Результат интеллектуальной деятельности: КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ РАКА ЯИЧНИКА ЧЕЛОВЕКА 533 OOS

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к полученной новой клеточной линии рака яичника 533 OOS, обладающей стабильными морфологическими и культуральными характеристиками. Данная клеточная линия может использоваться в активной специфической иммунотерапии солидных опухолей для создания биомедицинских клеточных продуктов, пригодна для лабораторных исследований с целью разработки диагностических наборов и тест-систем для определения активности фармацевтических препаратов. Клеточная линия депонирована в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК (П) 742Д.

Злокачественные новообразования яичника являются одной из ведущих локализаций в общей структуре онкологической заболеваемости на территории Российской Федерации и согласно статистическим данным составляют 2,4%, а наибольший удельный вес в структуре онкологической заболеваемости женщин имеют злокачественные новообразования органов репродуктивной системы (39,4%) [Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. Злокачественные новообразования в России в 2014 году (заболеваемость и смертность) – М.: МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России, - 2016. - илл. - 250 с. ISBN 978-5-85502-219-3].

Каждый год в мире регистрируется более 225 тысяч новых случаев карциномы яичника, из которых около 140 тыс. заканчиваются летально [Никогосян C.O., Кузнецов В.В. Современная диагностика рака яичников // Российский онкологический журнал. - 2013. - №5. - С. 52-56]. Несмотря на достигнутые успехи в диагностике карциномы яичника, около 75% ее выявляется на поздних стадиях. Пятилетняя выживаемость при третьей стадии составляет около 23,8%, при 4-й стадии всего лишь 11,6%.

Благодаря успехам в развитии хирургических технологий и химиотерапии был достигнут значительный прорыв в увеличении эффективности лечения опухолей яичника, однако, клинические исследования последних лет идут по пути изучения модификаций уже известных схем, присоединения дополнительных компонентов к уже известному режиму, анализа различных путей введения цитостатиков, активного использования хирургии на различных этапах лечения заболевания [Хохлова СВ. Новый взгляд на лечение рака яичников // Опухоли женской репродуктивной системы. - 2010. - №.1. - С. 68-71].

Таким образом, хирургические и терапевтические подходы имеют существенные ограничения в лечении диссеминированных форм рака яичника, и на первый план выходит индивидуальный подбор лечения с учетом молекулярно-биологических и генетических характеристик опухоли [Coosemans A., Baert Т., Vergote I. A view on dendritic cell immunotherapy in ovarian cancer: how far have we come? // Facts Views Vis Obgyn. - 2015. - 7(1). - P. 73-8]. Европейской комиссией одобрено применение Bevacizumab (Авастин), который эффективен при некоторых формах рака яичника [Heitz F., Harter P., Barinoff В. et al. Bevacizumab in the treatment of ovarian cancer // Adv Ther. - 2012. - 29:723-735]. В настоящее время активно разрабатываются противоопухолевые вакцины на основе дендритных клеток (ДК) для лечения этого вида злокачественного новообразования [Baert Т., Vergote I., Coosemans A. Ovarian cancer and the immune system // Gynecol Oncol Rep. - 2017. - Jan 6; 19. - P. 57-58. - doi: 10.1016/j.gore.2017.01.002]. За последние 14 лет было предпринято 13 исследований различных ДК-вакцин, в которых участвовало 148 больных раком яичника, и были получены чрезвычайно вариабельные результаты, что говорит о больших потенциальных возможностях совершенствования этого метода иммунотерапии.

Эффективность противоопухолевой вакцины зависит от точности определения возможных мишеней для иммунного ответа на молекулярном уровне.

Опухолеассоциированные антигены (ОАА), выявляемые на клетках злокачественных опухолей человека и определяемые только у небольшого числа нормальных клеток, потенциально могут быть использованы в качестве материала для приготовления вакцин [Papaioannou N.E., Beniata O.V., Vitsos P. et al. Harnessing the immune system to improve cancer therapy // Ann Transl Med. - 2016. - Jul; 4(14). - P. 261. - doi: 10.21037/atm.2016.04.01]. В качестве носителей ОАА используют аутологичные и аллогенные цельные или лизированные опухолевые клетки, причем каждая опухолевая клеточная линия обладает специфическим уникальным набором ОАА, и расширение спектра клеточных линий позволяет создать более широкий пул данных антигенов, которые могут быть доступны для антигенпрезентирующих клеток, таких как ДК в процессе манипуляций in vitro при создании противоопухолевых вакцин, что позволяет с наибольшей эффективностью индуцировать противоопухолевый иммунитет [Monjazeb A.M., Hsiao Н.Н., Sckisel G.D., Murphy W.J. The role of antigen-specific and non-specific immunotherapy in the treatment of cancer // J Immunotoxicol. - 2012. - Jul-Sep; 9(3). - P. 248-58. - doi: 10.3109/1547691 X.2012.685527].

В настоящее время проведены клинические исследования дендритно-клеточных вакцин для лечения рака яичников, когда для активации ДК в системе in vitro использовали опухолевый лизат [Bapsy P.P., Sharan В., Kumar С. Open-label, multi-center, non-randomized, single-arm study to evaluate the safety and efficacy of dendritic cell immunotherapy in patients with refractory solid malignancies, on supportive care // Cytotherapy. - 2014. - Feb; 16(2). - P. 234-44. - doi: 10.1016/jJcyt.2013.11.013] и пептиды, синтезированные на основе ОАА - WT1, СА125 [Kobayashi М., Chiba A., Izawa Н. et al. The feasibility and clinical effects of dendritic cell-based immunotherapy targeting synthesized peptides for recurrent ovarian cancer // J Ovarian Res. - 2014. - May 7; 7:48. - doi: 10.1186/1757-2215-7-48], MUC-1 [Mitchell P.L., Quinn M.A., Grant P.T. et al. A phase 2, single-arm study of an autologous dendritic cell treatment against mucin 1 in patients with advanced epithelial ovarian cancer // J Immunother Cancer. - 2014. - Jun 18; 2:16. - doi: 10.1186/2051-1426-2-16]. При этом достигнутый клинический эффект (полный и/или частичный регресс) составил от 3 до 14% случаев. Улучшить результаты возможно с помощью создания противоопухолевых вакцин на основе ДК, активированных многокомпонентными опухолевыми клеточными лизатами, богатыми ОАА. Для этого необходимо иметь разнообразный спектр характеризованных линий малигнизированных клеток опухолей разных локализаций.

Современный арсенал моделей экспериментальной онкологии включает спонтанные, перевиваемые и индуцированные опухоли животных; опухоли человека, перевитые иммунодефицитным животным; культуры опухолевых клеток человека и животных; молекулярно-генетические модели, что позволяет изучать особенности патогенеза различных опухолей, закономерности их возникновения и роста, механизмов их метастазирования. Наиболее часто в этих целях используют культуры опухолевых клеток и разнообразные модельные системы in vitro. Существование банков постоянных линий опухолевых клеток позволяет проводить исследования на идентичном материале, что важно для выработки стандартных подходов к решению ряда проблем в биологии и медицине. В настоящее время работы по приготовлению клеточных линий приобрели систематический характер, однако, каждая полученная клеточная линия имеет индивидуальные неповторяющиеся свойства и характеристики, так как является продуктом, полученным из биологического материала конкретного индивидуума.

Техническим результатом изобретения является расширение арсенала клеточных линий, используемых для создания цельноклеточных и генно-инженерных противоопухолевых вакцин, что дает возможность повысить эффективность лечения и увеличить продолжительность жизни при лечении злокачественных новообразований. Кроме того, полученная новая клеточная линия может использоваться для тестирования активности различных фармацевтических препаратов, создания диагностических наборов и тест-систем для разработки новых лекарственных средств и новых терапевтических подходов.

Указанный технический результат достигается тем, что получена новая клеточная линия рака яичника 533 OOS, экспрессирующая специфические опухолеассоциированные антигены, используемая для приготовления биомедицинских клеточных продуктов и тестирования противоопухолевых препаратов, хранится в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК (П) 742Д.

Полученная клеточная линия 533 OOS обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками.

Родословная клеточной линии 533 OOS представлена следующим образом.

Культура клеток рака яичников 533 OOS приготовлена из асцитической жидкости брюшной полости больной О., 52 г., проходившей лечение в специализированном онкологическом медицинском учреждении. Материал получен асептически в результате лапарацентеза.

Получение клеточной линии 533 OOS было осуществлено следующим образом.

Асцетическая жидкость, содержащая взвесь опухолевых клеток, была получена в количестве 50 мл в результате лапарацентеза. Асцетическую жидкость разводили питательной средой DMEM/F12 для культивирования клеток в соотношении 1:1 и центрифугировали 10 мин 1000 об/мин. Удаляли надосадок и суспендировали полученные клетки в полной среде, затем переносили в культуральную посуду, в которой осуществляли культивирование в течение длительного времени. Стабильно растущая клеточная линия была получена на 20 пассаже.

Морфологические признаки клеточной линии 533 OOS характеризуются следующим образом.

Культура представлена клетками округлой формы, иногда с двумя-тремя длинными отростками и крупными ядрами. Встречаются клетки фибробластоподобной формы. 58% клеток окрашиваются антителами против Ki-67.

Маркерные признаки клеточной линии 533 OOS следующие.

Методом иммуноцитохимии определена эпителиальная природа культивируемых клеток - в 98% клеток присутствуют цитокератины, индентифицируемые с помощью реагента АЕ1/АЕ3, представляющим смесь двух моноклональных антител, способных идентифицировать большую часть цитокератинов человека с молекулярным весом от 40 до 67 кД.

Методом иммуноцитохимии определена экспрессия

опухолеассоциированных антигенов WT1 и СА-125.

Культуральные свойства клеточной линии 533 OOS представлены следующим образом.

Клеточная линия культивируется в питательной среде DMEM/F12 с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки, глутамина, инсулина (5 мкг/мл), трансферрина (5 мкг/мл), селена (5 нг/мл), антибиотиков (пенициллин со стрептомицином в концентрации: 100 ед/мл и 100 мкг/мл, соответственно). Культивирование осуществляется при 37°С, 5% СO₂, 100% влажности. Культура имеет адгезионный монослойный тип роста. Во флаконы объемом 25 см² в 5 мл среды засевают 1×10⁶ клеток. При субкультивировании клетки снимаются 1 раз в неделю в соотношении 1:2 с использованием стандартных растворов 0,25% трипсина и 0,02% раствора версена (1:1).

Условия криоконсервации следующие.

Для длительного хранения клетки консервируют путем замораживания в жидком азоте. Криосреда: DMEM/F12 50%, эмбриональная телячья сыворотка 40%, DMSO 10%; 3×10⁶ клеток/мл на ампулу. Клетки клеточной линии ресуспендируют в среде для замораживания. Режим замораживания: жидкий азот, снижение температуры на 1°С в минуту до минус 25°С, затем быстрое замораживание до минус 70°С. Хранение в жидком азоте при температуре минус 196°С. Размораживание быстрое, при 37°С. Клетки разводят в 10 мл бессывороточной среды и осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды, содержащей 20% эмбриональной телячьей сыворотки, и переносят в культуральный флакон объемом 25 см². Жизнеспособность клеток оценивают по включению трепанового синего. Жизнеспособность клеток после криоконсервации составляет 93%.

Контаминация исследована следующим образом.

При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Методом ПНР были проведены исследования на наличие Mycoplasmapneumonia, genitalium, hominis - тест на микоплазму отрицателен.

Кариологическая характеристика клеточной линии 533 OOS следующая.

Выявлено три субклона:

46, XX, mar(11?) - 40%

41,ХХ,-10,-12,-15,-21,-22,mar(11?) - 20%

41,XX,-l,-l,-3,-3,-5,-8,-12,-12,-13,-13,-15,+10,+10,+17,mar(11?) - 10%

Остальные 30% составляют варианты основных представленных клонов, которые отличаются по числу отсутствующих и лишних хромосом, в том числе и маркерных.

Использование клеточной линии 533 OOS представлено следующими примерами.

Пример 1. Использование клеточной линии 533 OOS для приготовления противоопухолевых вакцин на основе активированных дендритных клеток.

1. Клеточная линия 533 OOS культивировалась в пластиковых флаконах в полной питательной среде DMEM/F12 с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки, глутамина, инсулина (5 мкг/мл), трансферрина (5 мкг/мл), селена (5 нг/мл), пенициллина (100 ед/мл), стрептомицина (100 мкг/мл). Культивирование осуществлялось при 37°С, 5% СО₂, 100% влажности в СO₂-инкубаторе «Heracel» (Termo Electron LTD GmbH, Германия).

2. При достижении конфлюэнтного монослоя производили пересев клеток и дальнейшее пассирование культуры с рассевом 1:2.

3. Из флакона удаляли культуральную среду, омывали поверхность флакона небольшим количеством ферментативного раствора (0,25% трипсина и 0,02% раствора версена в равных пропорциях) и затем к клеткам добавляли 1-3 мл этого раствора. Помещали флаконы в СО₂-инкубатор и проводили визуальный контроль состояния клеток.

4. Клетки собирали серологической пипеткой, отмывали двукратным центрифугированием в 10 мл 0,9% физиологического раствора при 1000 об/мин в течение 10 мин.

5. Производили подсчет клеток и оценку их жизнеспособности.

6. Для приготовления опухолевого лизата клетки линии 533 OOS проводили 6 последовательных циклов моментального замораживания до -196°C и оттаивания до комнатной температуры в фосфатно-солевом буфере без криопротектора, качество лизиса контролировали с помощью 0,1% трипанового синего и светового микроскопа.

7. Осуществляли осаждение клеточного детрита центрифугированием (10 мин, 3000 об/мин), фильтрацию надосадочной фракции через фильтр 0,2 мкм и расфасовку опухолевого лизата в криопробирки для хранения при -20°С до использования.

8. Вносили лизат с клеточной линией 533 OOS в культуры незрелых дендритных клеток пациентов с раком яичника на 5-й день культивирования в соотношении 3 лизированные опухолевые клетки: 1 ДК, добавляли ростовые факторы: гранулоцитарно-макрофагальный фактор роста (72 нг/мл), интерлейкин 4 (20 нг/мл) и фактор некроза опухолей альфа (20 нг/мл). Икубировали в условиях 37°С, 5% СО₂, 100% влажности в СO₂-инкубаторе «Heracel» (Termo Electron LTD GmbH, Германия) в течение 48 часов.

9. В результате получали активированные ДК с иммунофенотипом CD14^-/CD1a^-/CD83⁺/CD80⁺/CD86⁺/HLADR⁺.

Пример 2. Использование клеточной линии 533 OOS для создания модельной системы, позволяющей оценить инвазивный потенциал опухолевых клеток.

1. Клеточную линию 533 OOS культивировали как описано выше. Для оценки миграционной активности клетки собирали после пересева, осуществляли подсчет их количества и оценку жизнеспособности и высевали в количестве 5×10⁴ в мл в объеме 500 мкл среды DMEM/F12 без сыворотки в предварительно подготовленные инсерты с диаметром пор 8 мкм (BD, Falcon, США), которые помещали в лунки 24-луночной планшеты с 750 мкл полной культуральной среды. Инкубировали в течение ночи в стандартных условиях культивирования: при 37°С, 5% СO₂, 100% влажности в СO₂-инкубаторе «Heracel» (Termo Electron LTD GmbH, Германия).

2. Для изучения способности опухолевых клеток к инвазии вносили предварительно в инсерты по 100 мкл матригеля (BD, Falcon, США), разведенного питательной средой DMEM/F12 без сыворотки в соотношении 1:5. Все манипуляции с матригелем производили при 4°С, после внесения матригеля инсерты инкубировали в течение 2 часов при 37°С для его полимеризации. Далее на матригель наносили суспензию 5×10⁴ в мл клеток линии 533 OOS в объеме 500 мкл. Инкубировали в течение ночи в стандартных условиях культивирования.

3. После инкубации инсерты удаляли из планшета, промывали раствором фосфатно-солевого буфера (PBS), фиксировали 3,7% раствором формальдегида в PBS в течение 3 мин, в абсолютном метаноле 20 мин, после чего окрашивали по Романовскому-Гимза. Ватной палочкой удаляли эмигрировавшие и неинвазивные клетки, затем высушивали инсерты.

4. Анализ производили с помощью инвертированного светового микроскопа в 5 полях зрения при увеличении ×200, подсчитывая количество клеток линии 533 OOS на обратной стороне пористой мембраны инсерта.

5. Рассчитали инвазивный потенциал клеточной линии 533 OOS, определяя соотношение количества инвазивных клеток к количеству мигрировавших клеток, выраженному в процентах.

Заявляемый способ расширяет арсенал клеточных линий, используемых для создания цельноклеточных и генно-инженерных противоопухолевых вакцин, что дает возможность повысить эффективность лечения и увеличить продолжительность жизни при лечении злокачественных новообразований. Полученная новая клеточная линия может использоваться для тестирования активности различных фармацевтических препаратов, создания диагностических наборов и тест-систем для разработки новых лекарственных средств и новых терапевтических подходов.