Штамм нематофагового гриба Arthrobotrys oligospora, поражающий яйца и личинки цистообразующей золотистой картофельной нематоды Globodera rostochiensis в цистах

Изобретение относится к штамму нематофагового гриба Arthrobotrys oligospora, поражающий яйца и личинки цистообразующей золотистой картофельной нематоды Globodera rostochiensis, и может быть использовано в биотехнологии и микробиологической промышленности для получения биологических препаратов для защиты растений.

Проблемы, связанные с зараженностью почв фитопаразитическими нематодами, актуальны как для России, так и для других развитых и развивающихся стран. Золотистая картофельная нематода Globodera rostochiensis является опасным вредителем картофеля. Потери урожая при сильном заражении почвы могут составить 70-90%. Нематода вызывает заболевание глободероз и является объектом внешнего и внутреннего карантина Российской Федерации. Химических препаратов от глободероза нет, а из биологических можно привести только зарубежный препарат Bionemat, выпускаемый фирмой «Biotech International», на основе гриба Paecilomyces lilacinus, паразитирующего на яйцах нематод. Гриб P. lilacinus секретирует комплекс ферментов, включающий хитинолитические ферменты, которые позволяют им проникать сквозь покровы яиц. Эффективность действия гриба зависит от количества конидий гриба, попавших на неподвижные стадии нематод. Однако вне доступа гриба остаются многочисленные подвижные личинки нематод, заражающие корни растений картофеля.

Против подвижных стадий нематод - инвазионных личинок - наиболее эффективны нематофаговые (хищные грибы), которые широко распространены в почве и играют большую экологическую роль по утилизации огромной биомассы микроскопических круглых червей - нематод.

Известны штаммы нематофаговых грибов, формирующих различные улавливающие приспособления для личинок нематод (Теплякова Т.В. Биоэкологические аспекты изучения и использования хищных грибов-гифомицетов. - Новосибирск, 1999. - 252 с.; Теплякова Т.В., Ананько Г.Г. Хищные грибы-гифомицеты против паразитических нематод // Защита и карантин растений. - 2009. - №6. - С. 22-25). Препараты, внесенные под картофель, не успевают справляться с личинками нематод, а в это время самки формируют на корнях картофеля новые цисты с яйцами, которые хорошо сохраняются в почве до новых посадок картофеля. В таком состоянии цисты без растения-хозяина способны сохраняться до 8 лет. Весной после высадки картофеля инвазионные личинки под воздействием корневых выделений выходят из цист и заражают корни. Выход личинок из цист проходит в течение 3-6 недель. Личинка проникает в корень через корневой чехлик и движется вдоль проводящей системы корня в течение нескольких дней. После чего останавливается и формирует зону питания из нескольких гигантских клеток. В зависимости от температуры почвы в течение полутора - двух месяцев из личинок формируются самки и самцы. Через несколько дней после копуляции самка начинает накапливать яйца в полости тела. Молодые самки белого цвета к осени приобретают золотистый цвет и в таком состоянии уходят на зимовку. К концу жизни тело самки полностью заполняется яйцами, превращаясь в цисту.

Известны штаммы нематофаговых грибов: Arthrobotrys oligospora BKMF-2461D (Авторское свидетельство СССР №1264393, МПК C12N 1/14, опубл. 1986), Arthrobotrys oligospora (патент США №4975105, МПК C05F 11/08, опубл. 1990), проявляющие высокий нематофаговый эффект. Препаративные формы для борьбы с галловыми нематодами получали на разных органических субстратах. Действующее начало - конидии и мицелий гриба.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является штамм Arthrobotrys oligospora 3062D (Авторское свидетельство СССР №1688818, МПК A01N 63/00, опубл. 1991), проявляющий по сравнению с вышеприведенным штаммом более высокий нематофаговый эффект против личинок галловых нематод и стабильность свойств. Действующим началом также являются конидии и мицелий. Данный штамм является основой разработанного биопрепарата "нематофагин-БЛ", утвержденного в 1990 году Комиссией по микробиологическим средствам защиты ВАСХНИЛ, Союзсельхозхимией, и рекомендован для внедрения. "Нематофагин-БЛ" включен в список биопрепаратов, разрешенных к применению на территории России.

Однако во всех вышеприведенных аналогах и прототипе используются штаммы, проявляющие эффект только в отношении подвижных стадий нематод - личинок.

Техническим результатом заявляемого изобретения является получение штамма хищного гриба Arthrobotrys oligospora, поражающего не только личинок цистообразующей картофельной нематоды, находящихся в почве, но также личинки и яйца картофельной цистообразующей нематоды, находящиеся внутри цист.

Указанный технический результат достигается выделением из природных условий нового штамма хищного гриба Arthrobotrys oligospora Т-15 (авторское название), продуцирующего в почве ловчие приспособления для личинок нематод и способного прорастать внутрь цист и поражать яйца, а также личинки нематод в них, разрушая их содержимое. Штамм Arthrobotrys oligospora выделен из почвы, зараженной картофельной золотистой нематодой в садовом обществе Колос, р.п. Кольцово, Новосибирской обл. в мае 2915 г. и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером F-1303 (справка о депонировании прилагается).

Заявляемый штамм характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические особенности штамма на агаризованной питательной среде. Пептонно-кукурузный агар (ПКА), г: глюкоза - 10,0; хлористый натрий - 5,0; углекислый кальций - 0,5; кукурузный экстракт - 5,0; пептон - 5,0; агар-агар - 20,0; вода водопроводная - до 1 л. На данной среде образуются колонии с белым плотным ватообразным мицелием, колонии с ровным краем. Мицелий немного поднимающийся, размер колоний - 30 мм - 3 суток, 55 мм - 5 суток, 90 мм - 10 суток, спороношение конидиями, обратная сторона колонии (реверзум) - от светло-песочного до светло-коричневого цвета. Цвет колонии по мере старения слегка песочный.

Микроморфологические признаки. Гифы мицелия ровные, размером 4-8 мкм, формируются конидии на простых прямых конидиеносцах, длиной от 300 до 500 мкм, у основания шириной 7-12 мкм, у дистального конца 4-6 мкм.

Конидии двухклеточные, удлиненно-грушевидные, дистальная клетка почти в два раза больше проксимальной, размером 25-27×10-14 мкм, собраны в виде головок по 8-12 штук на вершинах конидиеносцев, а также в виде отдельных гроздей на конидиеносце, число которых может достигать 5-10. В почве и в культуре на нематодах образуются толстостенные хламидоспоры, овальной или круглой формы размером 25-35 мкм. В присутствии нематод на гифах формируются округлые петли и их сплетения в виде сетей. Внутренний размер улавливающих приспособлений в среднем от 25 до 30 мкм, но встречаются округлые кольца до 40 мкм диаметром.

Продукт, синтезируемый штаммом - комплекс соединений (аттрактанты, токсины, ферменты), участвующие в механизме хищничества и продуцируемые грибом активно в процессе образования ловчих приспособлений. Нематофаговый эффект определяется в отношении личинок и яиц нематод по способности уничтожать их в лабораторных условиях, оцениваются показатели хищности (количество улавливающих приспособлений) и активности (количество умерщвленных личинок нематод, нежизнеспособных яиц в %).

Для определения активности суспензию с личинками, яйцами, цистами нематод помещают в чашечки Петри диаметром 40 мм или на предметные стекла, на которые наносят парафиновые кольца. В суспензию нематод вносят культуру гриба и просматривают ежедневно под стереоскопическим микроскопом (МБС-10).

Штамм хранится в холодильниках (+2-6°С) в виде культур, выращенных на скошенной среде (ПКА) в пробирках, пересев осуществляется 1 раз в год.

Оптимальные среды для пересевов:

- жидкая на основе мелассы и кукурузного экстракта, г: кукурузный экстракт - 7,5; меласса свекловичная - 30,0; KH₂PO₄ - 5,0; MgSO₄×7H₂O - 2,0; NaNO₃ - 5,0; вода водопроводная - до 1 л;

- агаризованная на основе мелассы и кукурузного экстракта к жидкой среде, указанной выше, добавляется агар-агар из расчета 20 г на 1 л подготовленной среды;

- ПКА: глюкоза - 10,0; хлористый натрий - 5,0; углекислый кальций - 0,5; кукурузный экстракт - 5,0; пептон - 5,0; агар-агар - 20,0; вода водопроводная - до 1 л.

Как указывалось выше, в разделе характеристика аналогов, штаммы гриба Arthrobotrys oligospora широко применяются для защиты растений и животных от нематод. Госхимкомиссией СССР в 1990 г. на основе другого штамма 3062D (авторское свидетельство СССР №1688818) было разрешено производство и применение Нематофагина-БЛ для биологической защиты растений (Сопрунов Ф.Ф. Хищные грибы-гифомицеты и их применение в борьбе с патогенными нематодами. - Ашхабад, 1958, 394 с.; Теплякова Т.В. Биоэкологические аспекты изучения и использования хищных грибов-гифомицетов. - Новосибирск, 1999, 252 с.). Штамм не является генетически модифицированным и не содержит генов других организмов; перенесенных генов резистентности; генетических изменений, связанных с использованием генно-технических методик.

Преимуществом заявляемого штамма является его способность поражать не только подвижные личинки картофельной нематоды в почве, но и неподвижные - яйца, окруженные оболочкой цисты, устойчивой к внешним воздействиям. Это позволит применять препарат на основе данного штамма не только во время посадки клубней картофеля, но и после сбора урожая, когда в почве остаются многочисленные цисты опасного вредителя.

На фиг. 1 представлены конидиеносцы с конидиями гриба Arthrobotrys oligospora на поверхности цисты картофельной нематоды. На фиг. 2 изображены яйца в цисте картофельной нематоды, нарушена структура, видны гифы, увеличение 400 крат. На фиг. 3 представлены гифы хищного гриба, заполнили яйца, находящиеся в цисте, увеличение 1000 крат. На фиг. 4 изображены не пораженные хищным грибом яйца и личинки в цисте картофельной нематоды, увеличение 400 крат.

Пример 1. Выращивание биомассы гриба на основе заявляемого штамма Arthrobotrys oligospora F-1303 поверхностным способом.

Получение биомассы может проводиться на агаризованных и сыпучих средах. В качестве агаризованной среды используется пептонно-кукурузный агар (ПКА), г: глюкоза - 10,0; хлористый натрий - 5,0; углекислый кальций - 0,5; кукурузный экстракт - 5,0; пептон - 5,0; агар-агар - 20,0; вода водопроводная - до 1 л).

После помещения всех компонентов среды в посуду емкостью не менее полутора литров производят нагревание смеси для расплавления агар-агара, при постоянном помешивании. Для этих же целей может использоваться водяная баня. Затем среда разливается в колбы или флаконы по 200 мл и стерилизуется в автоклаве 40 минут при температуре 120 С (1 атм).

Затем среда разливается в стерильные чашки Петри и после остывания они засеваются кусочками стерильной культуры гриба. Время роста колонии до полного зарастания чашки и появления спороношения при температуре +28+- С составляет 12-14 суток.

В качестве сыпучей среды используется зерно пшеницы. К 1 кг зерна добавляют 1500 мл воды, и в течение 15 минут проводится отваривание зерна для насыщения зерновок водой. После этого зерно откидывают на сито или дуршлаг для удаления влаги, добавляют к нему 5 г мела, расфасовывают по 750 мл колбам, заполняя их на 1/3 объема, и стерилизуют в автоклаве при температуре 120°С (1 атм) в течение 40 минут. После остывания колбы с зерном всряхивают и засевают кусочками мицелия хищного гриба. Мицелий разрастается на зерне в течение двух-трех недель.

Пример 2. Выращивание биомассы гриба на основе заявляемого штамма Arthrobotrys oligospora F-1303 глубинным способом.

Глубинное культивирование осуществляется на жидкой среде: кукурузный экстракт - 7,5; меласса свекловичная - 30,0; KH₂PO₄ - 5,0; MgSO₄×7H₂O - 2,0; NaNO₃ - 5.0; вода водопроводная - до 1 л. Среда разливается в колбы по 100 мл, засев производится на спорово-мицелиальной суспензии гриба из расчета 5 мл на 100 мл среды. Суспензию получают из агаризованной культуры гриба, выращенной в биологической пробирке на скошенном агаре. В пробирку вливают 20 мл стерильной воды, при помощи стерильной стеклянной пипетки или шпателя снимают мицелий с конидиями и производят встряхивание для получения более равномерного распределения конидий и обрывков гиф в воде. Колбы помещают в термостатированные качалки в течение 5-6 суток, производится выращивание биомассы при температуре 28°С и скорости 180 оборотов/мин. При просмотре проб культуры под микроскопом наличие спиралевидных ветвлений на концах растущих гиф служит признаком зрелости биомассы. Готовая биомасса имеет коричневатый цвет и гелеобразную консистенцию, а также содержит не менее 15 г/л сухих веществ.

Пример 3. Испытание биомассы поверхностного и глубинного культивирования заявляемого штамма Arthrobotrys oligospora F-1303 на цистах картофельной нематоды Globodera rostochiensis в лабораторных условиях. Для испытаний эффективности штамма Arthrobotrys oligospora F-1303 в отношении яиц и личинок картофельной нематоды, заключенных внутри цист, использовали водный раствор агар-агара (20 г на 1 л воды без добавления питательных компонентов, расплавление агара и стерилизация по примеру 1) и цисты нематод, собранные на корнях картофеля и в почве на зараженном участке.

Стерильный раствор агар-агара разливали тонким слоем в чашки Петри и после остывания помещали цисты нематод в виде круга на расстоянии 3 см от центра в количестве 10 штук. В центре чашки Петри помещали кусок агаризованной культуры размером 0,5 см в диаметре (высечка металлической трубкой из колонии) или биомассу жидкой культуры, занимающую такую же площадь. В контроле грибы не добавляли. Хищный гриб из центра разрастался в сторону цист, формируя сначала едва заметные гифы. Через 2-3 дня мицелий достигает цист и обволакивает их, от цист отходят во все стороны конидиеносцы с головками конидий. Под стереоскопическим микроскопом Stemi 2000-ZEISS было видно спороношение в виде головок конидий и целых гирлянд из них. На гифах возле цист шло активное формирование ловушек в виде петель и их сплетений. Изучение содержимого цист проводится на предметном стекле после разрушения их целостности при помощи препаровальных игл в капле воды. Сверху разрушенная циста накрывается покровным стеклом и временный препарат просматривается под микроскопом Axsioskop при увеличении от 100 до 1000 раз (см. фиг. 1-4). Содержимое пораженных яиц отличается от нормально развивающихся крупной зернистостью. В пораженных яйцах и личинках, находившихся внутри цист при использовании объектива микроскопа ×40 и ×100, четко обнаруживаются гифы гриба. После 5 суток гриб формирует на гифах внутри цист массу хламидоспор, которые являются жизненной формой существования хищных грибов в почве, естественной среде их обитания. От оболочек яиц практически ничего не остается. В контроле на цистах не были обнаружены хищные гибы, на некоторых цистах сформировались пушистые налеты микроскопических грибов из видов, живущих в почве. При просмотре содержимого цист в них обнаруживали лишь живые яйца и иногда личинки, хищных грибов не находили.

Пример 3. Определение нематофаговой активности заявляемого штамма Arthrobotrys oligospora F-1303 в условиях почвы.

Почву с цистами картофельной нематоды помещали в пластмассовые сосуды массой 300 г, в них вносили биомассу гриба, полученную на зерне в дозе 1,0% к массе почвы. Эта доза была ранее определена в экспериментах, как наиболее эффективная для грибов рода Arthrobotrys.

Использовали в качестве контроля почву без внесения гриба, а также почву с внесением другого штамма хищного гриба, Daddingtonia flagrans F-882, который не обладает способностью проникать в цисты картофельной нематоды и поражать яйца и личинки внутри них. Однако этот штамм активен в отношении подвижных личинок нематод, находящихся в почве. Опыт проводили в июле 2015 г., использовали картофель сорта «Свитанок киевский», в почву вносили кусочки клубней вместе с зелеными ростками. Ставилась задача оценить общее количество нематод в почве через 1 месяц после закладки эксперимента. Подсчет нематод производили по методу Бермана. Среднее количество личинок нематод в 10 г почвы составило: в варианте с Arthrobotrys oligospora F-1303-98, в варианте с Daddingtonia flagrans-192, в контроле - 317. Таким образом, под действием Arthrobotrys oligospora F-1303 в почве через 1 месяц оставалось практически в 2 раза меньше личинок нематод, чем под действием другого штамма, взятого нами для сравнения. Это свидетельствует о том, что штамм Arthrobotrys oligospora F-1303 поражает яйца картофельной нематоды на стадии цисты, не давая им превратиться в личинки, тем самым предотвращая их выход в почву и повторное заражение корней.

Таким образом, вышеприведенные примеры 1-3 подтверждают достижение заявляемого технического результата, а именно получение штамма хищного гриба Arthrobotrys oligospora, поражающего не только личинок цистообразующей картофельной нематоды, находящихся в почве, но также личинки и яйца картофельной цистообразующей нематоды, находящиеся внутри цист.