Результат интеллектуальной деятельности: Способ прогноза развития патогенетического процесса по некультивируемому или культивируемому типу в эксперименте

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к патофизиологии, и может быть использовано для прогноза динамики развития патогенетического процесса по культивируемому или некультивируемому типу при инфекционном процессе на основании биохимических тестов.

Одной из наиболее сложных проблем здравоохранения, имеющих медицинскую и социально-экономическую значимость, является развитие инфекционного процесса по культивируемому и некультивируемому типу.

В настоящее время известно более 70 видов микроорганизмов, относящихся к 40 родам, которые способны переходить в некультивируемые состояние. Выделено более 60% видов грамотрицательных некультивируемых форм бактерий (НФБ) и около 40% грамположительных [Соколенко А.В., Шаманская Е.П. Некультивируемые формы патогенных бактерий и здоровье человека // Валеология. - 2008. - №2. - С. 10-20; Козлов Л.Б., Диц Е.В. Роль микробных ассоциаций в инфекционной патологии человека // Фундаментальные исследования, 2013. - №9. - С. 366-370; Соколенко А.В. Некультивируемые формы бактерий: распространение в природе, индукторы некультивируемого состояния и реверсии // Современные наукоемкие технологии. - 2006. - №2 - С. 11-15; Heim S. Et al. The viable but nonculturable state and starvation are different stress responses of Enterococcus faecalis, as determined by proteome analysis // J. Bacteriol - 2002. - Vol. 184. - №23. - P. 6739-6745].

В опытах на животных установлены различия в динамике развития патологических процессов, возникающих при инфекционных заболеваниях, вызванных культивируемыми и некультивируемыми бактериями. Инфекционный процесс, вызванный ассоциацией культивируемых бактерий P. aeruginosa и S. Aureus, обуславливал развитие патологического процесса в организме кроликов, несовместимых с жизнью, на 8-9 день болезни (погибло 69,3% кроликов взятых в опыт), а некультивируемые бактерии этих же видов уже на вторые сутки вызывали гибель кроликов (через 54 часа болезни кроликов погибло 30,8% животных), то есть выявлены различия в динамике развития инфекционного процесса по культивируемому и некультивируемому типу. Динамика развития инфекционного процесса при культивируемом и некультивируемом типе была обусловлена различиями патологических изменений в организме животных. При культивируемом типе инфекционного процесса патогенез заболевания характеризовался преимущественным поражением желудочно-кишечного тракта с летальным исходом на 8 день болезни, а при некультивируемом типе инфекционного процесса патогенез заболевания характеризовался преимущественным поражением тканей головного мозга с летальным исходом на второй день болезни животных [Сахаров С.П., Козлов Л.Б. Система диагностики инфекционных осложнений и прогнозирование исходов ожоговой болезни у детей (клинико-экспериментальные исследования): монография // Екатеринбург: Изд-во Урал. ун-та, 2014. 252 с.].

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о различиях в клинике и патогенезе инфекционного процесса, вызванного культивируемыми и некультивируемыми бактериями, но не представлено данных, позволяющих прогнозировать развитие патогенетического процесса по культивируемому или по некультивируемому типу.

В патентной литературе описано выделение некультивируемых бактерий [патент RU №2470074 от 20.12.2012 г. Бюл. №35], прогнозирование течения клещевых инфекций, внебольничных пневмоний, воспалительных заболеваний органов мочевой системы, используя клинические и иммунологические данные [патент RU №2376938 от 27.12.2009 г. Бюл. №36; патент RU №2472155 от 10.01.2013 г. Бюл. №1; патент RU №2517110 от 27.05.2014 г. Бюл. №15], прогнозирование течения экземы по определению кортизола, гастрина, аполипопротеина А1 и IL-6 [патент RU №2461836 от 20.09.2012 г. Бюл. №26].

В перечисленных патентах прогнозирование инфекционного процесса бактериальной природы проводят преимущественно в случае развития инфекционного процесса по культивируемому типу. Данных об особенностях развития патогенетического процесса по некультивируемому типу в описанной литературе не представлено.

Известен способ прогнозирования исхода заболевания больных распространенным гнойным перитонитом [патент RU №2292048 С2 от 20.01.2007 г. Бюл. №2]. В данном изобретении не учитывается влияние некультивируемых бактерий на инфекционный процесс, а прогноз клинического течения заболевания основан на основании изменения сложных показателей липидного обмена в сыворотках крови больных.

Следовательно, нам не удалось выявить способа-аналога с аналогичным назначением, представленным в материалах настоящей заявки. Выявлены аналоги с другим назначением.

Задачей настоящего изобретения является выявить достоверные критерии, позволяющие прогнозировать развитие патогенетического процесса по культивируемому или по некультивируемому типу на основании биохимических тестов, определяемых при исследовании сывороток крови.

Технический результат - простой, не требующий больших материальных затрат, и основан на исследовании сывороток крови в конце инкубационного периода или в продромальном периоде для прогноза патогенетического процесса по некультивируемому или по культивируемому типу на основании динамики изменения концентрации щелочной фосфатазы и аланинаминотрансферазы (АЛТ) в сыворотках крови.

Теоретическое обоснование возможности использования предложенных биохимических тестов нашло отражение в периодической литературе.

Щелочная фосфатаза участвует в транспорте фосфора в организме. При патологическом процессе происходит повышение ее количества в сыворотке крови в основном за счет разрушения клеток, богатых фосфором, в частности при заболеваниях печени.

АЛТ - эндогенный внутриклеточный фермент, который выделяется в кровь при разрушении клеток, а также при некрозе клеток. Для этого фермента не характерна органная специфичность.

Технический результат предложенного способа достигается тем, что способ прогноза развития патогенетического процесса по некультивируемому или культивируемому типу в эксперименте, заключающийся в том, что от больных с гнойно-воспалительными процессами выделяют культуры P. aeruginosa и S. aureus, получают из них фракции культивируемых и некультивируемых бактерий, и вводят ассоциацию таких бактерий кроликам подкожно в количестве 10⁴-10⁵ микробных клеток в 1 мл, затем на 1-2 и 4-5 сутки после этого определяют щелочную фосфатазу и АЛТ в сыворотке крови животных, и при показателе щелочной фосфатазы на 1-2 сутки 205,0-391,0 u/L, а на 4-5 сутки - 308,0-483,0 u/L и показателе АЛТ на 1-2 сутки 53,0-63,0 u/L, а на 4-5 сутки - 57,0-69,0 u/L прогнозируют развитие инфекционного процесса по некультивируемому типу, а при показателе щелочной фосфатазы на 4-5 сутки 485,0-652,0 u/L и АЛТ 36,5-38,0 u/L прогнозируют развитие инфекционного процесса по культивируемому типу.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образам: от больных с гнойно-воспалительными процессами выделяют культуры P. aeruginosa и S. aureus. Популяции выделенных бактерий содержат культивируемые и некультивируемые бактерии соответствующих видов. Смесь бактерий вводят кроликам породы «шиншилла» мужского пола массой 2230-2295 г подкожно в левое бедро в концентрации 10⁴-10⁵ микробных клеток в 1 мл. На 1-2 сутки, а затем на 4-5 сутки у кроликов берут кровь и определяют наличие в сыворотках крови количество щелочной фосфатазы и АЛТ. При показателе щелочной фосфатазы на 1-2 сутки болезни кроликов 205,0-391,0 u/L, а на 4-5 сутки - 308,0-483,0 u/L и показателе АЛТ на 1-2 сутки 53,0-63,0 u/L, а на 4-5 сутки - 57,0-69,0 u/L прогнозируют развитие патогенетического процесса по некультивируемому типу, а при показателе щелочной фосфатазы на 4-5 сутки 485,0-652,0 u/L и показателе АЛТ 36,5-38,0 u/L прогнозируют развитие патогенетического процесса по культивируемому типу.

Примеры практического использования предлагаемого способа

Пример 1. От больного с гнойно-воспалительным процессом выделены культуры P. aeruginosa и S. aureus. Популяции выделенных бактерий содержали культивируемые и некультивируемые формы бактерий соответствующих видов. В качестве экспериментальной модели взят кролик породы «шиншилла» мужского пола массой 2260 г. Смесь бактерий P. aeruginosa и S. aureus ввели кролику подкожно в левое бедро в концентрации 10⁴-10⁵ микробных клеток в 1 мл.

На 2 сутки у кролика взяли кровь из вены для определения в сыворотке крови количества щелочной фосфатазы и АЛТ. Показатель щелочной фосфатазы составил 362,0 u/L, а показатель АЛТ - 59,3 u/L. На основании проведенных биохимических исследований прогнозировано развитие инфекционного процесса по некультивируемому типу. Животное погибло на 6 сутки после заражения. Гистологические исследования показали, что патологический процесс развивался по некультивируемому типу, с преимущественным поражением тканей головного мозга.

Пример 2. От больного с гнойно-воспалительным процессом выделили культуры P. aeruginosa и S. Aureus, содержащие культивируемые и некультивируемые формы бактерий. В качестве экспериментальной модели взят кролик породы «шиншилла» мужского пола массой 2280 г. Бактерии P. aeruginosa и S. aureus ввели кролику подкожно в левое бедро в концентрации 10⁴-10⁵ микробных клеток в 1 мл. На 4 сутки болезни кролика у животного взяли кровь и определили наличие в сыворотке крови количество щелочной фосфатазы и АЛТ. Показатель щелочной фосфатазы составил 623,0 u/L, а АЛТ 37,1-u/L. На основании проведенных биохимических исследований прогнозировано развитие инфекционного процесса по культивируемому типу. Животное погибло на 11 день болезни. Результаты гистологических исследований показали, что патогенетический процесс развивался по культивируемому типу, с признаками преимущественного поражения желудочно-кишечного тракта.

Пример 3. От больного с гнойно-воспалительным процессом выделены культуры P. aeruginosa и S. Aureus, содержащие культивируемые и некультивируемые формы бактерий. В качестве экспериментальной модели взят кролик породы «шиншилла» мужского пола массой 2260 г. Бактерий P. aeruginosa и S. aureus ввели кролику подкожно в левое бедро в концентрации 10⁴-10⁵ микробных клеток в 1 мл.

На 4 сутки у кролика взяли кровь из вены и определили наличие в сыворотках крови количество щелочной фосфатазы и АЛТ. Показатель щелочной фосфатазы составил 410,0 u/L, а показатель АЛТ - 68,3 u/L. На основании проведенных биохимических исследований прогнозировано развитие инфекционного процесса по некультивируемому типу. Животное погибло на 4 сутки после заражения. Гистологические исследования показали, что патогенетический процесс развивался по некультивируемому типу, с преимущественным поражением тканей головного мозга.

Приведенные примеры свидетельствуют о возможности применения данного способа для выявления развития инфекционного процесса по культивируемому или по некультивируемому типу.

Результаты биохимических исследований сывороток крови кроликов инфицированных культивируемыми и некультивируемыми бактериями представлены в таблицах 1 и 2.

Экспериментальные исследования на кроликах проведены в виварии ФГБОУ ВПО Государственного аграрного университета Северного Зауралья, микробиологические исследования проведены на базе микробиологической лаборатории Тюменского филиала ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии по железнодорожному транспорту», а биохимические исследования проведены на автоматическом биохимическом анализаторе BS 200 (Mindray) на базе ФБУН ТНИИКИП Роспотребнадзора. Всего в эксперименте находилось 72 кролика породы «шиншилла».

Предложенный способ легко воспроизводим, не требует больших материальных затрат и в продромальном периоде заболевания позволяет прогнозировать развитие инфекционного процесса по некультивируемому или культивируемому типу. Выявленная динамика биохимических показателей в организме кроликов может быть использована для экстраполяции полученных данных в процессе анализа патогенеза инфекционных заболеваний у людей, что является необходимым для совершенствования диагностики и лечения инфекционных больных.