Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ РАСЧЕТА ПРОГНОЗА РАННЕГО ПРОГРЕССИРОВАНИЯ МЕЛАНОМЫ КОЖИ

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано при лечении меланомы кожи для расчета прогноза его раннего прогрессирования.

Меланома кожи является опасным заболеванием с агрессивным клиническим течением и ранним прогрессированием. Основными маркерами прогноза течения меланомы кожи являются морфологические критерии толщины опухоли по Бреслоу и глубины инвазии по Кларку.

Своевременная диагностика и лечение меланомы предполагают хорошие результаты и полное выздоровление. Однако практикующим онкологам хорошо известны клинические случаи, когда при тонких меланомах развивалось раннее прогрессирование заболевания, и наоборот, при большой толщине опухоли пациенты вступали в стойкую ремиссию (см. Марочко, А.Ю. Особенности клинического течения невогенной меланомы кожи и возникшей de novo / А.Ю. Марочко // Дальневосточный медицинский журнал. - 2009. - №2. - С. 39-41).

Кроме вышеописанных характеристик, известно прогностическое значение биологических свойств опухоли, в частности, анеуплоидности (см. Renard, N. Characterization of the nuclear deoxyribonucleic acid content and nuclear morphometry in 71 primary cutaneous melanomas / N. Renard, D. Goldschmidt, C. Decaestecker [et al.] // Dermatology. - 1997. - Vol. 194. - P. 318-324; см. Talve, L.A. P90 exceed in grate as a prognostic factor in primary malignant melanoma of the skin. ADNA image cytometric study / L.A. Talve, Y.U. Collan, Т.О. Ekfors [et. al] // Ann. Quant. Cytol. Histol. - 1997. - Vol. 19. - P. 393-403).

Из литературных источников известно, что меланома кожи является иммуногенной опухолью (см. Haass, N.K. Melanoma biomarkers: current status and utility in diagnosis, prognosis, and response to therapy / N.K. Haass, K.S. Smalley // Mol. Diagn. Ther. - 2009. - №13. - P. 283-296; Veronesi U., Cascinelli N. Narrow excision (1 sm): A safe procedure for thin cutaneous melanoma // Arch. Surg. 1991, Vol. 126. P. 438; см. Марочко А.Ю. Клинические факторы прогноза при меланоме кожи / Марочко А.Ю. Боровская Т.Ф., Соболева В.Ю. // Тихоокеанский медицинский журнал. - 2011. - №1. - С. 86-89).

Большое значение локальных иммунных процессов, возникающих в микроокружении опухоли, не подлежит сомнению. Они играют важную роль в развитии заболевания и влияют на результаты лечения. Посредниками в межклеточных взаимодействиях являются цитокины (см. Бережная, Н.М. Иммунология злокачественного роста / Н.М. Бережная, В.Ф. Чехун. - Киев: Наукова Думка, 2005; см. Кетлинский, С.А. Цитокины / С.А Кетлинский, А.С. Симбирцев. - СПб: ООО «Издательство Фолиант», 2008. - С. 552; см. Хаитов, P.M. Физиология иммунной системы / P.M. Хаитов. - М: ВИНИТИ РАН. - 2001. - С. 222; см. Ярилин, А.А. Основы иммунологии / А.А. Ярилин. - М., Медицина 1999. - С. 456), дисбаланс которых является основой развития некоторых кожных заболеваний (см. Боровик, Т.Э. Кожа как орган иммунной системы / Т.Э. Боровик. С.Г. Макарова, С.Н. Дарчия [и др.] // Педиатрия. - 2010. - Т. 89. - №2. - С. 132-136; Ярилин, А.А. Кожа и иммунная система / А.А. Ярилин // Косметика и медицина. - 2001. - №2:5. - С. 13), а также меланомы кожи (см. Златник, Е.Ю. Факторы локального клеточного иммунитета при меланоме кожи / Е.Ю. Златник, А.В. Бахтин, С.С. Кочуев // Современные проблемы науки и образования. - 2015. - №5. - С. 88).

Из патентных источников известен способ прогнозирования рецидива у больных меланомой кожи (см. заявка на изобретение RU 2004107696 А, дата публикации заявки 10.09.2005). Изобретение относится к биохимическим исследованиям в области онкологии и может быть использовано для прогнозирования течения меланомы кожи у женщин репродуктивного возраста. Сущность изобретения состоит в том, что у женщин репродуктивного возраста определяют суточную экскрецию с мочой эстрона, эстрадиола и эстриола, рассчитывают величину соотношения экскреции эстриола к суммарной величине экскреции эстрадиола и эстрона после лечения и на этапе контрольного наблюдения, и при увеличении указанного соотношения прогнозируют рецидив через 11-12 месяцев после лечения. Однако с помощью данного способа можно прогнозировать течения МК только у женщин, что ограничивает его применение.

Из патентных источников также известен способ прогнозирования клинического течения увеальной меланомы на основе маркера апоптоза bax (см. патент RU 2208790 С1, опубл. 20.07.2003, Бюл. №20). Изобретение относится к области медицины, в частности к офтальмологии. С помощью иммуногистохимического анализа клеток удаленной опухоли определяют процент клеток, экспрессирующих Вах, по отношению к общему количеству опухолевых клеток в поле зрения и при их наличии 20% и более прогнозируют вероятность метастазирования в 80% случаев. Способ позволяет повысить точность и объективизацию прогнозирования клинического течения увеальной меланомы. Однако, на наш взгляд, данный способ, будучи основанным на ИГХ-методе, является полуколичественным и не может иметь математического подтверждения статистической достоверности.

Известно, что существует способ прогнозирования течения онкологических заболеваний (см. патент RU 2622756 С1, опубл. 19.06.2017, Бюл. №17). Сущность данного способа заключается в следующем. В периферической крови больного до и после лечения определяют количество Т-лимфоцитов CD3⁺, CD4⁺ и CD8⁺, CD⁺/CD8⁺, а также абсолютное количество Т-лимфоцитов CD3f, синтезирующих спонтанно и стимулированно провоспалительные цитокины: фактор некроза опухоли (TNF-α), интерлейкин - 2 (IL-2), интерферон γ (INF-γ). Для каждого показателя вычисляют «коэффициент реакции» по формуле: Kp=nCD3⁺_стим/nCD3⁺_спонт, где n - количество клеток Т-лимфоцитов CD3⁺, синтезирующих соответствующий цитокин. Затем вычисляют значение CD4⁺/CD8⁺ и при значении данного индекса ≥1, а также значении Кр в заданных пределах хотя бы для двух цитокинов, а именно: для TNF-α в пределах от 80 до 120, для IL-2 от 80 до 120, для INF-γ от 150 до 250, развитие заболевания прогнозируют как нормореактивное, прогноз благоприятный; при значении CD4⁺/CD8⁺<1, при значении Кр хотя бы для двух цитокинов выше верхнего предела, а именно: для TNF-α и для IL-2 выше 120, для INF-γ выше 250, развитие заболевания прогнозируют как гиперреактивное, прогноз благоприятный; при значении Кр хотя бы для двух цитокинов ниже нижнего предела, а именно: для TNF-α и для IL-2 ниже 80, для INF-γ ниже 150, развитие заболевания прогнозируют как гипореактивное, прогноз неблагоприятный; при значении CD4⁺/CD8⁺>1, при значении Кр хотя бы для двух цитокинов выше верхнего предела, а именно: для TNF-α и для IL-2 выше 120, для INF-γ выше 250, развитие заболевания прогнозируют как гиперреактивное, прогноз неблагоприятный; при значении Кр хотя бы для двух цитокинов ниже нижнего предела, а именно: для TNF-α и для IF-2 ниже 80, для INF-γ ниже 150, развитие заболевания прогнозируют как гипореактивное, прогноз благоприятный. Использование данного способа позволяет прогнозировать течение онкологических заболеваний, включая меланому кожи, путем оценки взаимосвязи между соотношением субпопуляций лимфоцитов и влиянием на течение опухолевого процесса цитокинов - TNF-α, IL-2 и INF-γ.

Для выполнения данного метода прогнозирования необходим динамический контроль показателей иммунного статуса в процессе лечения, а материалом для исследования является периферическая кровь. Однако известно, что локальные факторы иммунитета более точно отражают взаимоотношения опухоли и организма опухоленосителя (см. Бережная, Н.М. Иммунология злокачественного роста / Н.М. Бережная, В.Ф. Чехун. - Киев: Наукова Думка, 2005). Кроме того, уровень продукции провоспалительных цитокинов, который был исследован авторами, может быть результатом активности не только CD3⁺, но и других иммунокомпетентных и неиммунных клеток, присутствующих в очаге опухолевого роста, в частности, опухолевых, эндотелиоцитов и пр. (см. Хаитов, P.M. Физиология иммунной системы / P.M. Хаитов. - М: ВИНИТИ РАН. - 2001. - С. 222; см. Белова О.В. Роль цитокинов в иммунологической функции кожи / О.В. Белова, В.Я. Арион, В.И. Сергиенко // Иммунология, аллергология, инфектология. - 2008. - №1. - С. 41-55).

Большинство больных меланомой кожи прогрессируют в период 6-12 месяцев после проведения хирургического лечения. В связи с этим возникает необходимость в расчете прогноза риска развития прогрессирования и возможном изменении тактики лечения.

В связи с этим нами предлагается способ расчета прогноза раннего прогрессирования меланомы кожи по удельному содержанию некоторых интерлейкинов в ткани опухоли и ее перифокальной зоны.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка способа, позволяющего рассчитать риск раннего прогрессирования меланомы кожи.

Технический результат достигается тем, что в гомогенатах образцов ткани опухоли и прилежащей к ней визуально неизмененной ткани - перитуморальной зоне, взятых при хирургическом лечении по поводу меланомы кожи, методом иммуноферментного анализа определяют уровни цитокинов ИЛ-6 в ткани опухоли, ИЛ-2 и ИЛ-1β в ткани перитуморальной зоны, методом проточной цитометрии анализируют ДНК в ткани меланомы кожи, проводят клиническую оценку распространенности заболевания, затем рассчитывают индивидуальный риск прогрессирования меланомы кожи по формуле , где К - коэффициент прогноза, z - коэффициент линейной регрессии, рассчитываемый по формуле

z=(-4,1+0,065⋅Х1+0,037⋅Х2+1,06⋅Х3+3,81⋅Р-5,56⋅А), где X1 - содержание ИЛ-6 в ткани опухоли (пг/мл/г), Х2 - содержание ИЛ-1 β в ткани ПЗ (пг/мл/г), Х3 - содержание ИЛ-2 в ткани ПЗ (пг/мл/г), при этом номинальные показатели ранжируют следующим образом: распространенность опухолевого процесса (Р): 0 - местный, 1 - распространенный, 2 - генерализованный (Г), а также наличие анеуплоидного или диплоидного клона клеток (А): 1 - анеуплоидный клон, 0 - диплоидный клон, при значении, К равном или более 0,64, прогнозируют высокий риск развития раннего прогрессирования меланомы кожи, при значении К менее 0,64 - прогнозируют низкий риск развития раннего прогрессирования меланомы.

Изобретение «Способ расчета прогноза раннего прогрессирования меланомы кожи» является новым, так как не известно из области поиска критериев прогноза заболевания путем исследования локального цитокинового статуса.

Способ выполняется следующим образом.

Пациенту проводится оперативное лечение.

При помощи хирургических инструментов производится забор фрагмента опухоли и прилежащей к ней визуально неизмененной кожи (отступя в среднем 0,5 см от края опухоли) в объеме, достаточном для проведения исследования и не препятствующем гистологическому анализу.

Далее, не позднее чем через час, в гомогенатах тканей определяют уровни провоспалительных и противовоспалительных цитокинов (ИЛ-6 в ткани опухоли, ИЛ-1β и ИЛ-2 в ткани перифокальной зоны) методом ИФА (Вектор-Бест», Новосибирск). Результаты выражали в пг/мл, кроме того, в виде удельного содержания в пересчете на 1 г белка гомогената, определяемого биуретовым методом (пг/мл/г белка).

Для анализа ДНК в ткани опухоли использован проточный цитометр FACS CantoII (Becton Dickinson, USA) и CycleTEST™PLUS DNA ReagentKit.

Полученные нами данные о цитокиновом статусе ткани опухоли и ее микроокружения подвергнуты статистическому анализу при помощи программы Statistica 10.0 (StatSoft, США). При этом определены статистически достоверные критерии.

Математическая модель расчета риска прогрессирования меланомы кожи разработана посредством метода логистической регрессии при анализе полученных нами результатов обследования пациентов (см. Омельченко, В.П. Автоматизированные медико-технологические системы клинико-лабораторных исследований / В.П. Омельченко, А.А. Демидова // Медицинская информатика: Учебник. - М.: ГЭОТАР-Медиа. - 2016. - С. 395-427).

Поиск прогностических параметров (предикторов) прогрессирования меланомы кожи был осуществлен с помощью метода ROC-анализа (receiver operating characteristic) при оценке уровней локальных тканевых провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, клинических данных больных, ДНК-цитометрических параметров опухоли у пациентов с учетом наличия или отсутствия у них прогрессирования заболевания.

Основой ROC-анализа является построение так называемой ROC-кривой - графика, позволяющего оценить качество бинарной классификации, который отображает соотношение между долей объектов, верно классифицированных, как несущих признак, и долей объектов, не несущих признак, от общего количества носителей признака.

С помощью ROC-анализа для каждого предиктора определена дифференциальная точка разделения (cut-off), позволяющая с максимальной диагностической чувствительностью (ДЧ) и диагностической специфичностью (ДС) сформировать заключение о риске либо его отсутствии в отношении изучаемого события.

На ROC-кривой выстроено соотношение между ДЧ и ДС при различных уровнях показателя и найдена точка с максимальной ДЧ и ДС, соответствующая cut-off. Величина площади под ROC-кривой (area under ROC curve, AUC) позволила определить информативность лабораторного теста по стандартной шкале (табл. 1) (см. Гринхальх, Т. Основы доказательной медицины: учебное пособие для етуд. высш. мед. учебных заведений и сист. послевуз. проф. образования / Т. Гринхальх; пер. с англ. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2008. - 240 с.).

Достоверность отличия площади под ROC-кривой от площади, ограниченной диагональной линией у=х (AUC=0,5) оценивали по z-критерию и соответствующей ему доверительной вероятности р. Критическим принимали уровень р, равный 0,05. При р<0,05, отличие экспериментальной AUC от критической (AUC=0,5) считали статистически значимым, а следовательно, предиктор - прогностически ценным.

При определении риска прогрессирования меланомы кожи статистическая значимость (р<0,05) прогностической ценности была установлена для следующих предикторов: количественные показатели - содержание ИЛ-6 в ткани опухоли, ИЛ-1β и ИЛ-2 в ткани ИЗ, номинальные показатели - распространенность опухолевого процесса, наличие или отсутствие анеуплоидных клеток.

На следующем этапе для каждого количественного показателя модели была определена дифференциальная точка разделения, которая позволяла при сопоставлении с индивидуальным значением параметра у пациента сформировать вывод о риске прогрессирования меланомы кожи.

Определение дифференциальной точки содержания ИЛ-6 в ткани опухоли (выделено жирным шрифтом и обозначено *) и иллюстрация качества теста отражены в таблице 2 и на рис.1. При превышении содержания ИЛ-6 в ткани опухоли более 4,45 пг/мл/г с диагностической чувствительностью 90% и специфичностью 60,6% (табл. 2) увеличивается риск прогрессирования меланомы кожи (р=0,002).

На рис. 1 представлено соотношение ДЧ и ДС: ось у - ДЧ %, а ось х - 100% - ДС%. Диагностическая специфичность теста показывает долю (процент) лиц, не имеющих исследуемой патологии (состояния), у которых результаты теста оказались отрицательными. Площадь под ROC кривой составляла 0,74±0,08, что свидетельствовало о статистически значимом качестве теста.

Общие характеристики модели указаны в таблице 3, подтверждающей статистическую достоверность.

Этапы расчета дифференциальной точки ИЛ-1β в ткани ПЗ меланомы кожи представлены в таблице 4 (выделено жирным шрифтом и обозначено *) и на рис.2.

При превышении содержания ИЛ-1β в ткани ПЗ более 11,03 пг/мл/г белка с ДЧ 81% и ДС 60,6% (табл. 4) можно судить о риске прогрессировании меланомы кожи (р=0,005). Площадь под ROC кривой составляет 0,76±0,09 (рис. 2), что свидетельствует о статистически значимом качестве теста (р=0,005).

Общие характеристики модели указаны в таблице 5, подтверждающей статистическую достоверность.

Определение дифференциальной точки для ИЛ-2 в ткани ПЗ меланомы кожи представлены в таблице 6 (выделено жирным шрифтом и обозначено *) и на рис.3.

При превышении содержания ИЛ-2 в ткани ПЗ более 1,71 пг/мл/г белка с ДЧ 95% и ДС 95% (табл. 6) отмечен высокий риск прогрессирования меланомы кожи (р=0,005). Площадь под ROC кривой составляет 0,82±0,07 (рис. 3), что свидетельствует о статистически значимом качестве теста.

Все характеристики модели, подтверждающей ее статистическую достоверность, указаны в таблице 7.

Методом логистической регрессии на основании анализа определенных для пациентов данных получено уравнение расчета индивидуального риска прогрессирования меланомы кожи по прогностическому коэффициенту К.

Общий вид уравнения:

К - коэффициент прогноза;

z - коэффициент линейной регрессии, рассчитываемый по формуле:

z=(-4,1+0,065⋅X1+0,037⋅X2+1,06⋅X3+3,81⋅P-5,56⋅A),

где X1 - содержание ИЛ-6 в ткани опухоли (пг/мл/г);

Х2 - содержание ИЛ-1 βв ткани ПЗ (пг/мл/г);

Х3 - содержание ИЛ-2 в ткани ПЗ (пг/мл/г).

Номинальные показатели ранжированы следующим образом: распространенность опухолевого процесса (Р): 0 - местный, 1 - распространенный, 2 - генерализованный (Г), а также наличие анеуплоидного или диплоидного клона клеток (А): 1 - анеуплоидный клон, 0 - диплоидный клон.

Статистическая значимость разработанной модели определена при помощи критерия χ² Пирсона, позволяющего проверить степень согласия между предсказаниями модели и опытными данными (χ²=14,2 при р=0,014).

Критерий χ² Пирсона и его доверительная вероятность рассчитывается автоматически в модуле логистической регрессии программы Statistica 10.0. Методом ROC-анализа определено критическое значение К, при превышении которого с максимальной ДЧ и ДС делается заключение о высоком риске прогрессирования меланомы кожи.

Значение К более 0,64 соответствует высокому риску прогрессирования меланомы кожи у больного, при значении К менее 0,64 низкий риск развития раннего прогрессирования меланомы кожи.

Итак, на основании оценки локального уровня цитокинов в ткани меланомы кожи и ее микроокружении удалось выявить иммунологические факторы, которые с высокой прогностической значимостью наряду с общепринятыми клиническими (распространенность опухолевого процесса, толщина опухоли) и биологической характеристикой опухолевой ткани (анеуплоидный, диплоидный клон) определяют прогноз течения меланомы кожи.

Разработана математическая модель, позволяющая рассчитать риск развития прогрессирования меланомы кожи по статистически значимым критериям локального содержания ИЛ-6 в ткани опухоли, ИЛ-1β и ИЛ-2 в ткани ПЗ и использовать совокупность их значений для расчета коэффициента К, по уровню которого оценивается дальнейшее течение заболевания.

Клинические примеры

1. Пациент К., 1956 г.р., поступил 29.01.2016 года в отделение ОКМТМЖ №2 ФГБУ РНИОИ МЗ РФ с жалобами на наличие опухолевого пигментного образования кожи межлопаточной области.

Локально: на коже межлопаточной области имеется опухолевое новообразование 2,5×1,5 см, экзофитное, темного цвета. Регионарные л/узлы, доступные пальпации, не увеличены, подвижны, кожа над ними не изменена. Проведена дерматоскопия, выявлены признаки меланомы кожи: симптом «млечной вуали», неравномерное распределение пигмента.

Комплексное обследование признаков регионарного или отдаленного метастазирования не выявило. Учитывая данные обследования, установлен клинический диагноз: (С43.5) Меланома кожи межлопаточной области, кл.гр.2. 01.02.2016 года проведено хирургическое лечение в объеме - широкое иссечение опухоли кожи межлопаточной области с пластикой серповидным кожно-жировым лоскутом.

Послеоперационный период протекал гладко, без осложнений. На 6-е сутки после операции получен результат гистологического исследования - №6457-58/16 - узловая меланома, III степень по Кларку, 2,5 мм по Бреслоу, с подлежащей тканью.

После этого пациент консультирован у радиолога и химиотерапевта, адъювантная терапия не назначена. Установлен заключительный диагноз: (С43.5) Меланома кожи межлопаточной области, T3aN0M0, st. IIa, состояние после хирургического лечения, кл. гр. 3.

Пациенту рекомендовано динамическое наблюдение по схеме: УЗИ органов брюшной полости 1 раз в 3 месяца, СРКТ органов грудной клетки 1 раз в 6 месяцев, МРТ головного мозга 1 раз в 12 месяцев.

При исследовании тканевого цитокинового статуса и плоидности ДНК выявлено: удельное содержание ИЛ-6 в ткани опухоли - 49,62 пг/мл/г белка, ИЛ-1β в ткани ПЗ - 12,8 пг/мл/г белка, ИЛ-2 в ткани П3-1,95 пг/мл/г белка, среднее содержание диплоидных ДНК - 100%. При произведении расчета коэффициент К=0,85, что говорит о риске раннего прогрессирования.

При контрольном осмотре через 10 месяцев от момента операции выявлено появление подкожных метастазов в области мягких тканей шеи, надлопаточной области слева.

Пациенту назначена стандартная схема химиотерапии.

2. Пациентка Д., 1960 г.р., поступила в отделение ОКМТМЖ №2 ФГБУ РНИОИ МЗ РФ 07.06.2016 года с жалобами на наличие пигментного образования на коже правой лопаточной области.

Локально: на коже правой лопаточной области отмечается экзофитное пигментное новообразование, с изъязвлением, кровоточащее. Размеры опухоли до 3 см в диаметре. Регионарные лимфатические узлы не увеличены.

Проведена дерматоскопия, выявлены признаки меланомы кожи: симптом «млечной вуали», фестончатые края, глыбки хроматина. Комплексное обследование признаков регионарного или отдаленного метастазирования не выявило.

Учитывая данные обследования, установлен клинический диагноз: (С43.5) Меланома кожи правой лопаточной области, кл. гр. 2. 07.06.2016 года проведено хирургическое лечение в объеме - широкое иссечение опухоли кожи правой лопаточной области с пластикой встречными кожно-жировыми лоскутами.

Послеоперационный период протекал гладко, без осложнений. На 6-е сутки после операции получен результат гистологического исследования - №46498-500/16 - меланома, узловая форма, из невоидных клеток с небольшим содержанием меланина, с обширным изъязвлением эпидермиса. IV уровень инвазии по Кларку, толщина инвазии по Бреслоу 13 мм. Наличие в дерме эпидермальной кисты. Горизонтальные и вертикальный края резекции - отрицательные. Опухоль удалена в пределах здоровых тканей.

Заключительный диагноз: (С43.5) Меланома кожи правой лопаточной области pT4bNoMo, st. Пс, кл. гр. 2. В послеоперационном периоде поведена лучевая и иммунотерапия.

Пациентке рекомендовано динамическое наблюдение по схеме: УЗИ органов брюшной полости 1 раз в 3 месяца, СРКТ органов грудной клетки 1 раз в 6 месяцев, МРТ головного мозга 1 раз в 12 месяцев.

При исследовании тканевого цитокинового статуса и плоидности ДНК выявлено: удельное содержание ИЛ-6 в ткани опухоли - 6,68 пг/мл/г белка, ИЛ-1β в ткани ПЗ - 11,63 пг/мл/г белка, ИЛ-2 в ткани П3-0,88 пг/мл/г белка, среднее содержание диплоидных ДНК - 29,68%, анеуплоидных - 70,62%. Коэффициент К=0,094.

В настоящее время прогрессирования заболевания у пациентки не выявлено. Пациентка находится под динамическим контролем.

Данным способ был рассчитан прогноз 20 больным.