Результат интеллектуальной деятельности: Вольтамперометрический способ определения общего холестерина в биологических объектах

Изобретение относится к области медицины и описывает способ определения общего холестерина для диагностики и мониторинга терапии сердечно-сосудистых заболеваний, в частности позволяет количественно определить содержание холестерина в образце биологической жидкости человека методом дифференциальной анодной вольтамперометрии.

Известен способ определения холестерина на стеклоуглеродном электроде с нанесенными на его поверхность платино-палладиевыми наночастицами, размещенными на графеновых листах и закрепленных хитозаном. В данной методике измерение проводят за счет получения аналитического сигнала от перекиси водорода, образующейся в результате ферментативного (с применением холестерол оксидазы) окисления холестерина. В данном способе применяется трехэлектродная ячейка, электродом сравнения служит насыщенный хлорид-серебряный электрод или насыщенный каломельный электрод. В качестве фонового электролита выступает стандартный фосфатный буфер (рН 7.0). В результате осуществляется регистрация катодного сигнала перекиси водорода при потенциале -0.15 В и анодного сигнала при потенциале +0.1 В. Калибровочная кривая линейная в области концентраций от 2,2 мкмоль/дм³ до 520 мкмоль/дм³. Предел обнаружения составил 0,75 мкмоль/дм³. Подготовка электрода заключается в предварительной полировке поверхности стеклоуглерода алюминием до получения зеркалоподобного покрытия, последующей ультразвуковой очистке в смеси этанола и воды и дальнейшем высушивании на воздухе при комнатной температуре в течение 120 мин. Затем подготовленная поверхность покрывается заранее подготовленным композитом из графеновых листов, смешанных с хитозаном в дифенилфосфорилазиде (относящимся к токсичным слабогорючим веществам). После чего осуществляется сушка подготовленной поверхности на воздухе в течение 60 минут. Затем осуществляется электрохимический синтез наночастиц на полученной электродной поверхности. Для чего эквимолярную смесь гексахлороплатината (IV) водорода (относящегося к токсичным веществам) и хлорида палладия (II) (относящегося к остротоксичным веществам) помещают в электрохимическую ячейку, налагая на рабочий электрод потенциал, равный -0,2 В, в течение 200 с (Shurui Cao, Lei Zhang,Yaqin Chai, Ruo Yuan Electrochemistry of cholesterol biosensor based on a novel Pt-Pd bimetallic nanoparticle decorated grapheme catalyst / Talanta. 2013. Vol. 109, pp. 167-172).

Недостатками указанного способа являются: использование в аналитической системе ферментов, склонных к денатурации, что осложняет процесс получения точного аналитического сигнала и негативно влияет на его воспроизводимость; сложность в подготовке рабочего электрода к работе, и, как следствие, высокие временные затраты на проведение анализа, при этом для формирования электродной поверхности рабочего электрода используются токсичные реактивы, что повышает уровень опасности работы; в способе применяется постоянно-токовая форма, что приводит к снижению чувствительности и значительному повышению предела обнаружения до 7,5*10^-7 моль/дм³.

Известен способ амперометрического определения холестерина. В данной методике измерение проводится при помощи биосенсора, в котором на золь-гелевую матрицу иммобилизуются холестерин оксидаза и берлинская лазурь, выступающая как медиатор переноса электронов относительно перекиси водорода. В данном способе применяют двухэлектродную анод-катодную систему. Калибровочная кривая линейна в области концентраций 0,015-0,15 ммоль/дм³. Предел обнаружения составляет 2,3 мкмоль/дм³, чувствительность сенсора составляет 26 мА*М^-1*см^-2. Однако необходимость применения холестерол оксидазы осложняет анализ благодаря высокой чувствительности фермента к внешним условиям и его склонности к денатурации. Помимо этого в данном способе описывается получение аналитического отклика от перекиси водорода, образующегося в результате реакции окисления холестерина: аналитический сигнал является косвенным. Электрохимическая ячейка представляет собой пару электродов (анод и катод соответственно), в которых в качестве материала подложки применяется ткань из углеродного волокна. Электроды изготавливаются методом трафаретной печати, после чего, подвергаются модификации поверхности. Процедура подготовки электродов к модификации электродной поверхности включает в себя предварительную полировку алюминием, последующей ультразвуковой очисткой с применением воды и ополаскиванием поверхности этанолом. После чего подготовленные электроды подвергали высушиванию на воздухе в течение 30 мин при комнатной температуре. Для формирования катода предварительно наносится водный раствор берлинской лазури, после чего осуществляется иммобилизация ферментов из водного раствора холестерол оксидазы, смешанного с изопропиловым спиртом и 3-аминопропилтриэтоксисилоксаном (относящимся к токсичным веществам). Для формирования анода на предварительно подготовленную поверхность наносится смесь водного раствора холестерол оксидазы, изопропилового спирта, 3-аминопропилтриэтоксисилоксана (относящегося к токсичным веществам) и фенотиазина. (AlinaN. Sekretaryova, ValerioBeni, MatsEriksson, ArkadyA. Karyakin, AnthonyP. F. Turner, andMikhailYu. Vagin Cholesterol Self-Powered Biosensor / Anal. Chem. 2014. Vol. 86, Iss.19, pp 9540-9547).

Недостатками данного способа являются: использование в аналитической системе ферментов, склонных к денатурации, что осложняет процесс получения точного аналитического сигнала, и негативно влияет на его воспроизводимость; в способе применяется постоянно-токовая форма развертки, что приводит к снижению чувствительности способа; сложность в подготовке рабочего электрода к работе, и, как следствие, значительное увеличение времени на проведение анализа, при этом для формирования электродной поверхности рабочего электрода используются токсичные реактивы, что повышает уровень опасности работы; при этом в данном способе аналитический сигнал является косвенным, поскольку получается от пероксида водорода, а не от холестерина (ферменты катализируют окисление холестерина, содержащегося в крови до пероксида водорода).

Ближайшим из известных аналогов является способ «Polymer based enzyme electrode for estimation of cholesterol and process for preparation thereof» (Патент США №US 2004/0074772 Al, от 22.04.2004). Данный способ заключается в съемке циклических вольтамперограмм холестерина с использованием электрода из оксида индия-олова, покрытого полипирролльной мембраной с холестерол оксидазой и гексацианоферратом (III) калия с получением катодного перекисного отклика при +0,15 В и анодного отклика при +0,4 В относительно насыщенного хлорид-серебряного электрода на фоне фосфатного буферного раствора с рН 6.8 при постоянно-токовой форме развертке потенциала со скоростью 0.06 В/с. Для формирования электрода сначала проводят подготовку оксида индия-олова путем ультразвуковой обработки материала подложки в воде. Поверхностьэлектрода промывают водой и тщательно высушивают на воздухе, затем на поверхности формируется ионопроводящий полимерный слой, для чего используется эквимолярная смесь додецилбензосульфоната натрия и мономера пиррола, наносящаяся на подложку и поляризуемая электрохимически при значении тока 2 мА в течение 60 с. Затем на полученную поверхность электрода осуществляется иммобилизация холестерол оксидазы из водного раствора фермента и гексацианоферрата (III) калия в фосфатном буфере. После чего полученная поверхность тщательно высушивается на воздухе при комнатной температуре в течение 12 ч. Предел обнаружения для данного способа составляет 0,5 ммоль/дм³.

Недостатками данного способа являются: сложный процесс подготовки рабочего электрода и анализа, и, как следствие, высокие временные затраты на проведение анализа; а также использование в аналитической системе ферментов, склонных к денатурации, что осложняет процесс получения точного аналитического сигнала, и негативно влияет на его воспроизводимость; также для формирования электродной поверхности рабочего электрода используются токсичные реактивы, что повышает уровень опасности при работе; при этом в данном способе аналитический сигнал получается косвенный от пероксида водорода, а не от холестерина.

Задачей заявляемого вольтамперометрического способа определения содержания общего холестерина в биологических объектах является упрощение подготовки рабочего электрода и сокращение общего времени, затрачиваемого на проведение анализа, а также получение точного аналитического сигнала непосредственно от холестерина с низким пределом обнаружения.

Поставленная задача достигается за счет использования индикаторного углеродсодержащего электрода, состоящего из смеси графита и полиэтилена высокого давления, запрессованного в корпус из полиэтилена, рабочая поверхность которого поляризуется в диапазоне потенциалов от -2 В до 2 В в фосфатном буфере в течение 67 с. После чего поверхность индикаторного углеродсодержащего электрода промывается дистиллированной водой и удаляются излишки жидкости при помощи фильтровальной бумаги. Затем индикаторный углеродсодержащий электрод помещается в насыщенный (концентрация составляет 1 моль/дм³) раствор 2,6-диацетил-N-2,4,6,8-тетраазабицикло[3.3.0]октан-3,7-дион-дифосфоновой кислоты, и на электрод налагается потенциал -1.2 В в течение 60 с, полученный модифицированный электрод высушивается при температуре 40°С в течение 1800 с, таким образом получается модифицированный индикаторный углеродсодержащий электрод. Для проведения анализа подготовленный модифицированный индикаторный углеродсодержащий электрод помещается в трехэлектродную ячейку с фосфатным буферным раствором рН 6.86, где расположены сравнительный и вспомогательный хлорид-серебряные электроды, при этом каждый электрод ячейки подключается к вольтамперометрическому анализатору. Далее, в трехэлектродную ячейку с фосфатным буферным раствором рН 6.86, состоящую из модифицированного индикаторного углеродсодержащего электрода, хлорид-серебряных сравнительного и вспомогательного электродов, помещается пробоподготовленная сыворотка крови человека, после чего к электродам трехэлектродной ячейки: модифицированному индикаторному углеродсодержащему, хлорид-серебряным электродам сравнения и вспомогательному одновременно прикладывается потенциал со ступенчатой формой развертки в диапазоне от +0.32 В до +1.52 В со скоростью развертки 0.05 В/с, в результате чего происходит электролиз и регистрация вольтамперометрическим анализатором зависимостей тока, получаемого от каждого из указанных электродов. Полученные зависимости электроокисления холестерина от налагаемого на каждый электрод трехэлектродной ячейки потенциала проводят расчет концентрации холестерина в образце по градуировочному графику.

Пример реализации

Для получения модифицированного индикаторного углеродсодержащего электрода, состоящего из смеси графита и полиэтилена высокого давления, запрессованного в корпус из полиэтилена, производят поляризацию рабочей поверхности в диапазоне потенциалов от -2 В до 2 В в фосфатном буфере в течение 67 с. После чего поверхность индикаторного углеродсодержащего электрода промывается дистиллированной водой и удаляются излишки жидкости при помощи фильтровальной бумаги. Затем индикаторный углеродсодержащий электрод помещается в насыщенный раствор (концентрация составляет 1 моль/дм³) 2,6-диацетил-N-2,4,6,8-тетраазабицикло[3.3.0]октан-3,7-дион-дифосфоновой кислоты, и на электрод налагается потенциал -1.2 В в течение 60, полученный модифицированный электрод высушивается при температуре 40°С в течение 1800 с.

Для определения содержания холестерина соединений в сыворотке крови здоровых людей и больных сердечно-сосудистыми заболеваниями отбирают кровь из локтевой вены. Донорами «контрольной» группы являются 10 здоровых людей в возрасте до 40 лет мужского пола и 10 здоровых людей в возрасте до 40 лет женского пола. Группа «патология» включает 10 здоровых людей в возрасте до 40 лет мужского пола (без видимых патологий) и 10 здоровых людей в возрасте до 40 лет женского пола с диагнозом - гиперхолестеренимия средней степени. Забор крови проводится однократно. Венозную кровь, полученную без антикоагулянтов, помещают в центрифужную стеклянную пробирку и отстаивают при комнатной температуре в течение 30 мин до полного образования сгустка. По окончании образования сгустка с помощью тонкой стеклянной палочки проводят отделение столбика сгустка от стенок пробирки. Сыворотку сливают в чистую пробирку, которую центрифугируют в настольной лабораторной центрифуге в течение 10 мин при скорости вращения 2000 об/мин. После центрифугирования образцов производят отбор сыворотки в пробирки Эппендорф и маркировку образца. Центрифугат отбирается в объеме 1.0-1.5 см³ для дальнейшего исследования. Затем полученный центрифугат смешивается с изопропанолом (в соотношении 1:1 по объему) в пробирках типа Эппендорф и центрифугируется в настольной центрифуге при 2000 об/мин. После чего 500 мкл полученного супернатанта отбирают дозатором в чистую пробирку типа Эппендорф, объемом 1 мл. В ту же пробирку вносят 500 мкл TritonX-100 (n-(1,1,3,3-тетраметилбутирил)фенил)-поли(оксиэтилен)). Тщательно перемешивают с применением мешалки Vortex.

Далее в трехэлектродной ячейке размещается модифицированный индикаторный углеродсодержащий электрод и насыщенные хлорид-серебряные электроды, используемые в качестве электрода сравнения и вспомогательного электрода, при этом указанные электроды подключают к вольтамперометрическому анализатору (TA-Lab, ООО «Томьаналит», Томск), и, используя дифференциальный режим анодной вольтамперометрии со ступенчатой формой развертки, к электродам прикладывается потенциал со скоростью развертки потенциала 0.05 В/с, рабочий диапазон потенциалов от +0.32 В до +1.52 В. После чего производится регистрация фоновой анодной вольтамперограммы. Затем в трехэлектродную ячейку с фосфатным буферным раствором с рН 6.86, состоящую из модифицированного индикаторного углеродсодержащего электрода, хлорид-серебряных сравнительного и вспомогательного электродов вносят аликвоту (1 мкл) подготовленной сыворотки крови, и снимают вольтамперограмму при дифференциальном режиме со ступенчатой формой развертки, со скоростью развертки потенциала 0.05 В/с, рабочий диапазон потенциалов от +0.32 В до +1.52 В, где в указанном диапазоне потенциалов производится регистрация анодного пика при потенциале +1.06 В для последующего определения содержания холестерина в сыворотке крови методом градуировочного графика.

На фиг. 1 представлены вольтамперограммы окисления стандартного раствора холестерина от его концентрации в электрохимической ячейке: фоновая кривая в отсутствие (1) и в присутствии стандартного раствора холестерина 1⋅10^-6 моль/дм³ (2), 2⋅10^-6 моль/дм³ (3), 4⋅10^-6 моль/дм³ (4).

На фиг. 2 представлена градуировочная зависимость тока окисления стандартного раствора холестерина от его концентрации в электрохимической ячейке (с коэффициентом корреляции градуировочной зависимости 0.999).

В таблице 1 показано, что количество содержания холестерина в сыворотке крови здоровых людей варьируется в интервале 3,6-5,2 ммоль/дм³, что значительно ниже, чем у больных, страдающих гиперхолестеринемией.