Способ прогнозирования наступления беременности в программе экстракорпорального оплодотворения

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, репродуктологии, может быть использовано для оптимизации программы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).

Эффективность ЭКО в настоящее время не превышает 35%, и около трети всех беременностей прерывается на ранних сроках [1]. Оценка степени зрелости ооцитов по состоянию комплексов ооцитов-cumulus весьма субъективна и часто не соответствует истинному состоянию ооцита [2, 3, 6]. Фолликулярная жидкость (ФЖ) может быть получена в достаточном количестве во время программы ЭКО и является единственной натуральной средой для развития ооцитов, обладающей всеми необходимыми компонентами, гормональными и биохимическими [4, 5]. Фолликулярная жидкость - это биологическая жидкость, которая синтезируется фолликулярным эпителием, расположенным вокруг ооцита второго порядка, таким образом, она является микроокружением развивающегося ооцита [4, 5]. Избыток или недостаток биологически активных веществ в фолликулярной жидкости оказывает негативное влияние на развитие ооцита [6, 7]. Поэтому исследование физико-химических свойств ФЖ представляет интерес в плане обоснования новых подходов к прогнозу имплантации эмбриона и благоприятного течения беременности [7]. Однако ФЖ исследуют сравнительно редко.

Известен способ прогнозирования результатов лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения (патент RU N 2357673, МПК G01N 33/52), который заключается в том, что у больных с бесплодием проводят трансвагинальную пункцию фолликулов под контролем УЗИ, забирают ФЖ, подвергают ее хемилюминесцентному анализу по стандартной методике, определяют свободнорадикальную (CP) активность образцов и по показателю общей антиоксидантной активности (АОА) дают прогноз наступления беременности. При показателях АОА 0,05 и выше дают неблагоприятный прогноз, при АОА ниже 0,05 дают благоприятный прогноз - вероятность наступления беременности более 50%.

Однако для использования данного способа необходимо приобрести специальную аппаратуру «Биохемилюминометр БХЛ-06» (разработка Нижегородского НИЦ "Биоавтоматика"). Также необходимы дополнительные реактивы: 0,05 мм раствор сульфата железа, 2% раствор перекиси водорода, фосфатный буфер. Это все усложняет и увеличивает стоимость исследования, кроме того, исследованию подвергают только фолликулярную жидкость. Данное исследование не позволяет пациентке с отрицательным результатом дать рекомендации для лечения с целью получения положительного результата в программе ЭКО.

Известен также способ прогнозирования наступления беременности в программе экстракорпорального оплодотворения при селективном переносе эмбрионов путем оценки молекулярно-генетического профиля гамет с помощью ПЦР-РВ (патент RU N 2550965, МПК G01N 33/53), взятый в качестве прототипа, заключающийся в том, что прогнозирование наступления беременности в программе ЭКО и селективном переносе эмбрионов проводят путем комплексной оценки транскриптомного профиля гамет с помощью ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ), оценивают уровень транскриптов: генов ростовых факторов (AREG, EREG, IGF1, IGFBP4), маркера апоптоза (BIRC5) в клетках фолликулярной жидкости, полученных в день трансвагинальной пункции яичников, а также соотношения уровня экспрессии мРНК протаминов (PRM2 : PRM1) в сперме, использованной для оплодотворения.

Это дорогостоящий, многоэтапный, трудоемкий способ, требующий выделение рибонуклеиновой кислоты (РНК), реакцию обратной транскрипции, проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР). Кроме того, данный способ констатирует только факт и не позволяет определить последующее лечение для наступления беременности в программе ЭКО.

Задачей изобретения является создание простого способа, позволяющего дать рекомендации по лечению женского бесплодия для наступления беременности в программе ЭКО.

Поставленная задача решается тем, что согласно способу прогнозирования наступления беременности в программе экстракорпорального оплодотворения при селективном переносе эмбрионов путем оценки ооцитов, включающему проведение трансвагинальной пункции фолликулов под контролем ультразвукового исследования (УЗИ) с последующим исследованием полученной фолликулярной жидкости, содержащей ооцит-кумулюсный комплекс, дополнительно анализу подвергают сыворотку крови, полученную в день пункции фолликула, и вычисляют значение канонической линейной дискриминантной функции (КЛДФ) по формуле

КЛДФ=23,44*Mg²⁺СК+3,45*Zn²⁺СК+49,94*Mg²⁺ФЖ+5,65*Zn²⁺ФЖ,

где КЛДФ - значение канонической линейной дискриминантной функции;

Mg²⁺СК - концентрация ионов магния в сыворотке крови, ммоль/л;

Zn²⁺СК - концентрация ионов цинка в сыворотке крови, мкмоль/л;

Mg²⁺ФЖ - концентрация ионов магния в фолликулярной жидкости, ммоль/л;

Zn²⁺ФЖ - концентрация ионов цинка в фолликулярной жидкости, мкмоль/л,

и при значении КЛДФ≥140,94 делают заключение о благоприятном прогнозе наступления беременности.

Заявленный способ является простым, доступным, экономичным. Позволяет делать прогноз по наступлению беременности в программе ЭКО, давать рекомендации по лечению женского бесплодия для наступления беременности. Позволяет проводить коррекцию микроэлементов в сыворотке крови и фолликулярной жидкости, ускоряет получение результатов исследования (результаты известны в течение 30 мин).

Заявленный способ поясняется графическим изображением, на котором показан график прогнозирования наступления беременности в программе экстракорпорального оплодотворения, где по оси «х» отложен номер образца, а по оси «y» - значение КЛДФ.

Способ осуществляется следующим образом: натощак, перед пункцией, производят забор венозной крови для получения сыворотки крови и определяют концентрацию ионов магния и цинка методом абсорбции на автоанализаторе «Сlima МС-15». Одновременно производят трансвагинальную пункцию фолликулов под контролем ультразвукового исследования и забор фолликулярной жидкости, исследованию подлежит ФЖ, содержащая ооцит-кумулюсный комплекс. ФЖ аспирируют под отрицательным давлением 130-150 мм вод. ст., создаваемого с помощью специального вакуумного отсоса. ФЖ центрифугируют 10 мин на 1000 оборотах, после чего она не содержит примеси крови. В полученной ФЖ определяют концентрацию ионов магния и цинка и вычисляют значение канонической линейной дискриминантной функции (КЛДФ) по формуле

КЛДФ=23,44*Mg²⁺СК+3,45*Zn²⁺СК+49,94*Mg²⁺ФЖ+5,65*Zn²⁺ФЖ,

где КЛДФ - значение канонической линейной дискриминантной функции;

Mg²⁺СК - концентрация ионов магния в сыворотке крови, ммоль/л;

Zn²⁺СК - концентрация ионов цинка в сыворотке крови, мкмоль/л;

Mg²⁺ФЖ - концентрация ионов магния в фолликулярной жидкости, ммоль/л;

Zn²⁺ФЖ - концентрация ионов цинка в фолликулярной жидкости, мкмоль/л,

и при значении КЛДФ≥140,94 делают заключение о благоприятном прогнозе наступления беременности.

В клиническое исследование были включены 75 пациенток с бесплодием, вступившие в программу экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Основными показаниями к ЭКО были трубное бесплодие, бесплодие, ассоциированное эндометриозом I, II и III стадии, эндокринное бесплодие, связанное с отсутствием овуляции и мужское бесплодие с легкой патологией спермы. Возрастной интервал обследуемых пациенток находился в пределах от 25 до 45 лет. Средний возраст пациенток 33,8±0,9 года. Продолжительность менструального цикла от 25 до 30 суток. До включения в исследование ИМТ женщин составлял 17,8-35 кг/м². Кроме того, в исследование не включали женщин, которые до этого перенесли пять и более неудачных циклов ЭКО подряд либо имели в анамнезе цикл с длительной (более 20 дней) стимуляцией гонадотропинами, цикл, прерванный вследствие отсутствия ответа на стимуляцию, а также женщины, перенесшие предшествующий цикл ЭКО с неудачей оплодотворения.

Всем пациенткам проводилась контролируемая стимуляция овуляции в протоколе с антагонистами: с второго дня менструального цикла пациентке вводили человеческий менопаузальный гонадотропин (ЧМГ) средняя доза 2000 ME, при достижении фолликулами средних размеров 14 мм для предотвращения паразитарного пика ЛГ назначен антагонист ГнРГ (оргалутран 0,25 мг подкожно) до введения овуляторной дозы хорионического гонадотропина. Стимуляция овуляции продолжалась в течение 10,1±0,3 дней. Проводили индивидуальную коррекцию дозы в зависимости от роста фолликулов. При достижении не менее трех фолликулов диаметром 17 мм для стимуляции окончательного созревания фолликулов вводили подкожно хорионический гонадотропин альфа, 250 мкг (ОВИТРЕЛ; Serono). Трансвагинальная аспирация фолликулов проводилась через 36 ч после введения триггера.

Изобретение получено на основании результатов лечения и статистического анализа 75 пациенток с бесплодием, связанным с трубным фактором, с отсутствием овуляции и бесплодие, ассоциированное эндометриозом. В зависимости от исхода программы ЭКО все пациентки были разделены на три группы. К I группе отнесены пациенты с отрицательным результатом лечения бесплодия, у которых уровень -ХГ был менее 30 мМЕ/мл (n=39). Группу II составили пациенты с биохимической беременностью, не подтвержденной далее ультразвуковыми данными, при которой на 14 день после переноса эмбрионов уровень субъединицы хорионического гонадотропина (-ХГ) составлял 30 мМЕ/мл и более, «преэмбрионические потери» (n=12). В III группу вошли женщины с положительным результатом - клиническая беременность (n=24).

Статистический анализ полученного комплекса данных проведен при помощи пакета «Анализ данных» и набора математических и статистических функций (Excel 2003), а также с использованием стандартных пакетов прикладного статистического анализа Statistica 6.0. При сравнении биохимических показателей фолликулярной жидкости и сыворотки крови использовали t-критерий Стьюдента. Проведен анализ результатов с применением канонической линейной дискриминантной функции.

На основании экспериментальных данных при сравнении групп пациенток с наступившей беременностью и отрицательным результатом программы ЭКО были получены и проанализированы результаты с применением КЛДФ (см. график «Прогнозирование наступления беременности в программе ЭКО на основании КЛДФ»). При значении КЛДФ≥140,94 делают заключение о благоприятном прогнозе наступления беременности. Из функции видно, что на положительный результат программы ЭКО имеет влияние переменная Mg²⁺ФЖ и Zn²⁺ФЖ. В тоже время наибольшее влияние имеет переменная Mg²⁺ФЖ.

Пример 1. Пациентка Б., 36 лет, стимуляция суперовуляции проводилась в протоколе с антагонистами. В результате трансвагинальной пункции было получено 7 ооцитов. Провели обследование концентрации ионов магния и цинка в сыворотке крови и фолликулярной жидкости. Mg²⁺СК=0,99 ммоль/л, Zn²⁺СК=9,3 мкмоль/л, Mg²⁺ФЖ=0,90 ммоль/л, Zn²⁺ФЖ=6,4 мкмоль/л. КЛДФ=134,0. Дан неблагоприятный прогноз. По настоянию пациентки процедура ЭКО была продолжена. На третьи сутки после оплодотворения 5 клеток остановились в развитии. Перенос одного 6-8-клеточного бластомера и одной ранней бластоцисты проводился на пятые сутки. На 14-е сутки после переноса эмбриона сдана кровь на хорионический гонадотропин. На 18-е сутки началась менструация. Даны рекомендации по дальнейшему лечению.

Пример 2. Пациентка К., 33 года, проведено обследование гормонального статуса. Выявлено снижение овариального резерва. Стимуляция суперовуляции проводилась в протоколе с антагонистами. В результате трансвагинальной пункции получено 3 ооцита. Провели обследование концентрации ионов магния и цинка в сыворотке крови и фолликулярной жидкости. Mg²⁺СК=0,80 ммоль/л, Zn²⁺СК=15,01 мкмоль/л, Mg²⁺ФЖ=0.78 ммоль/л, Zn²⁺ФЖ=13,9 мкмоль/л. КЛДФ=187,9. Дан благоприятный прогноз. На 5-е сутки произведен перенос одной бластоцисты. После переноса назначена поддерживающая терапия. На 14-е сутки после переноса эмбриона сдана кровь на хорионический гонадотропин, лечение закончено наступлением беременности.

Источники информации

1. Назаренко Т.А. Стимуляция функции яичников / Назаренко Т.А. - 5-е изд., доп. и перераб. - М.: МЕДпресс-информ, 2015. - 288 с.

2. Корсак В.С. Руководство по вспомогательным репродуктивным технологиям для врачей и эмбриологов. Спец. Изд. Мед. Книг, 2015. - 240 с.

3. Тишкевич О.Л. Эффективность ЭКО и частота многоплодной беременности в зависимости от числа и качества переносимых эмбрионов у женщин разного возраста. // Проблемы репродукции. - 2008. - Т. 2, N. 2. - С. 8-12.

4. Репродуктивная эндокринология // Под ред. С.С.К. Йена, Р.Б. Джаффе. - М.: Медицина, 1998.

5. Хонина Н.А., И.В. Айзикович, Е.Я. Шевела и др. Регуляторные факторы и цитокины в сыворотке и фолликулярной жидкости у женщин при контролируемой овариальной гиперстимуляции // Цитокины и воспаление. - 2005. - 2. - С. 22-28.

6. Яманова М.В., Светлаков А.В., Салмина А.Б., Пожиленкова Е.А., Гончарова Л.Л. Микроокружение ооцитов при эндокринном бесплодии // Проблемы репродукции. - 2004. - 4. - С. 46-49.

7. Scalicietal Е. Cell-free DNA in Human Follicular Fluid as a Biomarker of Embryo Quality. Hum Reprod. 2014; 29(12): 2661-2669.