×
19.01.2018
218.016.0969

Результат интеллектуальной деятельности: Способ получения каллусной культуры борца бородатого (Aconitum barbatum Patr. ex Pers.)

Вид РИД

Изобретение

Аннотация: Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения каллусной культуры борца бородатого (Aconitum barbatum Patr. ex Pers.), включающий стерилизацию семян, помещение их в холодильник при температуре 5±1°С на 2,5 месяца для стратификации и получение каллусной культуры из этиолированных проростков где недозрелые семена до стратификации последовательно стерилизуют в растворе спирта (70%) 40 с и сулемы (0,1%) 3-4 минуты, отмывают стерильной дистиллированной водой, после стратификации последовательно стерилизуют в растворе спирта (70%) 30 с и сулемы (0,1%) 1-2 минуты и также отмывают стерильной дистиллированной водой, затем помещают семена в пробирки на агаризованную среду МС без добавления стимуляторов роста для получения этиолированных проростков в темноту на 3-4 недели, от полученных этиолированных проростков отделяют побеги и помещают в пробирки на агаризованную среду МС добавлением 1,8–2,2 мг/л 2-4 D (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) и 0,3–0,8 мг/л 6-БАП (6-бензиламинопурин) для получения каллуса, культивирование проводится при температуре 26±1°С, влажности 70% в темноте. Изобретение позволяет получить каллусную культуру борца бородатого (Aconitum barbatum Patr. ex Pers.). 1 табл., 2 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к культивированию клеточных культур лекарственных растений, и может быть использовано в медицине для получения сырья, содержащего биологически активные вещества, а также при введении в культуру in vitro других представителей лекарственных растений, получение которых затруднено из-за выделения ядовитых соединений в питательную среду.

Борец бородатый – растение семейства Лютиковые (Ranunculaceae), богат дитерпеновыми алкалоидами, такими как аконитин, делькозин, ликоктонин, зонгорин и батаконин и др., кумаринами, флавоноидами, проазуленами. В народной медицине используется для лечения заболеваний ревматического происхождения и воспалений. Обладает болеутоляющим, противоопухолевым свойствами.

Известен способ получения каллусной культуры Pulsatilla taurica (статья Сидякин А.И., Мустафаева У.Ю.  Получение каллусных культур Pulsatilla taurica и их цитологический анализ // Инновации в науке / Сб. ст. по материалам XLV междунар. науч.-практ. конф. № 5 (42). Новосибирск: Изд. «СибАК», 2015, с. 43-53.) из высечек листьев проростков и ювенильных растений, полученных в культуре in vitro из семян, и высечек листьев от растений в фазу плодоношения. Способ включает ступенчатую стерилизацию исходного материала: 1 % KMnO4 (40 минут); 70% этанол (1 минута) и 3% H2O2 (5 минут), и культивирование эксплантов на питательной среде Мурасиге и Скуга со следующими вариантами добавления гормонов 0,1 мг/л 2,4-Д (2,4- дихлорфеноксиуксусная кислота) и 0,01 мг/л 6-БАП (6-бензиламинопурин), и 3 мг/л 2,4-Д и 1,0 мг/л 6-БАП. Экспланты культивируют на свету или в темноте при температуре 20—24°С. Цикл выращивания культур составляет 70—90 суток.

Недостатком аналога является выбор экспланта для получения каллуса, так как известно, что для получения клеточной культуры алкалоидоносных растений, таких как борец бородатый, рационально использовать наиболее ранние ткани, в которых нет накопления алкалоидов. Несмотря на то что растение Pulsatilla taurica также относится к семейству лютиковые, как и борец бородатый, оно не содержит тех же алкалоидов, а значит, что вышеописанный способ получения каллусной культуры не подходит. Кроме того, в данном способе используется более высокая концентрация стимулятора роста, что приводит к увеличению стоимости процесса.

Известен способ получения каллусной культуры болиголова пятнистого (Conium maculatum L.) (Патент РФ 2590586, опубл.  10.07.2016, МПК C12N5/04), включающий посадку семян в стерильный грунт, выращивание интактных растений в течение 1-2 месяцев с интенсивностью освещения 150 мкМ квантов/м2с, отбор эксплантов 3-4-недельного возраста, стерилизацию последовательно в 70% спирте 30 с и в 0,1% сулеме 4 мин, помещение кусочков стебля длиной 1,5-2 см на агаризованную среду Мурасиге-Скуга без добавления гормонов на 7-10 дней для контроля стерильности, выделение каллуса и посадка в культуральные сосуды с питательной средой MS с добавлением стимуляторов роста НУК и 6-БАП в условиях ламинарного бокса, при этом каллус высаживают в возрасте 30 суток, а культивирование каллусной ткани проводится при 26±1°С, влажности 70% в темноте, после чего проростки переносят на 6 недель на агаризованную среду Мурасиге-Скуга с добавлением 1,5–2,5 мг/л 2-4 D (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) и 0,3–0,8 мг/л БАП (6-бензиламинопурин) для получения каллуса.

Недостатками известного способа является более сложная технология получения культуры, при которой необходимыми этапами являются как проращивание семян в грунте, так и проведение контроля стерильности в течение 10 дней, для чего необходимы дополнительные затраты на приготовление питательных сред. Также в данном способе используются растения 3-4-недельного возраста, а для получения культуры Aconitum barbatum Patr. ex Pers рационально использовать более ранние ткани.

Наиболее близким к заявляемому техническому решению по технической сущности и достигаемому техническому результату является способ получения каллусной культуры аконита байкальского (Еникеев А. Г., Семенов А. А., Горшков А. Г., Максимова Л. А., Копытина Т. В., Гаманец Л. В., Швецов С. Г., Пермяков А. В., Шафикова Т. Н. Культура клеток Aconitum baicalense Turcz. ex Rapaics 1907 перспективный источник биологически активных соединений // Научные ведомости БелГУ. Серия: Естественные науки. 2011. №3-1 (98).). Способ включает стерилизацию семян в 3% растворе перекиси водорода, перенос их в пенициллиновые флаконы с агаризованной средой (соли 1/2MS, без сахарозы) и помещение флаконов в холодильник (4°С) на 2,5 месяца. По истечении указанного срока флаконы с семенами переносят в темновой термостат на 26°С. Каллусную культуру получают из этиолированных проростков на солевой среде В5 с добавлением тиамина 1мг/л, пиридоксина 0,5 мг/л, никотиновой кислоты 0,5 мг/л, инозита 100 мг/л, 2,4-Д 1 мг/л, 2% сахарозы, агар-агар 0,8%, pH среды 5,8. Описанный способ принят за прототип изобретения.

Недостатками прототипа является более сложная технология получения культуры, при которой необходимым этапом является проращивание семян в темновом термостате, для чего необходимо определенное оборудование. Также в среду для получения каллусной культуры дополнительно добавляют инозит, что увеличивает ее стоимость.

В литературных источниках способов получения каллусной ткани Aconitum barbatum Patr. ex Pers. не было найдено.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа культивирования каллусной ткани Aconitum barbatum, перспективной в качестве возможного источника алкалоидов терапевтического действия.

Поставленная задача решается тем, что культивирование каллусной ткани Aconitum barbatum включает в себя стерилизацию семян, помещение их в холодильник при температуре 5±1ºС на 2,5 месяца для стратификации и получение каллусной культуры из этиолированных проростков. При этом недозрелые семена до стратификации последовательно стерилизуют в растворе спирта (70%) 40 с и сулемы (0,1%) 3-4 минуты, отмывают стерильной дистиллированной водой, после стратификации последовательно стерилизуют в растворе спирта (70%) 30 с и сулемы (0,1%) 1-2 минуты и также отмывают стерильной дистиллированной водой, затем помещают семена в пробирки на агаризованную среду МС без добавления стимуляторов роста для получения этиолированных проростков в темноту на 3-4 недели, от полученных этиолированных проростков отделяют побеги и помещают в пробирки на агаризованную среду МС добавлением 1,8–2,2 мг/л 2-4 D (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) и 0,3–0,8 мг/л 6-БАП (6-бензиламинопурин) для получения каллуса, культивирование проводится при температуре 26±1ºС, влажности 70% в темноте.

После образования каллуса проводят его отделение и рассадку в культуральные сосуды со свежей питательной средой, того же состава.

Питательная среда Мурасиге-Скуга содержит компоненты в количественном соотношении, представленном в таблице 1.

Таблица 1 – Состав питательной среды Мурасиге-Скуга, мг/л

Полученный каллус рассаживают в культуральные сосуды с питательной средой MS с добавлением стимуляторов роста – 2,4-D и 6-БАП. Пересадку осуществляют каждые 30 суток. Культивирование каллусной ткани проводят при 26±1ºС влажности – 70% в темноте.

Технический результат - получение каллусной культуры борца бородатого (Aconitum barbatum Patr. ex Pers.).

Пример 1

Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей (KNO3 - 1900 мг/л, NH4NO3 - 1650 мг/л, MgSO4 × 7H2O 370 мг/л, KH2PO4 - 170 мг/л), при этом каждую из макросолей растворяют последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводили до 1 л. Аналогично готовят концентраты микросолей (H3BO3 - 6,2 мг/л, MnSO4 × 4H2O - 32,3 мг/л, ZnSO4 × 7H2O - 8,6 мг/л, Na2MoO4 × 2H2O - 0,25 мг/л, KI - 0,83 мг/л, CuSO4 × 5H2O - 0,025 мг/л, CoCl2 × 6H2O - 0,025 мг/л), Fe-хелата (FeSO4 × 7H2O - 37,3 мг/л, Na2EDTA × 2H2O - 27,8 мг/л), CaCl2 × 2H2O, витаминов (пиридоксин-HCl - 0,4-0,6 мг/л, тиамин-HCl - 0,5–1,5 мг/л, никотиновая кислота-HCl - 0,4-0,6мг/л). Макро- и микросоли, Fe-хелат, CaCl2 × 2H2O, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. В колбы на 500 мл насыпают по 3 г агара, по 9 г сахарозы, среду разливают по 300 мл, закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1,0 атм. Чашки Петри, сосуды для культивирования, пинцеты и скальпель стерилизуют в течение 2,5 часа в сухожаровом шкафу при 160°С. Затем стерильную питательную среду в условиях ламинарного бокса добавляют 2,4 – D (1,8 мг/л) и 6-БАП (0,3 мг/л), и размещают ее по культуральным сосудам.

Недозрелые семена борца бородатого в условиях ламинарного бокса стерилизуют последовательно в растворе спирта (70%) 40 с и сулемы (0,1%) 3-4 минуты, затем отмывают стерильной дистиллированной водой. Далее семена помещают в чашки Петри со стерильным, увлажненным песком, и убирают в холодильник на 2-2,5 месяца при температуре 5±1ºС для стратификации. Через 2-2,5 месяца семена извлекают из чашек Петри, последовательно стерилизуют в растворе спирта (70%) 30 с и сулемы (0,1%) 1-2 минуты. Далее семена отмывают стерильной дистиллированной водой и помещают их в пробирки на агаризованную среду МС без добавления стимуляторов роста для получения проростков и помещают в темноту на 3-4 недели. От полученных этиолированных проростков отделяют побеги и помещают в пробирки на агаризованную среду МС добавлением 1,8–2,2 мг/л 2-4 D (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) и 0,3–0,8 мг/л 6-БАП (6-бензиламинопурин) для каллусообразования. Пробирки помещают на стеллажи при температуре 26±1ºС, влажности – 70% в темноту. После образования каллуса проводят его отделение, и рассадку в культуральные сосуды со свежей питательной средой, того же состава.

Ткань высаживают в возрасте 30 суток. Культивирование каллусной культуры проводится при 26±1°С, влажности – 70%, в темноте.

Пример 2.

Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей (KNO3 - 1900 мг/л, NH4NO3 - 1650 мг/л, MgSO4 × 7H2O 370 мг/л, KH2PO4 - 170 мг/л), при этом каждую из макросолей растворяют последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводили до 1 л. Аналогично готовят концентраты микросолей (H3BO3 - 6,2 мг/л, MnSO4 × 4H2O - 32,3 мг/л, ZnSO4 × 7H2O - 8,6 мг/л, Na2MoO4 × 2H2O - 0,25 мг/л, KI - 0,83 мг/л, CuSO4 × 5H2O - 0,025 мг/л, CoCl2 × 6H2O - 0,025 мг/л), Fe-хелата (FeSO4 × 7H2O - 37,3 мг/л, Na2EDTA × 2H2O - 27,8 мг/л), CaCl2 × 2H2O, витаминов (пиридоксин-HCl - 0,4-0,6 мг/л, тиамин-HCl - 0,5 – 1,5 мг/л, никотиновая кислота-HCl - 0,4-0,6мг/л). Макро- и микросоли, Fe-хелат, CaCl2 × 2H2O, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. В колбы на 500 мл насыпают по 3 г агара, по 9 г сахарозы, среду разливают по 300 мл, закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1,0 атм. Чашки Петри, сосуды для культивирования, пинцеты и скальпель стерилизуют в течение 2,5 часа в сухожаровом шкафу при 160°С. Затем стерильную питательную среду в условиях ламинарного бокса добавляют 2,4 – D (2,2 мг/л) и 6-БАП (0,8 мг/л), и размещают ее по культуральным сосудам.

Недозрелые семена борца бородатого, в условиях ламинарного бокса стерилизуют последовательно в растворе спирта (70%) 40 с и сулемы (0,1%) 3-4 минуты, затем отмывают стерильной дистиллированной водой. Далее семена помещают в чашки Петри со стерильным, увлажненным песком, и убирают в холодильник на 2-2,5 месяца при температуре 5±1ºС для стратификации. Через 2-2,5 месяца семена извлекают из чашек Петри, последовательно стерилизуют в растворе спирта (70%) 30 с и сулемы (0,1%) 1-2 минуты. Далее семена отмывают стерильной дистиллированной водой и помещают их в пробирки на агаризованную среду МС без добавления стимуляторов роста для получения проростков и помещают в темноту на 3-4 недели. От полученных этиолированных проростков отделяют побеги и помещают в пробирки на агаризованную среду МС добавлением 1,8–2,2 мг/л 2-4 D (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) и 0,3–0,8 мг/л 6-БАП (6-бензиламинопурин) для каллусообразования. Пробирки помещают на стеллажи при температуре 26±1ºС, влажности – 70% в темноту. После образования каллуса проводят его отделение, и рассадку в культуральные сосуды со свежей питательной средой, того же состава.

Ткань высаживают в возрасте 30 суток. Культивирование каллусной культуры проводится при 26±1°С, влажности – 70%, в темноте.

Способ получения каллусной культуры борца бородатого (Aconitum barbatum Patr. ex Pers.), включающий стерилизацию семян, помещение их в холодильник при температуре 5±1С на 2,5 месяца для стратификации и получение каллусной культуры из этиолированных проростков, отличающийся тем, что недозрелые семена до стратификации последовательно стерилизуют в растворе спирта (70%) 40 с и сулемы (0,1%) 3-4 минуты, отмывают стерильной дистиллированной водой, после стратификации последовательно стерилизуют в растворе спирта (70%) 30 с и сулемы (0,1%) 1-2 минуты и также отмывают стерильной дистиллированной водой, затем помещают семена в пробирки на агаризованную среду МС без добавления стимуляторов роста для получения этиолированных проростков в темноту на 3-4 недели, от полученных этиолированных проростков отделяют побеги и помещают в пробирки на агаризованную среду МС добавлением 1,8–2,2 мг/л 2-4 D (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) и 0,3–0,8 мг/л 6-БАП (6-бензиламинопурин) для получения каллуса, культивирование проводится при температуре 26±1C, влажности 70% в темноте.
Источник поступления информации: Роспатент

Показаны записи 171-179 из 179.
22.01.2020
№220.017.f8a3

Способ лечения кистоза придатка яичка

Изобретение относится к медицине и медицинской техники, а именно к андрологии, и может быть использовано для лечения кистоза придатка яичка. Удаление кисты осуществляют аппликацией охлажденного в жидком азоте с контактными элементами инструмента из проницаемо-пористого никелида титана на место...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002711622
Дата охранного документа: 17.01.2020
19.03.2020
№220.018.0de3

Способ одновременного определения токсичных компонентов в имплантатах из полилактид-гликолида (plga)

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам количественного определения токсичных компонентов в имплантатах на основе полилактид-гликолида (PLGA) методом газовой хроматографии. Способ одновременного определения в одной пробе количественного определения токсичных компонентов...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002716831
Дата охранного документа: 17.03.2020
21.03.2020
№220.018.0e9b

Комплекс распределенного управления интеллектуальными роботами для борьбы с малогабаритными беспилотными летательными аппаратами

Комплекс распределенного управления интеллектуальными роботами для борьбы с малогабаритными беспилотными летательными аппаратами (БПЛА) содержит БПЛА-охотник, блок поиска БПЛА-нарушителя, средства захвата или ликвидации БПЛА-нарушителя, комплект мобильных наземных роботов высокой проходимости,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002717047
Дата охранного документа: 18.03.2020
05.04.2020
№220.018.1369

Цифровой имитатор случайных сигналов

Изобретение относится к области радиотехники и измерительной техники. Технический результат заключается в обеспечении возможности получения последовательности псевдослучайных чисел с вероятностными свойствами. Технический результат достигается за счет цифрового имитатора случайных сигналов,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002718417
Дата охранного документа: 02.04.2020
23.04.2020
№220.018.180c

Способ получения тонкопленочных материалов на основе оксидов кремния, фосфора, кальция и магния

Изобретение относится к технологии получения тонкопленочных покрытий, применяемых в различных областях техники, в том числе в качестве биоактивного материала. Способ получения тонкопленочных материалов на основе сложных оксидных систем включает приготовление пленкообразующего раствора на основе...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002719580
Дата охранного документа: 21.04.2020
26.04.2020
№220.018.19e7

Радиопоглощающий материал и способ его получения

Изобретение относится к радиотехнике, а именно к поглотителям высокочастотного электромагнитного излучения в диапазоне сверхвысоких частот, и может быть использовано для снижения возможности обнаружения различных целей средствами радиообнаружения, для обеспечения электромагнитной совместимости...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002720152
Дата охранного документа: 24.04.2020
21.05.2020
№220.018.1f09

Робот для диагностики и ремонта трубопроводного транспорта

Изобретение относится к гибридным роботам для определения, разметки и ремонта участков трубопроводного транспорта с химическими или радиоактивными утечками. Предложенное устройство выполнено в виде решетки с колесами, на универсальной аэродинамической платформе размещен мультикоптер....
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002721473
Дата охранного документа: 19.05.2020
22.05.2020
№220.018.1fd1

Многоволновый фотовозбуждаемый тонкопленочный органический лазер

Изобретение относится к лазерной технике. Многоволновый фотовозбуждаемый тонкопленочный органический лазер содержит источник оптической накачки, лазерно-активный элемент в виде подложки, на которую нанесен дополнительный слой, обеспечивающий условия полного внутреннего отражения для длины волны...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002721584
Дата охранного документа: 20.05.2020
24.07.2020
№220.018.36de

Высокопористый материал на основе диатомита и способ его получения

Изобретение относится к способам получения из диатомита высокопористого сорбента на основе диоксида кремния с величиной удельной поверхности свыше 350 м/г и иерархической пористой структурой. Полученный продукт имеет исходную макропористую структуру диатомита и вторичную структуру узких мезопор...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002727393
Дата охранного документа: 21.07.2020
Показаны записи 111-111 из 111.
20.02.2020
№220.018.0456

Способ моделирования нарушений коагуляционного звена системы гемостаза

Изобретение относится к медицине, а именно к области воспроизведения болезней человека в эксперименте, и может быть использовано для моделирования нарушений свертывающей системы крови на фоне действия цитостатиков. Цисплатин вводят внутрибрюшинно однократно мышам по 10 мг/кг, крысам по 4 мг/кг,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002714597
Дата охранного документа: 18.02.2020
+ добавить свой РИД