Результат интеллектуальной деятельности: Способ получения 5-гидроксиметилфурфурола и этанола из целлюлозы

Изобретение относится к области биотехнологии, гидролизной и микробиологической промышленности. Предложен способ получения этанола путем ферментации смесей, получаемых после выделения 5-гидроксиметилфурфурола (5-ГМФ) из каталитических гидролизатов активированной микрокристаллической целлюлозы, штаммом термотолератныных дрожжей Kluyveromyces marxianus ВКПМ Y-4290.

Возобновляемая биомасса является перспективным источником сырья для производства моторных топлив и ценных химических веществ. Наибольший интерес для промышленности представляет переработка продуктов делигнифицированной биомассы, а именно холоцеллюлозы и целлюлозы, в моносахариды. С этой целью широко применяются гидролиз полисахаридов гомогенными катализаторами - минеральными кислотами, щелочами ферментами [1], в ряде случаев эти методы позволяют достигать степени превращения целлюлозы путем гидролиза целлюлозы выше 90%. Кроме того, широкое применение нашел метод парового взрыва лигноцеллюлозы, который в сочетании с ферментативным гидролизом позволяет осуществлять ее эффективный гидролиз до моносахаридов. Несмотря на это, применение всех вышеописанных методов сопряжено с рядом недостатков. Например, существенным недостатком методов гидролиза с использованием неорганических кислот (или оснований) является образование большого количества отходов производства, в том числе сточных вод, шламов и др., а также необходимость использования оборудования, устойчивого к коррозии. Используемые в промышленности схемы получения гексоз и пентоз из биомассы для последующей ферментации в этанол с использованием дрожжей Saccharomyces cerevisiae, позволяют на стадии гидролиза получить моносахариды с выходом 2,8-3,3 вес.%, которые содержат побочные продукты гидролиза, оказывающие ингибирующее влияние на микроорганизмы в процессе ферментации, в том числе 5-ГМФ (0.03-0.18 вес.%) и фурфурол (0.02-0.12 вес.%) [2]. Снижение концентрации данных веществ в основном достигается путем очистки смесей (например, с использованием гипсового молока или методом ионообменной хроматографии), что приводит к образованию дополнительных отходов. Применение ферментативного гидролиза целлюлозы с использованием целлюлозолитических ферментов, хотя, несомненно, и обладает экологической чистотой, но пока остается достаточно дорогостоящим.

Решением ряда перечисленных проблем гидролиза целлюлозы является применение твердых кислотных катализаторов основе углерода, которые позволяют в результате одностадийного процесса, совмещающего кислотный гидролиз целлюлозы до глюкозы и дегидратацию последней, получать не только глюкозу, но и 5-гидроксиметилфурфурол (5-ГМФ), являющийся одним из ключевых соединений для производства широкого спектра продуктов (дизельных и авиационных топлив, пластмасс и др.). Полученный подобным образом 5-ГМФ может быть легко выделен от раствора Сахаров при помощи экстракции органическими растворителями, что позволяет получить его в чистом виде для переработки в ценные продукты. Остающийся водный раствор является ценным сырьем с высоким содержанием глюкозы и пониженным содержанием фурановых производных, который можно использовать для ферментации микроорганизмами.

Наиболее распространенным продуктом ферментации глюкозы является этанол, занимающий свыше 90% мирового рынка биотоплива. Традиционно использующиеся для ферментации дрожжи S. cerevisiae обладают способностью к продукции этанола при температурах 25-37°С. Необходимость поддержания температуры в указанном интервале повышает стоимость производства этанола. Снижение стоимости процесса возможно путем применения термотолерантных дрожжей (напр., Kluyveromyces marxianus и Ogataea polymorpha), продуцирующих этанол при температуре 45°С. Кроме того, термотолерантные дрожжи обладают способностью кометаболизировать глюкозу и ксилозу, что делает их перспективными для ферментации гидролизных смесей делигнифицированной биомассы (холоцеллюлозы). Ферментация при высоких температурах позволяет значительно сократить затраты на охлаждение ферментационной жидкости и тем самым улучшить экономические показатели процесса. Кроме того, высокая температура процесса позволяет снизить рост побочной микрофлоры. Термотолерантные дрожжи способны расти на средах, содержащих глюкозу, ксилозу, целлобиозу и другие сахара, входящие в состав гидролизатов биомассы, что дает возможность проводить ее более полную переработку.

В Пат. ЕР 1130085 А1 [3] описан способ получения этанола путем ферментации гидролизата лигноцеллюлозной биомассы. Предварительно измельченная до размера 15-30 мм биомасса, подвергается паровому взрыву при температуре 190-230°С в течение 1-10 мин в реакторе с последующим отделением обработанной биомассы в циклоне и фильтрацией в фильтр-прессе. Осадок гидролизуется ферментами, затем проводится ферментацию с использованием штамма термотолерантных дрожжей Kluyveromyces marxianus СЕСТ 10875, в течение 72 ч при 42°С.

Недостатком данного изобретения является необходимость использования специального оборудования, а также высоких температур и давления для процедуры парового взрыва, а также ферментных препаратов в процессе осахаривания субстрата, которые, в свою очередь, ингибируются продуктами гидролиза и не могут быть использованы повторно.

В Пат. US 8268600 В2 [4] описан способ получения этанола путем ферментации гидролизата, полученного в результате обработки лигноцеллюлозы (багассы) разбавленной серной кислотой, с использованием штамма термотолерантных дрожжей Kluyveromyces sp. IIPE453 МТСС 5314 при 40-55°С. Выход этанола составляет 10-58.75%. Перед ферментацией производится очистка сахаров гидролизата методом ионообменной хроматографии на смоле IRA 904 или боксите.

Недостатками этого способа получения этанола из лигноцеллюлозы являются использование кислотного гидролиза, приводящего к образованию отходов, а также необходимость дополнительной очистки сахаров с использованием ионообменной хроматографии и низкий выход этанола.

Наиболее близкий аналог изобретения описан в работе [5]. Было проведено получение этанола путем каталитического гидролиза обработанной щелочами шелухи риса с использованием кислотного углеродного катализатора с последующей очисткой гидролизата от ингибиторов ферментации с использованием ионообменных смол и сбраживанием полученных Сахаров дрожжами S.cerevisiae. Катализатор содержит большое количество сульфо-групп, т.к. получен из глицерина путем карбонизации в присутствии четырехкратного избытка серной кислоты [6]. Показано, что на оптимизированном катализаторе выходы сахаров из обработанной щелочью биомассы рисовой шелухи составили до 31%, из сырой биомассы, а продукция этанола на гидролизатах достигала 52.29% от теоретически возможного [5]. Недостатками этого способами получения этанола, помимо его низкого выхода, являются необходимость использования дополнительной процедуры очистки, усложняющей и увеличивающей стоимость процесса получения сахаров при гидролизе. Кроме того, для ферментации сахаров в этанол используются мезофильные дрожжи S.cerevisiae, требующие при культивировании значительных затрат на охлаждение ферментационной жидкости.

Изобретение решает задачу разработки способа комплексной переработки целлюлозы путем ее одностадийного каталитического гидролиза-дегидратации с образованием 5-ГМФ и сахаров, с последующей ферментацией последних в этанол. Предлагаемый способ по сравнению с другими позволяет получать из гидролизатов целлюлозы более высокие выходы этанола и, одновременно, 5-ГМФ, а также характеризуется меньшим количеством отходов и сниженными затратами на процесс ферментации за счет использования более высоких температур (≥40°С) для культивирования.

Задача решается путем использования одностадийного каталитического процесса для гидролиза-дегидратации механически активированной микрокристаллической целлюлозы, последующей экстракции 5-ГМФ (как самостоятельного ценного продукта) и ферментации остаточных Сахаров в этанол с использованием штамма термотолерантных дрожжей, преимущественно Kluyveromyces marxianus ВКПМ Y-4290.

Предложен способ получения этанола и 5-гидроксиметилфурфурола из целлюлозы путем ее одностадийного каталитического гидролиза-дегидратации механически активированной микрокристаллической целлюлозы с последующей экстракцией полученного 5-гидроксиметилфурфурола - 5-ГМФ растворителями и ферментацией оставшихся сахаров в этанол с использованием термотолерантных дрожжей. В качестве сырья используют целлюлозу, преимущественно микрокристаллическую целлюлозу, с размером фракции 79-149 мкм, преимущественно 114±35 мкм, индексом кристалличности 80-92%. Перед каталитическим гидролизом-дегидратацией микрокристаллической целлюлозы проводят ее активацию, преимущественно механическую, где используют планетарную мельницу дискретного действия, размер получаемых частиц составляет 1-140 мкм, преимущественно 22,3±8 мкм, а кристалличность образца находится в диапазоне 30-50%. Для каталитического гидролиза-дегидратации микрокристаллической целлюлозы применяют гетерогенные катализаторы, такие как: цеолиты, ионообменные смолы, соли гетерополикислот, оксиды переходных металлов, углеродные материалы, такие как: активированный уголь, пиролитический углерод, углеродные нанотрубки, преимущественно углеродный материал «Сибунит-4». Углеродный материал «Сибунит-4» модифицируют путем окисления влажной воздушной смесью при температуре 400-500°С, преимущественно при 450°С, размер частиц катализатора составляет 0,05-10 мм, преимущественно 56-94 мкм, площадь удельной поверхности (Sbet), определяемая методом низкотемпературной адсорбции азота, находится в диапазоне 300-500 м²/г, объем мезопор в диапазоне - 0,3-0,5 см³/г, концентрация кислотных групп составляет 0,1-0,5 ммоль г^-1. Реакцию гидролиза-дегидратации активированной микрокристаллической целлюлозы проводят при температуре 150-250°С, преимущественно при 180°С и давлении аргона 1 МПа. Экстракцию 5-гидроксиметилфурфурола 5-ГМФ проводят растворителями, такими как: изобутанол, 1-бутанол, диэтиловый эфир, метилизобутилкетон, этилацетат, тетрагидрофуран, 2-бутанол, преимущественно изобутанол. Для получения ферментационной среды в экстрагированный гидролизат целлюлозы добавляют минеральные соли (г/л), в том числе (но не ограничиваясь): KH₂PO₄ 1.0, MgSO₄ 0.5, NaCl 0.1, CaCl₂ 0.1, (NH₄)₂SO₄ 5.0) с 5.0 г/л и дрожжевой экстракт в концентрации 1.0 г/л и титруют до необходимого рН с использованием основания, в том числе, но не ограничиваясь: NaOH, Са(ОН)₂ или аммиак, предпочтительно, аммиак, для ферментации используют рН среды 3.0-7.0, преимущественно рН 4.5-5.5. Для ферментации экстрагированного гидролизата целлюлоз используют термотолерантные дрожжи, включающие, но не ограниченные видами: Debaryomyces hansenii, Kluyveromyces bulgaricus, Kluyveromyces marxianus, Ogataea polymorpha, Ogataea parapolymorpha, Cryptococcus tepidarius, Pichia thermomethanolica, Candida krabiensis, Candida sithepensis, преимущественно, термотолерантные дрожжи Kluyveromyces marxianus, преимущественно, штамм Kluyveromyces marxianus ВКПМ Y-4290. Ферментацию смеси проводят дрожжами Kluyveromyces marxianus ВКПМ Y-4290 в среде, содержащей каталитический гидролизат микрокристаллической целлюлозы, упаренный и нейтрализованный аммиаком до рН 4.0-6.5, где концентрация сахаров составляет 10-100 г/л в анаэробных условиях, ферментацию проводят при температуре 30-50°С, преимущественно 37-50°С, Для ферментации используют смесь, содержащую сахара, получаемые при гидролизе целлюлозы, преимущественно, но, не ограничиваясь, глюкозу, маннозу, сахарозу и целлобиозу или их комбинации.

Изобретение решает следующие задачи: (1) снижение количества образующихся отходов производства гидролизного этанола за счет использования более экологичного метода каталитического гидролиза-дегидратации целлюлозы с применением твердых углеродных катализаторов, подлежащих многократному использованию, а также отсутствием большого количества отходов (например, сточных вод); (2) снижение затрат на производство за счет отсутствия необходимости использования коррозионно-стойкого оборудования и ферментов; (3) использование Сахаров в качестве сырья для ферментации, являющихся побочным продуктом получения ценного вещества 5-ГМФ; (4) использования для ферментации термотолерантных дрожжей Kluyveromyces marxianus.

В отличие от наиболее близкого аналога в настоящем изобретении для увеличения степени гидролиза целлюлозы использованы следующие новые подходы (или решения): 1) применен метод ее механической активации, позволяющий снизить степень кристалличности целлюлозы на поверхности и увеличить доступность ее фибирилл для гидролиза [6, 7]; использован кислотный углеродный катализатор позволяющий получать выходы глюкозы из механически активированной целлюлозы до 45% от теоретического [6] и приготовленный окислением промышленного углеродного катализатора Сибунит-4 влажным воздухом [8], что позволяет избежать использования серной кислоты при производстве катализатора, а, следовательно, образования опасных отходов. В изобретении применен одностадийный процесс, основанный на получении 5-ГМФ и сахаров путем гидролиза-дегидратации целлюлозы. Кроме того, в данном изобретении для ферментации используются отходы процесса получения 5-ГМФ, который извлекается из смеси путем экстракции органическим растворителем. Это позволяет исключить применение дорогостоящей дополнительной стадии очистки смеси с использованием ионообменной хроматографии. Другой отличительной особенностью данного изобретения от ближайшего аналога является использование для ферментации термотолерантных, а не мезофильных дрожжей, что позволяет снизить затраты на охлаждение ферментационной жидкости в процессе получения этанола.

В качестве сырья для получения этанола предлагаемым способом используют микрокристаллическую целлюлозу, измельченную до фракции 14-30 мкм с индексом кристалличности 30-50%. Мехактивацию кристаллической целлюлозы проводят с использованием планетарной мельницы дискретного действия.

Полученную мехактивированную целлюлозу подвергают каталитическому гидролизу-дегидратации. Для такого гидролиза могут использоваться гетерогенные катализаторы, такие как цеолиты, ионообменные смолы, соли гетерополикислот, оксиды переходных металлов, но наиболее перспективными катализаторами представляется углеродные материалы (активированный уголь, пиролитический углерод, углеродные нанотрубки). Мезопористый углеродный материал «Сибунит-4» обладает достаточно развитой поверхностью, термической стабильностью и высокой механической прочностью. Поверхность «Сибунит-4» модифицируют путем окисления влажной воздушной смесью при температуре 450°С с целью повышения кислотности углеродного материала [8]. Такой способ окисления обладает преимуществами, такими как упрощение метода и процедуры обработки мезопористого углеродного материала «Сибунит-4», использование нетоксического окислителя, отсутствие стадии отмывки углеродного материала от окислителя. Размер частиц катализатора составляет 56-94 мкм. Площадь удельной поверхности (S_BET), определяемая методом низкотемпературной адсорбции азота, находится в диапазоне 300-500 м²/г, объем мезопор в диапазоне - 0,3-0,5 см³/г. Концентрация кислотных групп, которую определяли кислотно-основным титрованием гидроксида натрия, находится в диапазоне 0,1-0,4 ммол. г^-1.

Реакцию гидролиза активированной целлюлозы проводят при температуре 180°С и давлении аргона 1 МПа, в автоклаве при перемешивании 1500 об/мин в течение 5 ч. Содержание мехактивированной целлюлозы и катализатора составляет 10 г/л. Продукты реакции анализируют методом ВЭЖХ. В результате реакции целевыми продуктами являются 5-ГМФ (до 23 мол.%), преимущественно в диапазоне 6.94-10.91 мол.% и глюкоза (до 45 мол.%) [8], преимущественно 20.10-25.92 мол.%, также в небольших количествах образуются манноза, фруктоза, целлобиоза, фурфурол, муравьиная, молочная, гликолевая, винная кислоты в концентрациях в диапазоне 1,23-1,54, 0,89-1,18, 0,5-0,55, 0,64-0,97, 0,45-0,7, 0,99-1,34, 0,65-1,03, 0,56-0,85 мол.%, соответственно.

5-ГМФ, образовавшийся в процессе каталитического гидролиза-дегидратации целлюлозы, извлекают из смеси методом экстракции органическими растворителями. В качестве экстрагентов используют следующие растворители: изобутанол, бутанол-1, бутанол-2, диэтиловый эфир, метилизобутилкетон, этилацетат, тетрагидрофуран, но преимущественно изобутанол. После трехкратной экстракции и упаривания при температуре (60-100°С) концентрация глюкозы в растворе составляет (10-100 г/л), а 5-ГМФ (0.5-10 г/л). Низкая концентрация 5-ГМФ и фурфурола позволяет проводить ферментацию с использованием микроорганизмов.

Для получения ферментационной среды в среду добавляют минеральные соли и дрожжевой экстракт в концентрации 1.0 г/л и титруют до необходимого рН с использованием NaOH, Са(ОН)₂ или аммиака, предпочтительно используют аммиак. Для ферментации используют рН среды 3.0-7.0, преимущественно рН 4.5-5.5.

Для ферментации сахаров используют термотолерантные дрожжи, включающие, но не ограниченные видами Debaryomyces hansenii, Kluyveromyces bulgaricus, Kluyveromyces marxianus, Ogataea polymorpha, Ogataea parapolymorpha, Cryptococcus tepidarius, Pichia thermomethanolica, Candida krabiensis, Candida sithepensis. Преимущественно используют штамм термотолерантных дрожжей Kluyveromyces marxianus ВКПМ Y-4290. Данные дрожжи растут при температурах 30-50°С как аэробно, так и анаэробно. Для ферментации используют смесь, содержащую сахара, получаемые при каталитическом гидролизе-дегидратиции целлюлозы, преимущественно (но не ограничиваясь) глюкозу, маннозу, сахарозу и целлобиозу или их комбинации. Ферментацию дрожжей Kluyveromyces marxianus ВКПМ Y-4290 проводят в среде, содержащей упаренный и нейтрализованный аммиаком до рН 4.0-6.5 гидролизат со смесью сахаров в количестве 10-100 г/л в анаэробных условиях при температурах 37-50°С. Специфическая скорость роста составляет 0.06±0.0 ч^-1. Выход этанола от теоретического составляет 50-72%.

Преимуществами предлагаемого способа получения этанола из целлюлозы являются:

1. Предлагаемый способ позволяет сократить количество образующихся отходов (в том числе, сточных вод) по сравнению с химическим гидролизом и не использовать специальное оборудование (как для кислотного гидролиза целлюлозы).

2. Для ферментации в этанол используется смесь сахаров, являющиеся побочным продуктом получения 5-ГМФ.

3. Для ферментации используются непатогенные термотолерантные дрожжи Kluyveromyces marxianus ВКПМ Y-4290, что позволяет снизить затраты на охлаждение ферментационной жидкости и снизить рост побочной микрофлоры при ферментации.

4. В процессе ферментации достигается высокий выход этанола от теоретического значения (до 72%).

Изобретение далее иллюстрируются следующим примером, который не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1. Каталитический гидролиз-дегидратация целлюлозы

Механическую активацию кристаллической целлюлозы (фракция <0.1 мм, ЗАО Вектон, Санкт-Петербург) проводят в планетарной мельнице дискретного действия при 22 g и массе загружаемой целлюлозы 15 г. Размер получаемых частиц по данным световой микроскопии составляет 22,3±8 мкм. Степень кристалличности частиц целлюлозы измеренная по методу [9] с использованием рентгенофазового анализа с излучением CuK_α (λ=1.5418 ) при сканировании по точкам с интервалом 0.05° в диапазоне 20 от 10 до 40°, составляет 36%.

Для проведения реакции каталитического гидролиза механически активированную целлюлозу и углеродный катализатор Сибунит-4, окисленный влажной воздушной смесью (Сибунит-4-ox) при 450°С [8], в концентрации 10 г/л помещают в реактор-автоклав, оснащенный мешалкой с магнитным приводом, системой нагрева и поддержания температуры (время достижения температуры составляет примерно 30 мин), выдерживают при интенсивном перемешивании (1500 об/мин) в течение 5 ч. Пробы центрифугируют при 14500 об/мин в течение 5 мин для отделения катализатора и непрореагировавшей целлюлозы от продуктов реакции, а затем фильтруют через фильтр из ацетат-целлюлозы с диаметром пор 0,2 мкм. Затем проводят анализ смеси с использованием хроматографа Shimadzu LC-20AD XR LC на колонке Rezex ROA-Organic Acid Н+300×7.8 мм (Phenomenex). В качестве мобильной фазы используют 0.00125 Н серную кислоту в воде. Скорость потока подвижной фазы составляет 0.6 мл мин^-1, время анализа - 1 ч 40 мин, температура колонки - 40°С. Состав продуктов реакции приведен в таблице 1.

Далее осуществляют экстракцию 5-ГМФ и подготовку каталитического гидролизата целлюлозы к ферментации

Полученный раствор предварительно фильтруют, затем упаривают на ротационном испарителе при температуре 70°С, после чего добавляют один объем растворителя, тщательно перемешивают и отбирают водную часть. Экстракцию повторяют три раза. Смесь анализируют методом ВЭЖХ, результаты экстракции различными растворителями приведены в таблице 2.

В дальнейшем для экстракции 5-ГМФ используют изобутанол, обладающий высокой эффективностью экстракции этого вещества. Органические фракции, полученные после экстракции изобутанолом, соединяют и полученный раствор перегоняют под вакуумом (2 мм рт.ст.). Водный раствор повторно упаривают, добавляют соли: KH₂PO₄ 1.0 г/л, MgSO₄ 0.5 г/л, NaCl 0.1 г/л, CaCl₂ 0.1 г/л, (NH₄)₂SO₄ 5.0 г/л и дрожжевой экстракт 1.0 г/л. Затем проводят нейтрализацию раствора соответствующим раствором аммиака до значения рН 4.75 и анализируют состав смеси методом ВЭЖХ, результаты приведены в таблице 3. После перегонки под вакуумом получают 1.2 г 5-ГМФ с выходом 7.2 мас.%.

Затем осуществляют ферментацию сахаров, полученных путем каталитического гидролиза-дегидратации целлюлозы, в этанол.

Смесь, полученную после экстракции изобутанолом, упаривания и нейтрализации, используют для ферментации в этанол штаммом дрожжей К. marxianus ВКПМ Y-4290.

Штамм дрожжей К. marxianus ВКПМ Y-4290 культивируют на агаризованной среде YPD при температуре 42°С в течение 3 сут. Среду с минеральными солями, содержащую дополнительно 5.0 г/л пептона, 3.0 г/л дрожжевого экстракта и смесь Сахаров в концентрациях, соответствующих концентрации Сахаров в нейтрализованном и экстрагированном гидролизате титруют аммиаком до рН 4.75. Для проведения ферментации колонию дрожжей вносят в 10 мл этой среды, культивирование проводят аэробно при 42°С на скорости 250 об/мин до оптической плотности, равной 1.0 при 565 нм. Затем клетки отделяют центрифугированием при 500×g 10 мин, и вносят их в количестве 1.0 г/л в 10 мл гидролизата, полученного выше. Культивирование проводят в герметичных колбах объемом 25 мл, анаэробно при перемешивании 100 об/мин при 42°С. В течение эксперимента оценивают сухую биомассу клеток путем измерения оптической плотности клеточной суспензии при 595 нм и конвертации полученных значений в количество г/л сухой биомассы, согласно калибровочной кривой. Также анализируют состав культуральной жидкости методом ВЭЖХ (Фиг.).

В процессе ферментации экстрагированных катлитических гидролизатов целлюлозы штаммом дрожжей Kluyveromyces marxianus ВКПМ Y-4290 наблюдается продукция этанола при потреблении преимущественно трех сахаров - глюкозы, маннозы и фруктозы. Штамм Kluyveromyces marxianus ВКПМ Y-4290 также обладает способностью ассимилировать все три сахара в течение всей ферментации, выход биомассы по ферментируемым сахарам 0.11±0.01 г/г, выход этанола по ферментируемым сахарам - 0.34±0.02 г/г, специфическая скорость роста 0.06±0.01 ч^-1. Выход этанола в процентах от теоретического (максимальный теоретический выход этанола был принят как 0.521 г/г ферментируемых сахаров, в т.ч. глюкозы, маннозы и фруктозы) составляет 72.0±5.7%.

ЛИТЕРАТУРА

1. Н.В. Громов, О.П. Таран, К.Н. Сорокина, Т.И. Мищенко, Шивакумар Утанди, В.Н. Пармон. Новые методы одностадийной переработки полисахаридных компонентов лигноцеллюлозной биомассы (целлюлозы и гемицеллюлоз) в ценные продукты часть 1. Методы активации биомассы. // Катализ в промышленности. 2016. №1. С. 74-83.

2. Технология гидролизных производств Автор: Холькин Ю.И. Издательство: М.: Лесная промышленность Год издания: 1989. Страницы: 496.

3. Патент ЕР 1130085 A1. C12N 1/16, C12N 1/22, C12N 9/42, С12Р 7/10, Procedure for the production of ethanol from lignocellulosic biomass using a new heat-tolerant yeast. 05.09.2001.

4. Патент US 8268600 B2. C12P 7/10, C12P 7/06. Strain and a novel process for ethanol production from lignocellulosic biomass at high temperature. 18.09.2012.

5. M. Goswami, S. Meena, S. Navatha, K.N. Prasanna Rani, A. Pandey, R.K. Sukumaran, R.B. Prasad, B.L. Prabhavathi Devi.Hydrolysis of biomass using a reusable solid carbon acid catalyst and fermentation of the catalytic hydrolysate to ethanol. // Bioresour. Technol. - 2015. V. 188. P. 99-102.

6. B.L.A. Prabhavathi Devi, K.N. Gangadhar, P.S. Sai Prasad, B. Jagannadh, R.B.N. Prasad A glycerol-based carbon catalyst for the preparation of biodiesel // Chem. Sus. Chem., - 2009. V. 2, P. 617-620.

7. N.V. Gromov, O.P. Taran, D.A. Yatsenko, A.B. Ayupov, A. Loppinet-Serani, C. Aymonier, V.E. Agabekov Development of Sulfonated Catalysts Based on Graphite-Like Carbon Sibunit for Cellulose Hydrolysis // Journal Siberian Federal University. Chemistry. 2014 7 (1) 87-99. N.

8. V. Gromov, A.B. Ayupov, C. Aymonier, V. A. Agabekov, O. P. Taran Development of Solid Acid Catalysts Based on Sibunit Carbon Material for Cellulose Transformation into 5-hydroxymethilfurfural // Journal Siberian Federal University. Chemistry 2014 7 (4). 597-609.

9. S. Park, J.O. Baker, M.E. Himmel, P.A. Parilla, D.K. Johnson. Cellulose crystallinity index: measurement techniques and their impact on interpreting cellulase performance // Biotechnol. Biofuels. 2010 (3) Article 10.