Результат интеллектуальной деятельности: Способ диагностики предрасположенности к прогрессированию атеросклероза сонных артерий у лиц с нормолипидемией по содержанию CD4+ Т-лимфоцитов в периферической крови

Изобретение относится к медицине, в частности к диагностике сердечно-сосудистых заболеваний, а именно к лабораторным диагностическим способам определения предрасположенности к прогрессированию атеросклероза сонных артерий у лиц с нормолипидемией, т.е. с «целевыми» (менее 3,5 мМ) значениями концентрации холестерина липопротеидов низкой плотности крови.

Прогрессирование атеросклероза сонных артерий повышает риск развития нарушений мозгового кровообращения. Одним из основных факторов риска атеросклероза является увеличение концентрации в крови холестерина липопротеидов низкой плотности (ХС ЛНП), однако в ряде случаев атеросклероз может развиваться даже при коррекции его уровня. Своевременное выявление таких пациентов, усиление контроля над ними и назначение соответствующей терапии позволят уменьшить количество повторных госпитализаций и сократить затраты на оперативное лечение.

В настоящее время нет лабораторных показателей, однозначно указывающих на вероятность прогрессии атеросклероза сонных артерий и развития осложнений у пациентов, не имеющих традиционных факторов риска заболевания, в частности с уровнем холестерина липопротеидов низкой плотности (ХС ЛНП) в крови менее 3,5 мМ, что соответствует целевым значениям в группе лиц с невысоким сердечно-сосудистым риском (Диагностика и коррекция нарушений липидного обмена с целью профилактики и лечения атеросклероза. Российские рекомендации V пересмотр. Атеросклероз и дислипидемии. 2012, N4 (9) С. 5-53).

Известен способ экспресс-диагностики предрасположенности больного с ишемической болезнью сердца (ИБС) к прогрессированию атеросклероза. Сущность способа заключается в том, что проводят оценку степени стимуляции атерогенной функции моноцит-производных макрофагов из крови больных с ИБС по способности макрофагов а) продуцировать активные формы кислорода, оцененные по величине люминолзависимой хемилюминесценции, б) окислять липопротеины низкой плотности, оцененные по накоплению в них продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, в) поглощать липопротеины низкой плотности, оцененные по накоплению в макрофагах общего холестерина, и г) по сохранению 50-70% жизнеспособных макрофагов в процессе 1 часа инкубации в безбелковой субстрат-дефицитной среде.

(Патент РФ №2408019, МПК G01N 33/50, опубл. 27.12.2010 г.)

Назначением способа является «диагностика предрасположенности к прогрессированию атеросклероза», однако в нем не приведены клинические подтверждения прогрессирования атеросклероза у лиц с повышенной проатерогенной функцией моноцитов и макрофагов, в частности нет данных ультразвукового исследования сонных артерий или коронарной ангиографии, указывающих на изменение размеров атеросклеротических поражений сосудов в отдаленном периоде. Кроме того, данный способ предполагает получение от пациентов существенного количества биоматериала (периферической крови) и использование сложных методик, включающих выделение мононуклеарных лейкоцитов, их культивирование в контролируемых условиях, соблюдение правил асептики, нормирование суммарного клеточного ответа (измеряемого по величине хемилюминисценции или светопоглощения) на количество моноцитов/макрофагов.

Известен также способ диагностики, определения прогноза или идентификации предрасположенности к атеросклерозу и восприимчивости к развитию атеросклеротических бляшек (АСБ) и/или обструкции сосудов, где способ включает анализ образца для определения процентной частоты по меньшей мере двух субпопуляций Т-лимфоцитов и сравнение данных со сравнительными и/или контрольными данными, где по меньшей мере одна из указанных субпопуляций Т-лимфоцитов представляет собой популяцию CD8 Т-клеток, выбранную из списка, состоящего из CD8+CD11L+CD45RA+, CD8+CD11L+CD45RO+, CD8+CD11a+, CD8+CD62L+, CD8+CD11highRO+ и CD8+CD38+RO+ и по меньшей мере одна другая из указанных субпопуляций Т-лимфоцитов представляет собой популяцию CD4 Т-клеток, выбранную из списка, состоящего из CD4+CD62L+, CD4+CD49d+, CD4+CD25+, CD4+DRII+, CD4+CD44+ и CD4+CD3+CD45RO+.

(Патент РФ №2384847, МПК G01N 33/50, опубл. 20.03.2010 г.)

Недостатки данного способа заключаются в том, что он предполагает многопараметрический анализ нескольких (по меньшей мере, двух) субпопуляций Т-лимфоцитов. Для этого требуются набор антител, меченных разными флуоресцентными метками, и цитофлуориметры, оснащенные соответствующими детекторами флуоресценции.

Задачей изобретения является создание эффективного, недорогого, достоверного, легко воспроизводимого и не требующего большого количества биоматериала способа диагностики предрасположенности к прогрессированию атеросклероза сонных артерий по содержанию CD4+ T-лимфоцитов в периферической крови, позволяющего в краткосрочной перспективе выявлять пациентов с высоким риском прогрессирования атеросклероза сонных артерий с последующим индивидуальном подбором терапии и, как следствие, уменьшение количества повторных госпитализаций и сокращение затрат на лечение.

Технический результат изобретения заключается в повышении эффективности и достоверности способа выявления пациентов с высоким риском прогрессирования атеросклероза и уменьшении количества повторных госпитализаций.

Это достигается тем, что в заявляемом способе диагностики предрасположенности к прогрессировании атеросклероза сонных артерий у пациентов с концентрацией холестерина липопротеидов низкой плотности (ХС ЛНП) <3,5 мМ в образце периферической крови определяют содержание CD4+ Т-лимфоцитов с использованием моноклональных антител к CD4, меченных флуоресцентной меткой, и цитофлуориметрии в потоке, при этом относительное содержание CD4+ Т-лимфоцитов, выраженное в процентах (%) от лимфоцитов, более 39,5% свидетельствует о высоком риске прогрессирования атеросклероза.

Получение достоверной диагностической информации по указанным иммунологическим показателям объясняется следующим. Известно, что атеросклероз представляет собой хронический воспалительный процесс в артериальной стенке, протекающий на фоне накопления проатерогенных факторов - модифицированных липопротеидов, гликированных белков, клеточного «дебриса» и т.д. Лимфоциты, прежде всего CD4+ клетки, присутствующие в атеросклеротической бляшке (АСБ) на всех стадиях ее развития, модулируют течение воспалительного процесса. Определение содержания данных лимфоцитов в крови позволяет получить информацию о характере и интенсивности воспалительного процесса в артериальной стенке.

Для осуществления способа исследуют периферическую венозную кровь, взятую в пробирки с антикоагулянтом, в количестве 1 мл. Производят типирование лимфоцитов методами прямой иммунофлуоресценции и цитофлуориметрии в потоке.

Содержание CD4+ лимфоцитов, выраженное в % от лимфоцитов, более 39,5% свидетельствует о высоком риске прогрессирования атеросклероза в краткосрочной перспективе (1 год).

Клинический пример 1

Пациент С., мужчина, 46 лет. Не курит. Жалоб нет. Артериальную гипертония (АГ), ишемическую болезнь сердца (ИБС) и острую недостаточность мозгового кровообращения (ОНМК) в анамнезе отрицает. Лекарственную терапию не получал.

Лабораторные показатели при поступлении: лейкоциты 5,0 млн/мл, лимфоциты 1,5 млн/мл, общий холестерин 5,9 ммоль/л, холестерин липопротеидов низкой плотности 2,4 ммоль/л. По вышеописанной методике подготовили пробы для исследования. Содержание CD4+ (% от лимфоцитов) - 48,5, что указывает на высокий риск прогрессирования атеросклероза.

При ультразвуковом дуплексном сканировании (УЗДС) брахиоцефальных артерий выявлено утолщение и уплотнение стенки в устье и проксимальной трети правой внутренней сонной артерии (ВСА), задней стенки в бифуркации левой общей сонной артерии (ОСА), в устье левой ВСА; стеноз 30-35% в бифуркации правой ОСА за счет гомогенной атеросклеротической бляшки (АСБ) средней уз-плотности, расположенной преимущественно по задней стенке.

При УЗДС брахиоцефальных артерий через 1 год: утолщение и уплотнение стенки в устье и проксимальной трети правой ВСА, задней стенки в бифуркации левой ОСА, в устье левой ВСА; стеноз 25-30% в бифуркации правой ОСА за счет гомогенной АСБ средней уз-плотности, расположенной преимущественно по задней стенке; стеноз до 20% в бифуркации левой ОСА за счет гетерогенной АСБ средней уз-плотности.

Таким образом, выявленное высокое содержание CD4+ лимфоцитов у данного пациента было связано с прогрессированием атеросклероза (возникновение новых атеросклеротических бляшек в бифуркации правой и левой ОСА).

Клинический пример 2

Пациент Р., мужчина, 61 год. Не курит. Жалоб нет. АГ, ИБС и ОНМК в анамнезе отрицает. Лекарственную терапию не получал.

Лабораторные показатели при поступлении: лейкоциты 8,0 млн/мл, лимфоциты 2,6 млн/мл, общий холестерин 5,4 ммоль/л, холестерин липопротеидов низкой плотности 2,6 ммоль/л. По вышеописанной методике подготовили пробы для исследования. Иммунологические показатели: содержание CD4+ (% от лимфоцитов) - 27,0, что исключает риск прогрессирования атеросклероза.

При УЗДС брахиоцефальных артерий выявлено утолщение и уплотнение стенки в устье правой ВСА, в бифуркации левой ОСА.

При проведении УЗДС брахиоцефальных артерий через 1 год признаков прогрессирования заболевания (увеличение степени стеноза, появление новых АСБ) не выявлено.

Таким образом, у данного пациента при низком содержании CD4+ клеток прогрессии атеросклероза сонных артерий за период наблюдения в течение 1 года не зарегистрировано.

По заявляемому способу содержание CD4+ -лимфоцитов было определено в пробах периферической венозной крови 33 пациентов, среди которых у 17 уровень ХС ЛНП составлял <3,5 мМ. У 18 пациентов (9 с нормолипидемией) наблюдалась прогрессия заболевания, т.е. появление нового стеноза в общей сонной артерии и внутренней сонной артерии и/или увеличение степени имевшегося ранее стеноза на 5% и более, по данным повторного ультразвукового дуплексного сканирования сонных артерий, проведенного через 10-13 мес. Пациенты с прогрессией заболевания имели исходно более высокое содержание CD4+ лимфоцитов в % от лимфоцитов (42,0 (38,0; 48,5) против 38,0 (32,0; 43,0); р=0.05). При анализе данных, полученных для лиц с «целевым» (менее 3,5 мМ) уровнем ХС ЛНП, различия оказались достоверными (против 42,0 (42,0; 48,5) против 38,0 (30,5; 40,0); р=0.007).

На Фиг. 1 показан результат ROC-анализа для относительного содержания CD4+ лимфоцитов в периферической крови больных, где отражена высокая диагностическая значимость в выявлении лиц, наклонных к прогрессированию атеросклероза сонных артерий, в группе пациентов с уровнем ХС ЛНП менее 3,5 мМ, но не в общей группе обследованных пациентов: показатель площади под характеристической кривой составил 0,89 (95% ДИ 0,72-1,05), что соответствовало высокому качеству построенной модели. На фиг. обозначены: AUC - площадь под ROC кривой, 95% CI - 95% доверительный интервал. Показатели чувствительности и специфичности определения содержания CD4+ клеток для прогнозирования прогрессии атеросклероза сонных артерий также были выше в группе пациентов с «целевыми» значениями ХС ЛНП по сравнению с общей группой обследованных больных (табл.).

Таким образом, заявляемый способ позволяет выявлять высокий риск прогрессирования атеросклеротического поражения артерий сонных артерий в ранние сроки (1-2 года), что делает возможным своевременное усиление контроля и терапии у данной категории пациентов с целью уменьшения количества повторных госпитализаций и сокращения затрат на оперативное лечение таких пациентов.