Способ определения левомицетина в кормах животного происхождения с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии

Изобретение относится к ветеринарной токсикологии и может быть использовано при определении содержания левомицетина в кормах животного происхождения.

Известен способ количественного определения левомицетина в пищевых продуктах и фармпрепаратах, заключающийся в том, что левомицетин переводят из пробы в раствор, проводят кислотный гидролиз и осаждают белок из гидролизата с последующим вольтамперометрическим определением, вольтамперометрическое определение левомицетина осуществляют путем регистрации катодных пиков антибиотика на индикаторном ртутно-пленочном или стеклоуглеродном электроде в дифференциальном режиме съемки вольтамперограмм при соответствующих потенциалах -(0,67±0,05) В и -(0,60±0,03) В относительно насыщенного хлорид-серебряного электрода на фонах 0,1 моль/дм³ аммония лимоннокислого двузамещенного (рН 4,7-5,1) или 0,1 моль/дм³ (NH₄)₂SO₄ с добавлением НСl до рН 5,1 при скорости развертки потенциала 10-25 мВ/с и концентрацию левомицетина определяют по высоте пика методом добавок аттестованных смесей [Патент RU №2180748, МПК G01N 27/48, 20.03.2002].

Недостатками известного способа являются низкая чувствительность и длительность проведения анализа.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому способу является определение остаточных количеств левомицетина (Хлорамфеникола, Хлормицетина) в продуктах животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, который заключается в отборе проб - 10 г мяса, гомогенизации с 15 см³ фосфатного буфера (рН=6,88), последующей экстракции 3 раза по 30 см³ этилацетата. Полученную взвесь центрифугируют 15 мин при 4000 об/мин и декантируют. Этилацетатный слой промывают последовательно 5 см³ насыщенного раствора NaCl с добавлением 0,2 мл 10% NaOH; 5 см³ насыщенного раствора NaCl с добавлением 0,2 см³ 10%-ного СН₃СООН; 5 см³ насыщенного раствора NaCl. Органический слой отбирают и упаривают на ротационном испарителе (при 50°С) до возможно минимального объема, отдувают азотом до исчезновения запаха органических растворителей, добавляют 3 см³ смеси ацетонитрил-вода (1:4) и экстрагируют 3 раза по 5 см³ петролейным эфиром. Петролейный эфир отбрасывают и извлекают левомицетин экстракцией этилацетатом (3 раза по 5 см³). Этилацетатный слой упаривают досуха, растворяют в 0,1 см³ метанола. В жидкостной хроматограф с колонкой (Ультрасфер ODS, C₁₈) 5 мкм (250×4,6 мм), УФ-детектором при λ=278 нм, используя элюент ацетонитрил-вода-дециламин (40:60:0,1), вводят 5 мкл стандартного раствора (10 нг/мкл) левомицетина. В тех же условиях вводят метанольный экстракт образца мяса. Проводят обработку результатов. За окончательный результат измерения принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. [Определение остаточных количеств левомицетина (Хлорамфеникола, Хлормицетина) в продуктах животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и иммуноферментного анализа. Методические указания. МУК 4.1.1912 - 04 // Сборник методических документов, необходимых для обеспечения применения Федерального закона от 12 июня 2008 г. - №88 ФЗ «Технический регламент на молоко и молочную продукцию». - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009. - С. 41-47

Недостатками данного метода определения левомицетина является его низкая чувствительность и избирательность, длительность проведения анализа.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение чувствительности и избирательности способа, сокращение длительности проведения анализа.

Технический результат достигается тем, что в способе определения левомицетина в кормах животного происхождения с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии, включающем отбор пробы, гомогенизацию, экстракцию, упаривание, растворение сухого остатка, введение растворенного сухого остатка в хроматограф с использованием элюента, обработку результатов анализа, в качестве пробы берут навеску кормов животного происхождения массой от 200 до 500 мг, экстракцию проводят 95% этанолом, перед упариванием экстракт фильтруют, обезвоживают сернокислым натрием, растворение сухого остатка проводят в этилацетате, в качестве хроматографа используют жидкостной хроматограф с детектором спектрофотометрическим UVV 104М и колонкой Диасфер-110С-16 (150×4) мм, с размером частиц сорбента 5 мкм, в качестве элюента используют смесь ацетонитрил-вода-диэтиламин в соотношении 30:70:0,1.

Уменьшение массы пробы корма животного происхождения позволяет уменьшить объем экстрагента и количество извлекаемых при экстракции коэкстрактивных веществ, исключить этап очистки экстракта, что сокращает потери искомого вещества, ускоряет выпаривание экстрагента, повышает чувствительность и избирательность метода, сокращает продолжительность проведения анализа.

Использование 95% этанола для экстракции повышает чувствительность и избирательность способа. Экстракция 95% этанолом позволяет извлечь максимальное количество левомицетина, так как его растворимость в 95% этаноле выше, чем в этилацетате.

Фильтрация, обезвоживание экстракта сернокислым натрием сокращает продолжительность проведения анализа.

Использование для растворения сухого остатка этилацетата повышает избирательность метода. Кроме того, использование для растворения сухого остатка этилацетата менее опасно, чем использование метанола.

Использование жидкостного хроматографа с детектором спектрофотометрическим UVV 104М и колонкой Диасфер-110С-16 (150×4) мм, с размером частиц сорбента 5 мкм, а также элюента, состоящего из смеси ацетонитрил-вода-диэтиламин в соотношении 30:70:0,1 позволяет получить острый, симметричный пик левомицетина, коэффициент асимметрии которого близок к 1, а также сократить время удерживания в колонке, что повышает чувствительность, избирательность метода и сокращает время проведения анализа.

Способ определения левомицетина в кормах животного происхождения с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии осуществляют следующим образом. Берут, например, 250 мг мясокостной муки, гомогенизируют. Далее экстрагируют 95% этанолом по 5 мл трижды по 20 минут. Отдельные экстракты объединяют, фильтруют через воронку с бумажным фильтром, заполненным безводным сернокислым натрием, в грушевидную колбу для выпаривания, затем упаривают на ротационном испарителе при температуре водяной бани 40°С досуха. Полученный сухой остаток растворяют в 1 мл этилацетата и аликвоту вводят в жидкостный хроматограф «Хромос-ЖХ 301» с детектором спектрофотометрическим UVV 104М и колонкой Диасфер-110С-16 (150×4) мм, с размером частиц сорбента 5 мкм. Рабочая длина волны 278 нм. В качестве элюента используют подвижную фазу ацетонитрил-вода-диэтиламин в соотношении 30:70:01. Скорость потока 500 мкл/мин. Время удерживания левомицетина 5,305 мин. Нижний предел обнаружения 0,005 мг/кг. Проводят обработку результатов анализа. Количество левомицетина в пробе корма животного происхождения (X, мг/кг) рассчитывают по формуле

Х=А×S₂×V₂ / S₁×V₁×P,

где X - содержание левомицетина в пробе, мг/кг;

А - количество левомицетина в стандартном растворе, введенном в хроматограф, нг;

S₁ - площадь пика стандартного раствора левомицетина, введенного в хроматограф, мм²;

S₂ - площадь пика левомицетина в пробе, мм²;

V₁ - объем экстракта, введенный в хроматограф, мкл;

V₂ - объем экстракта после растворения сухого оcтатка, мл;

Р - навеска анализируемого образца, г.

Метрологическая характеристика способа определения левомицетина в кормах животного происхождения с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии представлена в таблице 1.

Анализ метрологических характеристик свидетельствует о высокой чувствительности и избирательности предлагаемого способа.

Предлагаемый способ определения левомицетина в кормах животного происхождения с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии обеспечивает повышение чувствительности и избирательности за счет уменьшения навески пробы; использования в качестве экстрагента 95% этанола; использования жидкостного хроматографа с детектором спектрофотометрическим UVV 104М и колонкой Диасфер-110С-16 (150×4) мм, с размером частиц сорбента 5 мкм, а также элюента, состоящего из смеси ацетонитрил-вода-диэтиламин в соотношении 30:70:01. Чувствительность предлагаемого способа определения левомицетина повышается в 2 раза.

Предлагаемый способ определения левомицетина в кормах животного происхождения с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии обеспечивает сокращение длительности проведения анализа за счет уменьшения массы пробы корма, проведения фильтрации, обезвоживания экстракта сернокислым натрием, использования жидкостного хроматографа с детектором спектрофотометрическим UVV 104М и колонкой Диасфер-110С-16 (150×4) мм, с размером частиц сорбента 5 мкм, а также элюента, состоящего из смеси ацетонитрил-вода-диэтиламин в соотношении 30:70:01. Длительность проведения анализа предлагаемым способом сокращается в 1,8 раза.

Заявляемый способ определения левомицетина в кормах животного происхождения с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии может быть использован в лабораториях для контроля качества кормов, а также для оценки качества сырья животного происхождения, предназначенного для производства кормов, и определения содержания левомицетина в корме при добавлении в него антибиотика с целью групповой фармакотерапии.

Заявляемый способ определения левомицетина в кормах животного происхождения с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии апробирован в химико-токсикологическом отделе БУ ОО «Омская областная ветеринарная лаборатория».

Источники информации

1. Патент RU №2180748, МПК G01N 27/48, 20.03.2002.

2. Определение остаточных количеств левомицетина (Хлорамфеникола, Хлормицетина) в продуктах животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и иммуноферментного анализа. Методические указания. МУК 4.1.1912 - 04 // Сборник методических документов, необходимых для обеспечения применения Федерального закона от 12 июня 2008 г. - №88 ФЗ «Технический регламент на молоко и молочную продукцию». - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009. - С. 41-47 (прототип).