Результат интеллектуальной деятельности: Способ прогнозирования транслокации E.coli из кишечника при некультивируемом типе инфекционного процесса в эксперименте на кроликах

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к патофизиологии и может быть использовано для выявления развития патогенетических механизмов транслокации, вызванных некультивируемыми бактериями, с целью экстраполяции полученных данных для разработки способов лечения и снижения летальности у людей, вызванных некультивируемыми бактериями.

В основе транслокации лежит способность бактерий проникать во внутренние органы из желудочно-кишечного тракта. [Berg R.D. Bacterial translocation from the intestines // Jikken Dobutsu, 1985, Jan., 34(1), 1-16] и вызывать сепсис [Несвижский Ю.В., Богданова Е.А., Зверев В.В. Колонизация Staphylococcus aureus биотопов желудочно-кишечного тракта крыс // Вестник РАМН, 2009, №4, с. 28-30; Бондаренко В.М., Рябиченко Е.В. Роль дисфункции кишечного барьера в поддержании хронического воспалительного процесса различной локализации // Ж. микробиол., 2010, 1, 92-100].

Причины возникновения транслокации изучены недостаточно. Транслокация возникает при снижении иммунитета организма, при кишечной непроходимости [Пашков С.А., Плечев В.В., Мурысева Е.М. Интраперитонеальная транслокация бактерий и антибиотикотерапия при острой спаечной кишечной непроходимости // Казанский медицинский журнал, 2004, т. 85, №5, с. 346-350; Салато О.В. Исследование транслокации бактерий при механической непроходимости тонкой кишки // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН, 2008, №4(62), с. 76-79], при стрессовых ситуациях, ожогах, радиационных поражениях [Павлович Е.Р., Дугин С.Ф. Патофизиологическое значение трансинтестинальной транслокации бактерий // Успехи современного естествознания, 2006, №6, с. 81-82].

Известна бактериальная транслокация при хирургических инфекциях [Апарцин К.А., Лишманов Ю.Б., Галеев Ю.М. и др. Бактериальная транслокация при релапаротомии в условиях распространенного перитонита // Бюллетень СО РАМН, 2009, №2(136), с. 95-100; Шестаков А.И., Хафизов А.Р. К вопросу о транслокации бактерий в хирургии аорты // Вестник Башкирского университета, 2006, №2, с. 70-73; Тарасенко B.C., Никитенко В.И., Кубышкин В.А. Острый панкреатит и транслокация бактерий. // Вестн. хирургии им. И.И. Грекова. 2000, - Т. 159, №6. - С. 86-88].

На механизм транслокации оказывает влияние не только макроорганизм, но свойства микроорганизмов. Под влиянием эндотоксина бактерий происходит транслокация микрофлоры кишечника во внутренние органы [Домарадский И.В., Хохоев Т.Х., Кондракова О.А. и др. Противоречивая микроэкология // Рос. хим. журн. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева), 2002, т. XLVI, №3, с. 80-89].

Однако влияние некультивируемых бактерий на механизм развития транслокации при инфекционных заболеваниях в периодической патентной и научно-технической литературе не описано. Хотя, известно широкое распространение некультивируемых бактерий в популяциях патогенных и условно-патогенных микроорганизмов [Соколенко А.В., Шаманская Е.П. Некультивируемые формы патогенных бактерий и здоровье человека // Валеология. - 2008. - №2. - С. 10-20; Козлов Л.Б., Диц Е.В. Роль микробных ассоциаций в инфекционной патологии человека // Фундаментальные исследования, 2013. - №9. - С. 366-370; Соколенко А.В. Некультивируемые формы бактерий: распространение в природе, индукторы некультивируемого состояния и реверсии // Современные наукоемкие технологии. - 2006. - №2 - С. 11-15; Heim S. Et al. The viable but nonculturable state and starvation are different stress responses of Enterococcus faecalis, as determined by proteome analysis // J. Bacteriol. - 2002. - Vol. 184. - №23. - P. 6739-6745].

Поэтому прогнозирование транслокации микрофлоры из кишечника под влиянием некультивируемых бактерий, а также создание экспериментальной модели по изучению влияния некультивируемых бактерий на патогенетические механизмы развития транслокации является актуальным в плане создания эффективного лечения и снижения летальности при инфекционных процессах, вызванных некультивируемыми бактериями.

В патентной литературе описан способ выделения некультивируемых бактерий [патент RU №2470074 от 20.12.2012 г. Бюл. №35].

Описан способ предупреждения транслокации условно-патогенной микрофлоры кишечника животных (беспородные белые крысы) при стрессовом воздействии в эксперименте, при использовании биологически активной добавки «Ультрасорб» [патент RU №2410101 С1 от 27.01.2011]. Для подтверждения транслокации бактерий в организме животных авторы использовали сложные гистологические исследования.

Для профилактики транслокации предложен штамм Lactobacillus plantarum [патент RU №2521364 С2 от 27.06.2014]. Изобретение относится к области промышленной микробиологии и за счет увеличения бактериального разнообразия повышена эффективность профилактического действия препарата и снижена возможность транслокации бактерий из желудочно-кишечного тракта, но не устраняются основные причины и механизмы транслокации бактерий.

В предложенных выше двух технических решениях не предусмотрено устранение причин транслокации вызванных некультивируемыми бактериями, постоянно присутствующих в популяциях патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

В качестве прототипа нами выбран способ прогнозирования транслокации бактерий в кровь при генерализованном хроническом пародонтите [патент RU №2472858 С2 от 20.01.2013]. Транслокация бактерий прогнозирована по усилению гемолитической активности, антилизоцимной активности и росту в отношении других штаммов симбионтов. Штамм - симбионт, обладающий этими свойствами обладает способностью транслоцировать в кровь. Предложена сложная микробиологическая методика выявления транслокации бактерий, включающая выделение чистой культуры бактерий из крови и со слизистых оболочек пародонтальных карманов, идентификацию бактерий до вида и сравнение выделенных культур по типу антибиотикограмм. Предложенный способ не позволяет выявить транслокацию, вызванную некультивируемыми бактериями и представляется сложным проследить эффективность химиотерапевтического лечения при выявленной транслокации (необходимы дополнительные лабораторные исследования по изучению влияния предложенного химиотерапевтического препарата на культивируемый микроорганизм вызывающий транслокацию). Предложенный способ не позволяет выявить патогенетический механизм развития транс локации, вызванной некультивируемыми бактериями.

Задачей настоящего изобретения является установить достоверное прогнозирование транслокации, вызванной некультивируемыми бактериями в экспериментальной модели, с целью изучения патогенетического механизма развития транслокации, вызванной некультивируемыми бактериями.

Результаты проведенных экспериментальных исследований позволят экстраполировать полученные данные для разработки эффективного лечения и предупреждения летальности у людей вызванных некультивируемыми бактериями в процессе транслокации.

Технический результат заявленного нами способа заключается в использовании биохимических тестов для прогноза возникновения транслокации, вызванной наличием в микробных популяциях некультивируемых бактерий.

Для достижения данного технического результата необходима экспериментальная модель транслокации на лабораторных животных, вызванной некультивируемыми бактериями. Для этих целей использованы кролики породы «шиншилла», инфицированные некультивируемыми бактериями P. aeruginosa, S. aureus.

Технический результат - простой, не требующий больших материальных затрат и основан на исследовании сывороток крови кроликов в первые 5 дней болезни на наличие биохимических показателей: аланинаминотрансферазы (АЛТ) и концентрации мочевины.

Технический результат предложенного способа достигается тем, что способ прогнозирования транслокации E. coli из кишечника, вызванной некультивируемыми бактериями, в эксперименте, заключается в том, что проводят заражение кроликов с использованием взвеси некультивируемых бактерий P. aeruginosa и S. aureus в концентрациях 10⁵-10⁶ микробных клеток в 1 мл на физиологическом растворе хлорида натрия, который вводят подкожно, затем на 1-2 и 4-5 сутки исследуют АЛТ и мочевину в сыворотке крови и при показателе АЛТ на 1-2 сутки, равном 53,0-63,0 u/L, а 4-5 сутки - 57,0-69,0 u/L и показателе концентрации мочевины на 1-2 сутки, равном 4,6-5,6 u/L, а на 4-5 сутки - 1,3-1,9 u/L прогнозируют развитие транслокации E. coli из кишечника во внутренние органы животного.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образам.

Здоровых кроликов породы «шиншилла» массой 2500-3500 грамм содержат в клетках в соответствии с требованиями санитарных правил (утв. Главным Государственным санитарным врачом №1045-73). В виварии поддерживают температуру воздуха 24-26°С в соответствии с приказом МЗ РФ №267 от 19.06.2003 и требованиями Европейской конвенции (Страсбург, 1986) по содержанию, кормлению и уходу за подопытными животными, выводу их из эксперимента и последующей утилизации.

Для заражения кроликов использовали взвесь некультивируемых бактерий P. aeruginosa и S. aureus в концентрациях 10⁵-10⁶ микробных клеток в 1 мл на физиологическом растворе хлорида натрия, а затем вводили кроликам подкожно в объеме 1,0 мл смеси. Некультивируемые бактерии получали по методике предложенной Л.Б. Козловым с соавт. [патент RU №2470074 от 20.12.2012 г. Бюл. №35].

На 1-2 и 4-5 сутки после заражения кроликов некультивируемыми бактериями проводили биохимическое исследование сывороток крови на наличие АЛТ и мочевины. Биохимические исследования проводили на автоматическом биохимическом анализаторе BS 200 (Mindray) с использованием коммерческих наборов реактивов. При показателе АЛТ в сыворотке крови животных на 1-2 сутки болезни кроликов 53,0-63,0 u/L, а 4-5 сутки - 57,0-69,0 u/L и показателе концентрации мочевины на 1-2 сутки 4,6-5,6 u/L, а на 4-5 сутки - 1,3-1,9 u/L прогнозировали развитие транслокации, вызванной некультивируемыми бактериями.

Наличие транслокации, вызванной некультивируемыми бактериями, определяют бактериологическим методом. Животных вскрывают на 7-9 сутки после инфицирования некультивируемыми бактериями и определяют наличие, а также концентрацию E. coli в легких, печени и почках, используя общепринятые микробиологические методики [Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. - М.: Медицина, 1982, 462 с.].

Для изучения микробной обсемененности внутренних органов экспериментальных животных использован метод определения "бактерийного индекса" селезенки. После извлечения органа в асептических условиях, его взвешивали на торсионных весах. На каждые 100 мг веса органа прибавляют 1 мл стерильного изотонического раствора NaCL и в стерильной ступке путем растирания получают основную взвесь исследуемой ткани органа. Затем из основной взвеси делают ряд последовательных десятикратных разведений и 0,1 мл каждого разведения высевают на элективную питательную среду для выделения E. coli. Через 24 часа инкубации в термостате при 37°С подсчитывают количество колоний.

Примеры практического использования предлагаемого способа:

Пример 1.

Здорового кролика породы «шиншилла» массой 2800 грамм содержали в клетке в соответствии с требованиями санитарных правил (утв. Главным Государственным санитарным врачом №1045-73). В виварии поддерживали температуру воздуха 24-26°С в соответствии с приказом МЗ РФ №267 от 19.06.2003 и требованиями Европейской конвенции (Страсбург, 1986) по содержанию, кормлению и уходу за подопытными животными, выводу их из эксперимента и последующей утилизации.

Для заражения кролика использовали смесь взвеси некультивируемых бактерий P. aeruginosa и S. aureus в концентрациях 10⁵ микробных клеток в количестве 1 мл на физиологическом растворе хлорида натрия, а затем вводили кролику подкожно в объеме 1,0 мл. Некультивируемые бактерии получали по методике предложенной Л.Б. Козловым с соавт. [патент RU №2470074 от 20.12.2012 г. Бюл. №35].

Через сутки и четверо суток после заражения кролика некультивируемыми бактериями проводили биохимические исследования сывороток крови на наличие АЛТ и мочевины. Показатель АЛТ в сыворотке крови животных через сутки болезни составил 53 u/L, а на 4-е сутки - 57 u/L и показатель концентрации мочевины через сутки составил 4,7 u/L, а на 4-е сутки - 1,4 u/L. На основании полученных результатов биохимических исследований сывороток крови животного прогнозировано развитие транслокации, вызванной некультивируемыми бактериями.

Биохимические исследования проводили на автоматическом биохимическом анализаторе BS 200 (Mindray) с использованием коммерческих наборов реактивов.

Для подтверждения возникновения транслокации E. coli во внутренние органы использовали клинические наблюдения за кроликом, результаты микробиологических исследований внутренних органов и проводили анализ изменений в тканях органов на основании гистологических срезов, полученных после вскрытия животного. Животного вскрыли на 9-е сутки после инфицирования некультивируемыми бактериями и определяли концентрацию E. coli в легких, печени и почках, используя общепринятые микробиологические методики [Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. - М.: Медицина, 1982, 462 с.].

Для изучения микробной обсемененности внутренних органов экспериментального животного использовали метод определения "бактерийного индекса" селезенки. После извлечения органа в асептических условиях, его взвешивали на торсионных весах. На каждые 100 мг веса органа добавляли 1 мл стерильного изотонического раствора NaCL и в стерильной ступке путем растирания получали основную взвесь исследуемой ткани органа. Затем из основной взвеси делали ряд последовательных десятикратных разведений и 0,1 мл каждого разведения высевали на плотную элективную питательную среду для выделения E. coli и учета изолированных колоний E. coli. Через 24 часа инкубации в термостате при 37°С подсчитывали количество выросших колоний.

На 9 день инфекционного процесса концентрация E. coli в легких животного составила 1,0×10³ микробных клеток в 1 грамме исследуемой ткани, в печени - 9,0×10² и в почках - 1,0×10³ микробных клеток (даны средние данные по результатам трех исследований органа).

Результаты клинического наблюдения за животным.

На 5-е сутки болезни кролик отказался от еды, а затем на 6-е сутки отмечено вздутие живота и отсутствие перистальтики кишечника.

Результаты гистологических исследований органов.

В динамике развивалась очаговая инфильтрация печени. Диагноз: Очаговый септический гепатит.

В легких отмечалось расширение альвеолл с разрывами межальвеолярных перегородок, утолщение единичных межальвеолярных перегородок за счет воспалительной инфильтрации. Диагноз: Острая инфекционная эмфизема легких.

В почках выявлено полнокровие, в просветах сосудов эритростазы, умеренно выраженная белковая дистрофия эпителия извитых канальцев нефрона с десквамацией эпителия. Капсулы клубочков тонкие, несколько отечные. Сосуды единичных клубочков содержат фибриновые тромбы. Диагноз: Морфологические признаки шока.

Пример 2.

Здорового кролика породы «шиншилла» массой 3200 грамм содержали в клетке в соответствии с требованиями санитарных правил (утв. Главным Государственным санитарным врачом №1045-73). В виварии поддерживали температуру воздуха 24-26°С в соответствии с приказом МЗ РФ №267 от 19.06.2003 и требованиями Европейской конвенции (Страсбург, 1986) по содержанию, кормлению и уходу за подопытными животными, выводу их из эксперимента и последующей утилизации.

Для заражения кролика использовали смесь взвеси некультивируемых бактерий P. aeruginosa и S. aureus в концентрациях 10⁶ микробных клеток в 1 мл на физиологическом растворе хлорида натрия, а затем вводили кролику подкожно в объеме 1,0 мл. Некультивируемые бактерии получали по методике предложенной Л.Б. Козловым с соавт. [патент RU №2470074 от 20.12.2012 г. Бюл. №35].

На 2-е и 5-е сутки после заражения кролика некультивируемыми бактериями проводили биохимические исследования сывороток крови на наличие АЛТ и мочевины. Показатель АЛТ в сыворотке крови животного на 2-е сутки болезни составил 60 u/L, а на 5-е сутки - 68 u/L и показатель концентрации мочевины на 2-е сутки 5,3 u/L, а на 5-е сутки - 1,8 u/L. На основании полученных результатов биохимических исследований сывороток крови животного прогнозировано развитие транслокации, вызванной некультивируемыми бактериями.

Биохимические исследования проводили на автоматическом биохимическом анализаторе BS 200 (Mindray) с использованием коммерческих наборов реактивов.

Для подтверждения возникновения транслокации E. coli во внутренние органы использовали клинические наблюдения за кроликом, результаты микробиологических исследований внутренних органов и проводили анализ изменений в тканях органов на основании гистологических срезов, полученных после вскрытия животного. Животного вскрыли на 9-е сутки после инфицирования некультивируемыми бактериями и определяли концентрацию E. coli в легких, печени и почках, используя общепринятые микробиологические методики [Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. - М.: Медицина, 1982, 462 с.].

Для изучения микробной обсемененности внутренних органов экспериментального животного использовали метод определения "бактерийного индекса" селезенки. После извлечения органа в асептических условиях, его взвешивали на торсионных весах. На каждые 100 мг веса органа добавляли 1 мл стерильного изотонического раствора NaCL и в стерильной ступке путем растирания получали основную взвесь исследуемой ткани органа. Затем из основной взвеси делали ряд последовательных десятикратных разведений и 0,1 мл каждого разведения высевали на плотную элективную питательную среду для выделения E. coli и учета изолированных колоний E. coli. Через 24 часа инкубации в термостате при 37°С подсчитывали количество колоний E. coli.

На 9 день инфекционного процесса концентрация E. coli в легких животного составила 1,0×10³ микробных клеток в 1 грамме исследуемой ткани, в печени - 9,0×10² и в почках - 5,0×10² микробных клеток (даны средние данные по результатам трех исследований органа).

Результаты клинического наблюдения за животным.

На 5-е сутки болезни кролик отказался от еды, а затем на 7-е сутки отмечено вздутие живота и отсутствие перистальтики кишечника. На 8-е сутки животное погибло.

Результаты гистологических исследований органов.

В тканях печени наблюдался мостовидный некроз, распространяющийся между соседними портальными трактами, а также ступенчатый некроз, с распространением к центру дольки. Диагноз: Острый серозно-гнойный септический гепатит.

В легких на основании гистологических срезов ткани легкого поставлен диагноз: Острая инфекционная эмфизема легких.

В почках выявлены аутоиммунные поражения (по типу системных заболеваний соединительной ткани. Наблюдается острое течение патологического процесса.

Проведенные результаты исследований подтверждают, что на основании биохимических исследований сывороток крови животного (показатели АЛТ и мочевина) можно прогнозировать развитие транслокации E. coli во внутренние органы животных.

Были проведены следующие исследования: Здоровых кроликов породы «шиншилла» массой 2500-3500 грамм инфицировали культивируемыми и некультивируемыми бактериями P. aeruginosa и S. aureus. С 1 по 9 сутки у животных брали кровь и проводили биохимические исследования сывороток крови. Определяли наличие щелочной фосфатазы (ЩФ), АЛТ, мочевины, креатинина и общего биллирубина. Наличие транслокации E. coli у животных было подтверждено клиническими наблюдениями за животными, микробиологическими и гистологическими исследованиями. Результаты исследований представлены в таблице.

Предложенный способ прогнозирования транслокации E. coli из кишечника при некультивируемом типе инфекционного процесса в эксперименте на кроликах позволяет также осуществлять контроль за эффективностью лечения заболеваний вызванных культивируемыми и некультивируемыми бактериями. У больных кроликов при некультивируемом типе инфекционного процесса показатели щелочной фосфатазы в 3 раза выше, чем при инфекционном процессе, вызванным культивируемыми бактериями, а показатели АЛТ в 2 раза ниже. Эти показатели можно использовать при контроле эффективности проводимого лечения.

Предложенный способ легко воспроизводим, не требует больших материальных затрат, в ранние сроки позволяет прогнозировать транслокацию E. coli во внутренние органы. Результаты выявления патогенетических механизмов транслокации кишечной палочки в организме кроликов могут быть использованы для экстраполяции полученных данных с целью совершенствования диагностики и лечения больных людей с инфекционными процессами, вызванные культивируемыми и некультивируемыми бактериями.