СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ РЕГЕНЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии и клеточным технологиям.

Высокая частота встречаемости и низкая эффективность терапии дегенеративных заболеваний [1, 2] являются основанием для разработки новых средств, обладающих выраженной регенеративной активностью.

Известны средства, обладающие регенеративной активностью (натрия нуклеинат, метилурацил и др.) [3].

Недостатками данных средств в большинстве случаев является их низкая эффективность [1, 2].

Существует иммобилизированная с помощью ионизирующего излучения гиалуронидаза (гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидаза), обладающая способностью увеличивать резерв стволовых клеток в костном мозге [4] и оказывающая гипогликемическое [5] и гемостимулирующее [6] действие.

Нами впервые выявлена выраженная регенеративная активность иммобилизированной с помощью ионизирующего излучения гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы на моделях различных дегенеративных заболеваний.

Адекватных аналогов предлагаемое средство не имеет.

Задачей, решаемой настоящим изобретением, является расширение показаний к применению иммобилизированной с помощью ионизирующего излучения гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы.

Поставленная задача достигается применением иммобилизированной с помощью ионизирующего излучения гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы в качестве средства, обладающего регенеративной активностью.

Новым в предлагаемом изобретении является использование иммобилизированной с помощью ионизирующего излучения гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы в качестве средства, обладающего регенеративной активностью.

Используемое нами оригинальное средство иммобилизированная с помощью ионизирующего излучения (электронно-лучевого синтеза) гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидаза было разработано и получено ООО «Саентифик Фьючер Менеджмент» (г.Новосибирск) совместно с НИИ фармакологии СО РАМН (г.Томск).

Отличительным звеном патогенеза дегенеративных заболеваний является нарушение способности отдельных тканей организма к восстановлению и компенсации путем реализации собственного регенераторного потенциала и развитие дистрофических процессов на фоне разрастания склеротической ткани [7, 8]. При этом фармакологическое действие существующих для их лечения средств основано преимущественно на стимуляции либо замещении функций сохранившихся клеточных элементов. Однако концепция компенсации нарушений деятельности и повреждений органов-мишеней за счет указанных приспособительных процессов в значительном числе случаев оказывается несостоятельной [1, 2, 8]. Представленные факты указывают на необходимость развития стратегии регенеративной медицины, то есть замену погибших либо дисфункционирующих клеточных элементов на новые, как на главную и основную ее задачу.

Реализация данного подхода может быть обеспечена использованием фармакологических подходов клеточной терапии, в том числе путем назначения модификаторов функций стволовых клеток [1, 2, 8].

Гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы является ферментом, влияющим на метаболизм гиалуроновой кислоты, которая представляет собой наиболее распространенный гликозаминогликан в организме, и входит в состав межклеточного матрикса тканей, а также гликокаликса клеток и их рецепторов к различным биологически активным веществам [9, 10]. Известна способность препаратов данного фермента, в том числе иммобилизированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы, повышать проницаемость различных тканевых барьеров для экзогенных и эндогенных веществ, оказывать лечебное действие в отношении контрактур, рубцов и др., стимулировать гемопоэз и прочее [5, 6]. Известна также возможность увеличения содержания стволовых клеток (СК) в костном мозге с помощью гиалуронат-эндо-β-М-ацетилгексозаминидазы [4]. Однако дальнейшая судьба СК, возможность их участия в процессах клеточного самообновления, вероятность реализации ростового потенциала и участия в регенерации поврежденных тканей и органов, лишенных способности к восстановлению за счет собственного потенциала, остаются не известными. Эксперимент показал непредсказуемые результаты.

Факт применения иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы (имГЭАГА) с достижением нового технического результата, заключающегося в значительных регенеративных эффектах при дегенеративных заболеваниях, для специалиста является не очевидным.

Новые свойства не вытекают явным образом из уровня техники в данной области и не обнаружены в патентной и научно-технической литературе.

Предлагаемое изобретение может быть использовано в медицине.

Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Эксперименты были проведены на 247 мышах линии CBA/CaLac и 94 беспородных крысах. Животные получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования НИИ фармакологии СО РАМН.

Исследования проводили в соответствии с правилами лабораторной практики (GLP), Приказом МЗ РФ №267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики», Федеральным законом 61 «Об обращении лекарственных средств», «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (Москва, 2005) [11].

В качестве патологических состояний были выбраны модели заболеваний, имеющие с большинством дегенеративных нозологий общие основные черты патогенеза: сахарный диабет 1 типа, цирроз печени, фиброз легких и постгипоксическая энцефалопатия; что позволяет экстраполировать получаемые на данных моделях результаты на большинство известных патологических состояний дегенеративного характера.

Пример 1

10% водный раствор полиэтиленгликоля с молекулярной массой 400 Да облучали потоком ускоренных электронов в дозе 1,5 Мрад. Обработку проводили тормозным излучением, генерируемым ускорителем ИЛУ-6, с энергией электронов 2,5 МэВ, поглощенная доза от 2 кГр, скорость набора дозы 1,65 кГр/час. В облученный раствор вносили гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазу (ООО «Саентифик фьючер менеджмент», г.Новосибирск) до конечной концентрации 70 ЕД гиалуронат-эндо-(β-N-ацетилгексозаминидазы в 1 мл 10% полиэтиленгликоля. Смесь перемешивали 10 минут и получали конечный иммобилизированный препарат в виде слегка опалесцирующего раствора. Выход готового продукта составляет 96,2%.

Пример 2

5% водный раствор гидроксиэтил-крахмала с молекулярной массой 1,5 кДа облучали потоком ускоренных электронов в дозе 1,5 Мрад. Обработку проводили тормозным излучением, генерируемым ускорителем ИЛУ-10, с энергией электронов 2,5 МэВ, поглощенная доза 10 кГр, скорость набора дозы 1,65 кГр/час. В облученный раствор вносили гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазу (ООО «Саентифик фьючер менеджмент», г.Новосибирск) до конечной концентрации 1 ЕД гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы в 1 мл 5% гидроксиэтил-крахмале. Смесь перемешивали 10 минут и получали конечный иммобилизированный препарат в виде слегка опалесцирующего раствора. Выход готового продукта составляет 97,3%.

Пример 3

В 10,0% водный раствор поливинилпирролидона с молекулярной массой 4 кДа вносили гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазу (ООО «Саентифик фьючер менеджмент», г.Новосибирск) до конечной концентрации 500 ЕД гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы в 1 мл. Затем смесь перемешивали 30 минут и облучали гамма-излучением в дозе 1,0 Мрад. Обработку проводили тормозным излучением, генерируемым ускорителем ИЛУ-10, с энергией электронов 2,5 МэВ, поглощенная доза 5 кГр, скорость набора дозы 1,65 кГр/час. Смесь перемешивали 10 минут и получали конечный иммобилизированный препарат в виде слегка опалесцирующего раствора. Выход готового продукта составляет 95,7%.

Пример 4

Исследовали антидиабетическое действие иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы.

Экспериментальной моделью сахарного диабета служил аллоксановый диабет [12]. У мышей диабет моделировали подкожным введением 1-водного аллоксана по следующей схеме: в течение 4-х дней ежедневно по 300 мг/кг, затем еще раз в той же дозе на 7-й день после последнего введения в объеме 0,2 мл/мышь. Опытным животным с 3-х сут после начала моделирования диабета внутрижелудочно 1 раз в день в течение 3 дней вводили 50 ЕД/кг имГЭАГА, полученной по примеру 1. Контрольным животным по той же схеме в эквивалентном объеме вводили дистиллированную воду.

Оценку состояния эндокринного аппарата поджелудочной железы животных производили по регистрации уровня глюкозы в периферической крови и с помощью морфологического исследовании органа. Содержание глюкозы определяли утром натощак на 11-е и 21-е сут опыта с помощью глюкометра «Optilite» (Венгрия) и прилагаемых к нему полосок «Optilite test strip». Для морфологического исследования на 8, 11, 15, 21-е сут эксперимента часть поджелудочной железы, прилегающую к селезенке, фиксировали в 10% растворе формалина и заливали в парафин. Депарафинизированные срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. На срезах определяли площадь 10-ти последовательных островков Лангерганса методом графического компьютерного анализа и посчитывали в них общее количество клеток, число пикнотизированных клеточных элементов и вычисляли содержание клеток на единицу площади островка и процент пикнотизированных клеток. С целью исследования механизма действия средства изучали состояние различных пулов стволовых клеток: количество мультипотентных стволовых клеток (МСК) в костном мозге и периферической крови на 8-е сут эксперимента [2] и динамику содержания регионарных стволовых клеток в поджелудочной железе на 8, 11, 15, 21-е сут [13]. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.

В ходе эксперимента введение аллоксана приводило к пикнозу значительной части клеток островков Лангерганса, наблюдаемому во все сроки исследования. Кроме того, отмечались выраженные явления отека и гиперемии эндокринного аппарата с развитием значительной лимфомакрофагальной инфильтрации ткани (табл.1). Закономерным отражением морфологических изменений со стороны поджелудочной железы явилось значительное возрастание содержания глюкозы в периферической крови и развитие гипергликемии (табл.2)

При этом курсовое введение имГЭАГА после моделирования аллоксанового диабета приводило к достоверному снижению процента пикнотизированных клеток в островках Лангерганса на 11, 15-е сут опыта на фоне уменьшения общего количества клеток на единицу площади островка в результате значительного снижения инфильтрации островков (табл.1). Описанная патоморфологическая картина сопровождалась нормализацией уровня глюкозы в крови (табл.2)

При исследовании возможных механизмов действия выявленной высокой эффективности имГЭАГА при экспериментальной терапии сахарного диабета в контрольной группе было обнаружено отсутствие изменений со стороны костномозгового и циркулирующего пулов истинных (мультипотентных) стволовых клеток. Более того, на протяжении всего эксперимента отмечалось выраженное падение содержания регионарных стволовых клеток в поджелудочной железе (табл.3). Вместе с тем исследование возможной стимуляции данных компенсаторно-приспособительных механизмов при моделировании сахарного диабета с помощью введения имГЭАГА выявило значительное повышение МСК в периферической крови, свидетельствующее о их мобилизации из тканей-депо, и возрастание количества регионарных стволовых клеток (табл.3).

Таким образом, иммобилизированная гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидаза позволяет проводить эффективную терапию сахарного диабета путем стимуляции эндогенных стволовых клеток, сопровождаемой репарацией инсулинпродуцирующего аппарата органа и нормализацией уровня глюкозы в периферической крови.

Пример 5

Исследование терапевтических эффектов при циррозе печени.

Эксперименты были проведены на беспородных крысах. Цирроз вызывали совместным внутрижелудочным введением 50% раствора CCl₄ ((гепатотропный яд) на оливковом масле в дозе 2 мл/кг в течение 3-х недель 2 раза в неделю (6 раз)). При этом вместо воды животные в течение всего периода эксперимента получали 10% раствор этилового спирта [11]. Опытным животным, начиная со следующего дня после последнего введения тетрахлоруглерода, перорально через день в течение 10 сут перорально вводили имГЭАГА (полученную по примеру 2) в дозе 20 ЕД/кг. Контрольным животным по той же схеме в эквивалентном объеме вводили дистиллированную воду.

Для изучения состояния печени оценивали гибель крыс, проводили биохимические исследования содержания в сыворотке крови аспартат- и аланин-аминотрансфераз (АсАТ, АлАТ) на 40-е сутки, а также морфологическое исследование печени на 40-е сутки опыта. Активность ферментов сыворотки крови определяли общепринятыми методами, используя полуавтоматический биохимический анализатор фирмы Cormay и стандартные наборы к нему. Кровь для исследования получали из бедренной артерии через катетер. На гистологических препаратах печени, окрашенных гематоксилином и эозином, определяли количество клеток инфильтрата с помощью окулярной сетки Автандилова, содержащей 25 тест-точек [14]. В 20 полях зрения подсчитывали количество клеток, попадающих на тест-точки сетки. Относительную площадь инфильтрации высчитывали как отношение точек сетки, приходящихся на клетки инфильтрата, ко всем точкам сетки в 20 полях зрения. Площадь соединительной ткани определяли с помощью средств компьютерной обработки графических данных. Для этого на стандартной площади среза печени (последовательные микрофотографии 10 полей зрения, выполненные микровидеокамерой "Digital micro", с программой передачи изображения на компьютер фирмы «Элекард», Томск) измеряли площадь структур, окрашенных пикрофуксином, и вычисляли процентное отношение к выбранной стандартной площади. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.

Проведенные эксперименты показали значительную гибель крыс в контроле (47,6%), в то время как при введении имГЭАГА на фоне моделирования цирроза гибели практически не отмечалось (3,7%). Биохимические исследования сыворотки крови выявили повышение активности АлАТ, и АсАТ и ЩФ на 40-е сутки опыта после начала введения ССl₄ в контрольной группе (табл.4). В то же время использование имГЭАГА сопровождалось существенным падением ферментативной активности сыворотки крови.

При исследовании гистологических препаратов печени в контрольной группе крыс отмечалось выраженное нарушение долькового строения органа. Имела место деформация терминальных печеночных венул, артериол и желчных протоков. Поля грануляционной ткани замещали погибшие гепатоциты, в которых происходило новообразование сосудов и печеночных протоков, были видны фиброзные тяжи и микроузлы (псевдодоли). Последние представляли собой группы гепатоцитов, окруженных участками фиброза. В сохранившихся гепатоцитах наблюдалась выраженная крупнокапельная жировая дистрофия. Введение имГЭАГА приводило к значительному регрессу морфологических признаков цирроза. При этом наблюдалось восстановление долькового строения печени, хотя признаки мелкокапельной жировой дистрофии и портальной инфильтрации сохранялись до конца периода наблюдения.

Подсчет содержания клеток инфильтрата и площади соединительной ткани показал резкое падение данных показателей в группе крыс, получавших имГЭАГА (табл.5).

Таким образом, иммобилизированная гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидаза обладает выраженным противоцирротическим действием. При этом механизмом его действия, очевидно, являются стимуляция СК печени и мобилизация прогениторных элементов костного мозга в периферическую кровь с их дальнейшим детерминированным хомингом в печеночную ткань и дифференцировкой в тканеспецифичные элементы [1, 2, 8].

Пример 6

Исследовали терапевтическое действие иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы при фиброзе легких.

Фиброз легкого моделировали у мышей однократным интратрахеальным введением 80 мкг блеомицина ("Блеомицетин", ОАО "Лэнсфарм") в 30 мкл физиологического раствора [15]. Опытным животным, начиная с 7-х сут эксперимента, перорально в течение 10 дней вводили имГЭАГА (полученной по примеру 3) в дозе 100 ЕД/кг. Контрольным животным по той же схеме в эквивалентном объеме вводили дистиллированную воду.

На 7, 14, 21 и 25-е и 40-е сут после введения блеомицина изучали морфологическую картину легких. Для гистологического исследования кусочки легких фиксировали в 10% формалине. По стандартной гистологической методике выполняли проводку материала, заливали объекты исследования в парафиновые блоки, с которых делали гистологические срезы толщиной 5 мкм. Депарафинированные срезы окрашивали гематоксилином и эозином и по Ван-Гизону на соединительную ткань [14]. С помощью компьютерного графического анализа на стандартной площади гистологического среза измеряли площадь коллагеновых волокон в ткани легкого. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.

Введение блеомицина приводило к развитию в легких мышей морфологических изменений, характерных для токсического фиброзирующего альвеолита. С 7-х сут эксперимента отмечался отек межальвеолярных перегородок, инфильтрация интерстиция альвеол нейтрофилами, лимфоцитами, макрофагами и плазматическими клетками. 14-е и 21-е сутки характеризовались усилением отека и нарастающей диффузной инфильтрацией интерстиция альвеол и альвеолярных ходов воспалительными клетками, что приводило к значительному нарушению гистоархитектоники легочной ткани. При этом в стенках альвеол наблюдалось венозное полнокровие и кровоизлияния. На 25-е сутки опыта клеточная инфильтрация легочной ткани была наиболее выражена. В центральных отделах органа встречались участки, где легочный рисунок отсутствовал, часть альвеол была эмфизематозно расширена. Усиление клеточной инфильтрации легких приводило к утолщению альвеолярного интерстиция, сдавлению капилляров и дезорганизации альвеолярных структур. В интерстиции альвеол отмечалось усиление образования коллагеновых волокон и прогрессирующее разрастание соединительной ткани. На 7-е сут эксперимента соединительная ткань располагалась в основном периваскулярно и перибронхиально, к 14-м сут наблюдалось диффузное распространение фибротических масс, а на 25 и 40-е сут картина пневмофиброза была наиболее выраженной.

Введение препарата имГЭАГА сопровождалось значительной нормализацией морфологической картины ткани легких. Отек межальвеолярных перегородок и инфильтрация интерстиция альвеол воспалительными клетками, венозное полнокровие и кровоизлияния были значительно менее выражены, чем в контроле. При этом до конца периода наблюдения сохранялась гистоархитектоника легочной ткани, а анализ графических данных гистологических препаратов выявил значительное снижение площади соединительной ткани в легких (табл.6).

Таким образом, иммобилизированная гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидаза обладает выраженным терапевтическим (антисклеротическим) действием при фиброзе легких.

Пример 7

В эксперименте на мышах проводили исследование церебропротекторных эффектов имГЭАГА на модели постгипоксической энцефалопатии. Оценку состояния центральной нервной системы животных производили по регистрации показателей психоневрологического статуса: условно-рефлекторной деятельности и ориентировочно-исследовательскому поведению животных в открытом поле.

Энцефалопатия моделировалось с помощью термокамеры объемом 500 мл. Мыши помещались в термокамеру, крышка закрывалась, и мыши оставались там до атонального судорожного припадка или остановки дыхания, определяемой визуально, в течение 10-15 секунд. После извлечения из термокамеры и восстановления самостоятельного дыхания, через 5-10 минут, мыши вновь помещались в термокамеру также до наступления атонального состояния (генерализованного судорожного припадка или остановки дыхания) [16]. На 7-е сут после моделирования энцефалопатии у животных вырабатывался условный рефлекс пассивного избегания. Опытным животным, начиная с 7-х сут эксперимента, перорально в течение 2 дней вводили имГЭАГА (полученную по примеру 1) в дозе 10 ЕД/кг. Контрольным животным по той же схеме в эквивалентном объеме вводили дистиллированную воду. Проверка сохранности рефлекса и ориентировочно-исследовательского поведения в открытом поле осуществлялась на 14, 21-е сут опыта. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.

В ходе эксперимента гипоксическое воздействие приводило к формированию энцефалопатии. Наблюдалось увеличение общей двигательной активности мышей в открытом поле, числа горизонтальных перемещений и повышение коэффициента асимметрии движений. В то же время отмечалось резкое падение уровня воспроизведения условного рефлекса пассивного избегания и спонтанная смертность животных на протяжении всего периода наблюдения, достигающая на 21-е сут 38,3%.

При введении имГЭАГА наблюдался выраженный терапевтический (церебропротекторный) эффект. Использование препарата полностью отменяло появление признаков энцефалопатии (табл.7, 8).

Кроме того, с помощью культуральных методов [17] на 10-е сут опыта определялось содержание нейральных предшественников в паравентрикулярной области головного мозга. В ходе исследований было обнаружено значительное увеличение их числа у животных, получавших имГЭАГА (табл.9).

Таким образом, препарат имГЭАГА обладал выраженным лечебным действием в отношении постгипоксической энцефалопатии, причем его терапевтический эффект проявлялся при начале введения средства после формирования патологического состояния. При этом действие препарата было связано со стимуляцией механизмов регенерации «глубокого» резерва, определяемых функциональной активностью эндогенных стволовых клеток организма.

Полученные результаты свидетельствуют, что средство, представляющее собой иммобилизированную с помощью ионизирующего излучения гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазу, обладает выраженной регенеративной активностью и терапевтическими свойствами при дегенеративных заболеваниях: сахарном диабете, циррозе печени, фиброзе легких и энцефалопатии. При этом механизмами действия препарата является стимуляция собственных регенераторных резервов организма, определяемых эндогенными стволовыми клетками различных классов [17].

Предлагаемое средство может быть использовано в регенеративной медицине с целью реализации неинвазивной стратегии проведения клеточной терапии, основанной на принципе фармакологической стимуляции эндогенных стволовых клеток [1, 2, 8].

Цитируемая литература

1. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. Клеточная терапия: новые подходы // Наука в России. - Москва: Изд-во «Наука», 2009. - Том. 169. - №1. С.4-8.

2. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н., Мирошниченко Л.А., Симанина Е.В., Ставрова Л.А., Удут Е.В., Фонима Т.Н., Ветошкина Т.В., Хричкова Т.Ю., Ермакова Н.Н., Плотников М.Б., Алиев О.И., Чернышова Г.А. Фармакологические аспекты регенеративной медицины // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2008. - Приложение 2. - С.14-21.

3. Машковский М.Д. Лекарственные средства: 15-е изд. - М.: OO «Издательство Новая Волна», 2008. - 1206 с.

4. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов ВВ., Верещагин Е.И., Удут Е.В., Хричкова Т.Ю., Симанина Е.В., Ставрова Л.А., Андреева Т.В., Минакова М.Ю., Мадонов П.Г., Киншт Д.Н. Регуляция функций прогениторных клеток с помощью гиалуронидазы // Вестник РАМН. - 2009. - №11. - С.6-9.

5. Патент (RU) на изобретение №2416427 «Средство, обладающее гипогликемическим действием при инсулиннезависимом сахарном диабете» (опубл. 20.04.2011, Бюл. №11). Авторы: Артамонов А.В., Бекарев А.А., Верещагин Е.И., Дыгай A.M., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н., Удут В.В.

6. Патент (RU) на изобретение №2414926 «Гемостимулирующее средство и способ стимуляции гемопоэза» (опубл. 27.03.2011, Бюл. №9). Авторы: Артамонов А.В., Бекарев А.А., Верещагин Е.И., Дыгай A.M., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н., Удут В.В.

7. Патофизиология: Учебник для медицинских ВУЗов. / Под ред. В.В. Новицкого, Е.Д. Гольдберга. - Томск: Изд-во Томского ун-та, 2001. - 681-687.

8. Дыгай A.M., Зюзьков Т.Н., Жданов В.В., Мадонов П.Г., Артамонов А.В., Бекарев А.А., Удут В.В. Иммобилизированный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор. Фармакологические свойства и перспективы использования. - Томск: Изд-во: ООО «Печатная мануфактура», 2011. - 149 с.

9. Stern R. Devising a pathway for hyaluronan catabolism: are we there yet? // Glycobiology. - 2003. - Vol.13. - №12. - P.105-115.

10. Henry C.B., Duling, B.R. Permeation of the luminal capillary glycocalyx is determined by hyaluronan // Am. J. Physiol. - 1999. - №277. - P.508-514.

11. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. / Под общей редакцией член-корр. РАМН, проф. Р.У.Хабриева. - 2-изд., перераб. и доп. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - 832 с.

12. Патент (RU) на изобретение №2313361 «Средство, обладающее антидиабетической активностью», 2007 г. (опубл. 27.12.2007, Бюл. №36). Авторы: Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. и др.

13. Патент (RU) на изобретение №2308281 «Способ клонирования in vitro регионарных стволовых клеток поджелудочной железы», 2007 г. (опубл. 20.10.2007, Бюл. №29). Авторы: Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В.

14. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия.- М.: Медицина, 1990. - 382 с.

15. Дыгай A.M., Скурихин Е.Г., Андреева Т.В. и др. Реакции системы крови и стволовых клеток в условиях блеомициновой модели фиброза легких // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2011. - №8. - С.132-136.

16. Патент (RU) на изобретение №2240604 «Способ моделирования постгипоксической энцефалопатии и связанных с ней нарушений в системе крови», 2004 г. (опубл. 20.11.2004 г., Бюл. №32). Авторы: Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Суслов Н.И.

17. Патент (RU) на изобретение №2284060 «Способ экспериментальной терапии энцефалопатии», 2006 г. (опубл. 20.09.2006 г., Бюл. №26). Авторы: Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Суслов Н.И.