных в импульсном линейном ускорителе электронов с энергией ускоренных электронов 2,5-5 МэВ.

В качестве импульсного линейного ускорителя электронов используют ускоритель электронов ИЛУ-10, который имеет среднюю мощность пучка 50 кВт, средний ток пучка 15 мА и потребляемую мощность 150 кВт.

Техническое решение направлено на более эффективное использование лекарственного грибного сырья, способствуя более полному извлечению биологически активных веществ из грибов. Отличительной особенностью способа является его универсальность, позволяющая облегчить экстракцию биологически активных веществ из любого грибного сырья. Поток электронов легче разрушает супрамолекулярные комплексы, образующие каркас грибных тканей в замороженном состоянии, и, тем самым, способствует существенному облегчению диффузии экстрактивных веществ в растворитель (экстрагент). Предварительное замораживание измельченного сырья и обработка его в ускорителе позволяет ускорить процессы экстракции целевых продуктов и обеспечить более полное их извлечение без потерь биологической активности полезных веществ.

Способ получения биологически активных веществ (БАВ) из грибов реализован в примере 1 (получение БАВ из плодовых тел вешенки) и примере 2 (получение БАВ из склероции чаги Inonotus obliquus).

Результаты экспериментов, приведенные в таблицах, обработаны с помощью программы «Statistica 6.0» при доверительной вероятности Р=0,95, n=4 (n - количество экспериментов).

Пример 1. В работе использовали высушенные плодовые тела вешенки обыкновенной (Pleurotus ostreatus КТ-3). Плодовые тела измельчали на мельнице MF-10 basic IKA с диаметром сита до 0,25 мм.

Одну часть использовали в качестве контроля, а другие части замораживали слоями при температуре минус 15-20°C в течение не менее 2-х часов и облучали различными дозами (измеренными в Мрад) в потоке ускоренных электронов в импульсном линейном ускорителе электронов ИЛУ-10 (табл. 1).

После обработки в ускорителе из образцов были получены суммарные полисахариды по следующей методике: 5,0 г измельченного плодового тела суспендировали в 50 мл дистиллированной воды, выдержали в термостате в течение 3 часов при температуре 80-95°C и 9 часов при температуре 96-98°C; после остывания центрифугировали при 4000 об/мин в течение 20 мин. Затем производили очистку полисахаридной фракции переосаждением этиловым спиртом и диализом.

Результаты

Выход суммарных полисахаридов в процентах от исходного сырья представлен в таблице 2. Выход суммарных полисахаридов растет прямо пропорционально дозе облучения. При максимальной дозе 20 Мрад выход полисахаридов в 3,1 раза выше, чем в контроле, не подвергавшемся облучению.

Таким образом, предварительное облучение образцов в ускорителе способствует более полному извлечению фракции полисахаридов из грибного сырья.

Пример 2. В работе использовали высушенные склероции чаги (Inonotus obliquus). Склероции измельчили на мельнице MF-10 basic IKA с диаметром пор сита до 0,25 мм. Одну часть использовали в качестве контроля, а другие части замораживали слоями при температуре минус 15-20°C в течение не менее 2-х часов и облучали различными дозами (измеренными в Мрад) в потоке ускоренных электронов в импульсном линейном ускорителе электронов ИЛУ-10. После обработки в ускорителе из образцов был выделен полифенолкарбоновый комплекс (ПФК) по следующей методике: образцы заливали раствором 2% NaOH (1:10) и прогревали на водяной бане в течение 5 часов; осадок отделяли центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут; затем промывали водой (1:10) и снова центрифугировали. Объединенный экстракт ПФК осаждали путем закисления водного экстракта соляной кислотой до pH 2,0-2,2 с последующим центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. Очистку ПФК проводили посредством трехкратного переосаждения по следующей схеме: осадок растворяли в 0,1% NaOH (1:50) и снова осаждали соляной кислотой. Результаты, выход ПФК в процентах от исходного сырья (по сухому веществу), представлены в таблице 3.

Выход меланинов растет прямо пропорционально дозе облучения. При максимальной дозе 20 Мрад выход меланинов в 1,4 раза выше, чем в контрольном образце, не подвергавшемся облучению.

Далее в примерах 3 и 4 приведены экспериментальные данные, подтверждающие сохранение антивирусной активности БАВ из грибов после облучения ускоренными электронами.

Пример 3. Подготовленные образцы полисахаридов вешенки (как описано в примере 1) тестировали в отношении вируса гриппа A/H1N1/California/2009 в культуре клеток MDCK (клетки почки собаки). Результаты представлены в таблице 4.

Примечания: ТС₅₀ - токсическая концентрация образцов, при которой погибает 50% неинфицированных клеток MDCK; IC₅₀ - концентрация сухих веществ в образцах, подавляющая развитие 50% вируса гриппа; IS - индекс селективности, определяется как отношение ТС₅₀/IC₅₀.

Сравнительное тестирование антивирусной активности образцов полисахаридов показало, что облучение, в данном диапазоне, не оказывает существенного влияния на антивирусную активность. Даже при максимальной поглощенной дозе (20 Мрад) образец сохраняет активность, сравнимую с контролем.

Пример 4. Подготовленные образцы ПФК чаги (как описано в примере 2) тестировали в отношении вируса гриппа A/H1N1/California/2009 в культуре клеток MDCK (клетки почки собаки). Результаты представлены в таблице 5.

Примечания: ТС₅₀ - токсическая концентрация образцов, при которой погибает 50% неинфицированных клеток MDCK; IC₅₀ - концентрация сухих веществ в образцах, подавляющая развитие 50% вируса гриппа; IS - индекс селективности, определяется как отношение ТС₅₀/ IC₅₀.

Сравнительное тестирование антивирусной активности образцов меланинов показало, что облучение не оказывает существенного влияния на антивирусную активность. Среднее значение индекса селективности для облученных образцов составляет 27,6, что близко к значению индекса селективности контроля (29,5).