26.08.2017
217.015.e768

НОВЫЕ МОДУЛЯТОРЫ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Свернуть Развернуть
№ охранного документа
0002627176
Дата охранного документа
03.08.2017
Краткое описание РИД Свернуть Развернуть
Аннотация: Изобретение относится к области биохимии. Заявлено антитело, специфически связывающееся с PTK7 (протеинтирозинкиназа 7) человека, а также конъюгат указанного антитела с цитотоксическим агентом. Также предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие указанное антитело, и включающие их экспрессионные векторы и клетки-хозяева. Кроме того, предложены способы применения указанного антитела, в том числе в составе конъюгата, для диагностики и лечения рака у субъекта. Изобретение обеспечивает эффективное нацеливание на опухолевые стволовые клетки, что может быть использовано для лечения пациентов, страдающих от широкого спектра злокачественных образований. 16 н. и 36 з.п. ф-лы, 42 ил., 5 табл., 16 пр.
Реферат Свернуть Развернуть

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА ЗАЯВКИ

В данной заявке заявлен приоритет предварительной заявки США 61/444614, поданной 18 февраля 2011 года и заявки PCT под номером PCT/US 2011/050451, поданной 2 сентября 2011 года, каждая из которых включена в данную заявку посредством ссылки во всей полноте.

Перечень последовательностей

Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был представлен в ASCII формате посредством EFS-Web и включен в данное описание посредством ссылки во всей полноте. Указанная копия ASCII, созданная 26 января, 2012, называется 112304PCT.txt и имеет размер 163049 байт.

Область изобретения

Данная заявка в целом относится к новым композициям и способам их применения в предупреждении, лечении или облегчении гиперпролиферативных расстройств и любого их распространения, повторного проявления, рецидива или метастазов. В широком аспекте настоящее изобретение относится к применению модуляторов протеинтирозинкиназы 7 (PTK7), включая анти-PTK7 антитела и слитые конструкции, для лечения или профилактики опухолевых заболеваний. В особенно предпочтительных воплощениях настоящего изобретения предложено применение таких модуляторов PTK7 для иммунотерапевтического лечения злокачественных образований, включающего снижение частоты появления опухоль-инициирующих клеток.

Предшествующий уровень техники

Дифференцировка стволовых клеток и клеток-предшественников, а также клеточная пролиферация являются нормальными непрерывными процессами, которые действуют совместно для поддержания роста тканей во время органогенеза, а также замены клеток и восстановления большинства тканей в течение жизни всех живых организмов. Решения о дифференцировке и пролиферации часто контролируется многочисленными факторами и сигналами, которые уравновешены так, чтобы поддерживать решения относительно судьбы клеток и архитектуры тканей. Нормальная архитектура ткани в основном сохраняется клетками в ответ на сигналы микроокружения, которые регулируют деление клеток и созревание тканей. Соответственно, клеточная пролиферация и дифференцировка обычно происходит только по мере необходимости для замены поврежденных или умирающих клеток или для роста. К сожалению, нарушение клеточной пролиферации и/или дифференцировки может быть результатом множества факторов, в том числе, например, недостатка или избытка различных химических агентов, участвующих в передаче сигналов, наличия измененного микроокружения, генетических мутаций или любой их комбинации. Нарушение или какое-либо расстройство нормальной клеточной пролиферации и/или дифференцировки может привести к различным заболеваниям или расстройствам, в том числе к гиперпролиферативным расстройствам, таким как рак.

Обычные методы лечения рака включают химиотерапию, лучевую терапию, хирургию, иммунотерапию (например, модификаторы биологического ответа, вакцины или терапевтические средства направленного действия) или их комбинации. К сожалению, слишком многие виды рака не отвечают или минимально отвечают на такие традиционные методы лечения, предоставляя пациентам небольшой выбор. Например, у ряда больных в случае некоторых видов рака обнаруживаются генные мутации, которые делают их нечувствительными, несмотря на общую эффективность выбранной терапии. Кроме того, в зависимости от типа рака, некоторые доступные виды лечения, такие как хирургия, не могут являться реальной альтернативой. Ограничения, присущие существующим терапевтическим средствам, представляющим стандарт лечения, особенно очевидны при попытке лечить пациентов, прошедших предыдущее лечение и имеющих после этого рецидивы. В таких случаях безрезультатные схемы лечения и результирующее ухудшение состояния пациента может содействовать трудноизлечимым опухолям, которые часто проявляются, как относительно агрессивное заболевание, которое в конечном счете оказывается неизлечимым. Несмотря на большие успехи в диагностике и лечении рака на протяжении многих лет, уровень общей выживаемости для многих солидных опухолей остается в значительной степени неизменным из-за неспособности существующих методов лечения предотвратить рецидив, повторное проявление опухоли и метастазы. Таким образом, остается проблема разработки более целенаправленной и эффективной терапии.

Одно из перспективных направлений исследований включает использование терапевтических средств направленного действия для преследования онкогенных "затравочных" клеток, которые, по-видимому, лежат в основе многих видов рака. Исходя из этого, в настоящее время известно, что большинство твердых тканей содержит популяции взрослых, расположенных в тканях, стволовых клеток, образующих дифференцированные клеточные типы, которые составляют большую часть этой ткани. Опухоли, образующиеся в этих тканях, также состоят из гетерогенных популяций клеток, которые также возникают из стволовых клеток, но заметно отличаются по своей общей пролиферации и организации. Хотя все чаще признается, что большинство опухолевых клеток имеют ограниченную способность к пролиферации, меньшая часть популяции раковых клеток (общеизвестная как раковые стволовые клетки или CSC) обладает исключительной способностью активно самообновляться, тем самым наделяя опухоль присущей ей способностью к возобновлению. Более конкретно, гипотеза раковых стволовых клеток предполагает, что существует отдельная подгруппа клеток (то есть CSC) в каждой опухоли (приблизительно 0,1-10%), которая способна неограниченно самообновляться и образовывать опухолевые клетки с постепенным ограничением их репликативной способности в результате дифференцировки в клетки-предшественники опухоли и затем в окончательно дифференцированные опухолевые клетки.

В последние годы становится все более очевидным, что эти CSC (также известные как клетки, поддерживающие опухоль, или TPC) могут быть более резистентными к традиционным химиотерапевтическим агентам или облучению и, таким образом, сохраняться после стандартного клинического лечения, чтобы позже поддерживать рост трудноизлечимых опухолей, вторичных опухолей и содействовать образованию метастазов. В этом отношении раковые стволовые клетки вовлечены в стимулирование миграционного и инвазивного потенциала различных неоплазий. Кроме того, растущие доказательства свидетельствуют о том, что пути, регулирующие органогенез и/или самообновление расположенных в нормальных тканях стволовых клеток, разрегулированы или изменены в CSC, что приводит к непрерывному увеличению количества самообновляющихся раковых клеток и к образованию опухоли. См. в целом AI-Hajj et al., 2004, PMID: 15378087; и Dalerba et al., 2007, PMID: 17548814; каждый из которых включен в настоящее описание во всей полноте посредством ссылки. Таким образом, эффективность традиционных, а также более современных методов лечения посредством направленной доставки, по-видимому, ограничена существованием и/или появлением резистентных раковых клеток, которые способны поддерживать рак, даже вопреки этим разнообразным методам лечения. Huff et al., European Journal of Cancer 42: 1293-1297 (2006) и Zhou et al., Nature Reviews Drug Discovery 8: 806-823 (2009), каждый из которых включен в настоящее описание во всей полноте посредством ссылки. Такие наблюдения подтверждены устойчивой неспособностью традиционных циторедуктивных агентов существенно увеличивать выживаемость пациентов, страдающих от солидных опухолей, а также развитием более тонкого понимания того, как опухоли растут, рецидивируют и метастазируют. Соответственно, в современных стратегиях лечения опухолевых заболеваний признается важность ликвидации, уменьшения, подавления или стимуляции дифференцировки клеток, поддерживающих опухоль, с тем чтобы уменьшить возможность повторного проявления опухоли, метастазов или рецидивов у пациента.

Усилия по разработке таких стратегий включают последние работы с использованием нетрадиционных ксенотрансплантатных (NTX) моделей, в которых образцы первичных человеческих солидных опухолей имплантировали и пассировали исключительно мышам с ослабленным иммунитетом. Такие способы подтверждают существование субпопуляции клеток с уникальной способностью образовывать гетерогенные опухоли и поддерживать их рост в течение неопределенного времени при многих видах раковых заболеваний. Как ранее предполагалось, работа на NTX-моделях подтверждает, что идентифицированные CSC-субпопуляции опухолевых клеток являются более резистентными к циторедуктивным схемам лечения, таким как химиотерапия и лучевая терапия, что может объяснить несоответствие между показателями клинического ответа и общей выживаемостью. Кроме того, применение NTX-моделей в исследовании CSC вызвало фундаментальное изменение в разработке лекарственных средств и в доклинической оценке кандидатов в лекарственные средства, которое может привести к CSC-нацеленной терапии, оказывающей существенное воздействие на повторное проявление опухоли и метастазирование, тем самым повышая выживаемость пациентов. Несмотря на прогресс, главными проблемами являются имеющиеся технические трудности, связанные с обработкой первичной и/или ксенотрансплантатной опухолевой ткани, наряду с отсутствием экспериментальных оснований для характеристики отличительных особенностей CSC и способности к дифференцировке. Таким образом, по-прежнему сохраняется существенная потребность в селективном нацеливании на раковые стволовые клетки и разработке диагностических, профилактических или терапевтических соединений и методов, которые можно использовать в лечении, предупреждении и/или контролировании гиперпролиферативных расстройств.

Краткое изложение сущности изобретения

Эти и другие цели предусмотрены настоящим изобретением, которое в широком смысле относится к способам, соединениям, композициям и изделиям, которые можно использовать в лечении PTK7-ассоциированных расстройств (например, гиперпролиферативных расстройств или опухолевых заболеваний). В связи с этим в настоящем изобретении предлагаются новые модуляторы протеинтирозинкиназы (PTK7), которые эффективно нацеливаются на опухолевые или раковые стволовые клетки и могут быть использованы для лечения пациентов, страдающих от широкого спектра злокачественных образований. Как будет обсуждаться более подробно ниже, в настоящее время имеется семь известных изоформ PTK7 и раскрытые модуляторы предпочтительно содержат один или более из них или ассоциированы с одним или более из них. Кроме того, в некоторых воплощения раскрытые модуляторы PTK7 могут содержать любое соединение, которое распознает, конкурирует, является агонистом, является антагонистом, взаимодействует, связывается или соединяется с полипептидом PTK7 или его геном (или их фрагментом) и модулирует, регулирует, изменяет, меняет или модифицирует воздействие белка PTK7 на один или более физиологических путей. Таким образом, в широком смысле настоящее изобретение относится к выделенным модуляторам PTK7 и их применению. В предпочтительных воплощениях изобретение более конкретно относится к выделенным модуляторам PTK7, содержащим антитела (то есть антитела, которые иммунологически предпочтительно связываются, реагируют или ассоциируют по меньшей мере с одной изоформой PTK7). Кроме того, как подробно рассмотрено ниже, такие модуляторы могут быть использованы для получения фармацевтических композиций, полезных для профилактики, диагностики или лечения пролиферативных расстройств.

В отдельных воплощениях изобретения модуляторы PTK7 могут содержать полипептид PTK7 или его фрагмент либо в выделенной форме, либо слитым, либо соединенным с другими группировками (например, Fc-PTK7, PEG-PTK7 или PTK7, соединенный с группировкой, обеспечивающей направленную доставку). В других выбранных воплощениях модуляторы PTK7 могут содержать антагонисты PTK7, которые в контексте настоящей заявки, означают любую конструкцию или соединение, которое распознает, конкурирует, взаимодействует, связывается или соединяется с PTK7 и нейтрализует, устраняет, уменьшает, сенсибилизирует, перепрограммирует, ингибирует или контролирует рост опухолевых клеток, в том числе опухоль-инициирующих клеток. В предпочтительных воплощениях модуляторы PTK7 по настоящему изобретению содержат анти-PTK7 антитела, или их фрагменты, или их производные, которые, как было неожиданно обнаружено, останавливают, нейтрализуют, снижают, уменьшают, истощают, сдерживают, ослабляют, перепрограммируют, устраняют или иным способом ингибируют способность опухоль-инициирующих клеток размножаться, сохраняться, распространяться, пролиферировать или другим способом содействовать выживанию, повторному проявлению, регенерации и/или метастазированию опухолевых клеток. В особенно предпочтительных воплощениях антитела или иммунореактивные фрагменты могут быть соединены или конъюгированы с одним или более противораковыми агентами (например, с цитотоксическим агентом).

В отдельных воплощениях совместимые модуляторы PTK7 могут содержать антитело, имеющее вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, где указанная вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 60%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58 и SEQ ID NO: 60 и, где указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 60%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59 и SEQ ID NO: 61.

Безусловно, с учетом настоящего описания специалисты в данной области могут легко идентифицировать CDR, связанные с каждой их вышеупомянутых вариабельных областей тяжелой и легкой цепи и использовать эти CDR для конструирования или изготовления химерных, гуманизированных или CDR-привитых антител без излишнего экспериментирования. Таким образом, в отдельных воплощениях настоящее изобретение относится к анти-PTK7 антителам, содержащим один или более CDR из последовательности вариабельной области, представленной на Фиг. 6А или Фиг. 6Б. В предпочтительных воплощениях такие антитела включают моноклональные антитела, а в более предпочтительных воплощениях включают химерные, CDR-привитые или гуманизированные антитела. Как описано более подробно ниже, другие воплощения включают антитела, конъюгированные или связанные с одним или более цитотоксическими агентами.

Соответственно, в других воплощениях настоящее изобретение включает гуманизированный модулятор PTK7, выбранный из группы, состоящей из hSC6.23, hSC6.24, hSC6.41 и hSC6.58. Другие воплощения относятся к модулятору PTK7, содержащему гуманизированное антитело, где указанное гуманизированное антитело включает вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, где указанная вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 60%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66 и SEQ ID NO: 68 и, где указанная вариабельная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 60%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67 и SEQ ID NO: 69.

Как было указано ранее, один аспект настоящего изобретения включает неожиданные ассоциации PTK7 полипептидов с раковыми стволовыми клетками. Таким образом, в некоторых других воплощениях изобретение относится к модулятору PTK7, который снижает частоту появления опухоль-инициирующих клеток при введении субъекту. Предпочтительно уменьшение частоты появления определяют, используя анализ методом серийных разведений in vitro или in vivo. В особенно предпочтительных воплощениях такой анализ может быть выполнен с использованием анализа методом серийных разведений in vivo, включающего трансплантацию живых опухолевых клеток человека мышам с ослабленным иммунитетом. Альтернативно, анализ методом серийных разведений может быть выполнен с использованием анализа методом серийных разведений in vitro, включающего посев живых опухолевых клеток человека in vitro методом серийных разведений в условиях, поддерживающих образование колоний. В любом случае анализ, вычисление или количественное определение снижения частоты появления предпочтительно включает использование статистических параметров распределения Пуассона для обеспечения точного подсчета. Следует иметь в виду, что, хотя такие количественные методы являются предпочтительными, другие, менее трудоемкие методы, такие как проточная цитометрия или иммуногистохимия, также могут быть использованы для получения нужных значений и, соответственно, явным образом рассматриваются как входящие в объем настоящего изобретения. В таких случаях снижение частоты появления можно определить, используя проточный цитометрический анализ или иммуногистохимическое обнаружение поверхностных маркеров опухолевых клеток, которыми, как известно, богаты опухоль-инициирующие клетки.

Таким образом, в другом предпочтительном воплощении настоящее изобретение включает способ лечения PTK7-ассоциированного расстройства, включающий введение терапевтически эффективного количества модулятора PTK7 нуждающемуся в этом субъекту, в результате чего снижается частота появления опухоль-инициирующих клеток. Предпочтительно PTK7-ассоциированное расстройство включает опухолевое расстройство. И опять снижение частоты появления опухоль-инициирующих клеток предпочтительно определяют, используя анализ методом серийных разведений in vitro или in vivo.

В связи с этим следует иметь в виду, что настоящее изобретение основано, по меньшей мере частично, на обнаружении того, что PTK7-иммуногены ассоциированы с клетками, поддерживающими опухоль, (то есть раковыми стволовыми клетками), которые вовлечены в этиологию различных неоплазий. Более конкретно, в настоящей заявке неожиданно продемонстрировано, что введение различных типичных модуляторов PTK7 может опосредовать, снижать, истощать, ингибировать или ликвидировать онкогенную передачу сигналов опухоль-инициирующими клетками (то есть снижать частоту появления опухоль-инициирующих клеток). Эта уменьшенная, либо посредством истощения, нейтрализации, уменьшения, удаления, перепрограммирования или подавления опухоль-инициирующих клеток, либо посредством изменения морфологии опухолевых клеток (например, индуцированной дифференцировки, разрушения ниши), передача сигнала в свою очередь обеспечивает возможность более эффективного лечения PTK7-ассоциированных расстройств посредством ингибирования онкогенеза, поддержания опухоли, увеличения объема и/или метастазирования и ее повторного появления.

Помимо вышеупомянутых ассоциаций с раковыми стволовыми клетками, есть свидетельства, что изоформы PTK7 могут быть вовлечены в ангиогенез, миграцию эндотелиальных клеток и развитие определенные сигнальные каскады развития, которые связаны с онкогенезом (то есть Wnt-пути передачи сигнала). Вмешательство в такие клеточные взаимодействия с использованием новых модуляторов PTK7, описанных здесь, может, таким образом, облегчить или лечить расстройство посредством более чем одного механизма (то есть уменьшения опухоль-инициирующих клеток и нарушения пути передачи онкогенного сигнала) с обеспечением аддитивного или синергичного эффектов. Также в других предпочтительных воплощениях можно использовать клеточную интернализацию PTK7 клеточной поверхности для доставки модулятор-опосредованного противоракового агента. В связи с этим, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено каким-либо конкретным механизмом действия, а охватывает широкое использование раскрытых модуляторов для лечения PTK7-ассоциированных расстройств (в том числе различных неоплазий).

В других аспектах настоящего изобретения используется способность раскрытых модуляторов потенциально разрушать пути онкогенного выживания с одновременным подавлением опухоль-инициирующих клеток. Такие мультиактивные модуляторы PTK7 (например, антагонисты PTK7) могут оказаться особенно эффективными при использовании в комбинации со стандартными противораковыми агентами или циторедуктивными агентами. Соответственно, предпочтительные воплощения настоящего изобретения включают использование раскрытых модуляторов в качестве антиметастатических агентов для поддерживающей терапии после первоначального лечения. Кроме того, два или более антагонистов PTK7 (например, антитела, которые специфически связываются с двумя отдельными эпитопами на PTK7) можно использовать в комбинации в соответствии с идеями настоящего изобретения. Кроме того, как обсуждается более подробно ниже, модуляторы PTK7 по настоящему изобретению по настоящему изобретению можно использовать в конъюгированном или неконъюгированном состоянии и возможно в качестве сенсибилизирующего агента в комбинации с различными химическими или биологическими противораковыми агентами.

Соответственно, другое предпочтительное воплощение настоящего изобретения включает способ сенсибилизации опухоли субъекта к лечению противораковым агентом, включающий стадию введения модулятора PTK7 указанному субъекту. Другие воплощения включают способ уменьшения метастазирования после лечения, включающий введение модулятора PTK7 нуждающемуся в этом субъекту. В особенно предпочтительном аспекте изобретения модулятор PTK7 конкретно приводит к снижению частоты появления опухоль-инициирующих клеток, определенной с использованием in vitro или in vivo анализа методом серийных разведений

В более общем случае предпочтительные воплощения изобретения включают способ лечения PTK7-ассоциированного расстройства у нуждающегося в этом субъекта, включающий стадию введения модулятора PTK7 этому субъекту. В особенно предпочтительных воплощениях модулятор PTK7 соединен (например, конъюгирован) с противораковым агентом. В других воплощениях модулятор PTK7 интернализуется после соединения или связывания с PTK7 на или около поверхности клетки. Кроме того, полезные аспекты настоящего изобретения, включающие любое нарушение путей передачи сигнала и сопутствующие преимущества, могут быть достигнуты независимо от того, демонстрирует опухолевая ткань субъекта повышенный уровень PTK7 или уменьшенные или сниженные уровни PTK7 по сравнению с нормальной прилегающей тканью.

В еще одном аспекте настоящее изобретение включает способ лечения субъекта, страдающего от опухолевого заболевания, включающий стадию введения терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного интернализованного модулятора PTK7. Предпочтительные воплощения включают введение интернализованных антительных модуляторов, где, в других выбранных воплощениях, интернализованные антительные модуляторы конъюгированы или соединены с цитотоксическим агентом.

Другие воплощения относятся к способу лечения субъекта, страдающего от PTK7-ассоциированного расстройства, включающему стадию введения терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного истощающего модулятора PTK7.

В другом воплощении в настоящем изобретении предлагаются способы поддерживающей терапии, в которых раскрытые эффекторы или модуляторы вводят в течение некоторого периода времени после начальной процедуры (например, химиотерапии, лучевой терапии или хирургического вмешательства), предназначенной для удаления по меньшей мере части опухолевой массы. Такие схемы лечения могут быть введены на протяжении недель, месяцев и даже лет, где модуляторы PTK7 могут действовать профилактически с целью ингибирования метастазирования и/или повторного появления опухоли. В других воплощениях раскрытые модуляторы можно вводить в соответствии с известными циторедуктивными схемами для предупреждения или замедления метастазирования, поддержания опухоли или ее повторного появления.

Кроме того, следует понимать, что модуляторы PTK7 по настоящему изобретению могут быть изготовлены или выбраны так, чтобы взаимодействовать с одной изоформой PTK7 или с несколькими выбранными изоформами (то есть полученными как варианты сплайсинга) белка или, напротив, могут содержать пан-модулятор PTK7, который взаимодействует или связывается с некоторыми или всеми изоформами PTK7 (в настоящее время идентифицировано пять изоформ). Более конкретно, как описано здесь, предпочтительные модуляторы, такие как антитела, могут быть получены и выбраны так, чтобы они взаимодействовали с доменами, представленными единичными вариантами сплайсинга (например, при конкретных соединениях экзонов) или с Ig-доменами, которые сохраняются у многих или у всех изоформ PTK7. Очень важно для настоящего изобретения, что определенные изоформы могут предпочтительно экспрессироваться на TIC и, следовательно, могут служить терапевтическими мишенями для обеспечения селективного снижения частоты появления онкогенных клеток и/или истощения популяций раковых стволовых клеток.

Соответственно, в выбранном воплощении изобретение включает пан-модулятор PTK7. В других отдельных воплощениях изобретение включает модулятор PTK7, который иммуноспецифически соединяется с одним или более вариантами сплайсинга или изоформами. Предпочтительно, варианты сплайсинга могут быть выбраны из группы, состоящей из изоформы a, изоформы b, изоформы с и изоформы d. В других воплощениях настоящее изобретение относится к способу лечения субъекта, нуждающегося в этом, включающему введение терапевтически эффективного количества пан-модулятора PTK7. Другие воплощения относятся к способу лечения субъекта, нуждающегося в этом, включающему введение терапевтически эффективного количества модулятора PTK7, который иммуноспецифически соединяется с одной или более изоформами.

Очевидно, что, помимо терапевтических применений, описанных выше, модуляторы по настоящему изобретению можно использовать для диагностики PTK7-ассоциированных расстройств и, в частности, гиперпролиферативных расстройств. В некоторых воплощениях модулятор можно вводить субъекту и определять или контролировать in vivo. Специалистам в данной области техники понятно, что такие модуляторы могут быть мечеными или соединенными с маркерами или репортерными группами, как описано ниже, и могут быть обнаружены с использованием любого из нескольких стандартных методов (например, MRI (визуализация методом ядерного магнитного резонанса), CAT (компьютерная томография) сканирование, PET (позитронно-эмиссионная томография) сканирование и т.д.).

В других случаях модуляторы можно использовать в диагностических установках in vitro с использованием принятых в данной области операций. Таким образом, предпочтительное воплощение включает способ диагностики гиперпролиферативного расстройства у субъекта, нуждающегося в этом, включающий стадии:

а. получение образца ткани из указанного субъекта;

б. приведение образца ткани в контакт по меньшей мере с одним модулятором PTK7; и

в. обнаружение или количественное определение модулятора PTK7, соединенного с образцом.

Такие способы могут быть легко поняты с учетом настоящей заявки и могут быть легко осуществлены с использованием общедоступной промышленной технологии, такой как автоматические планшет-ридеры, специально предназначенные репортерные системы и т.д. В выбранных воплощениях модулятор PTK7 соединен с клетками, поддерживающими опухоль, присутствующими в образце. В других предпочтительных воплощениях стадия обнаружения и количественного определения включает снижение частоты появления опухоль-инициирующих клеток и их обнаружение. Кроме того, анализ методом серийных разведений может быть проведен, как упоминалось выше, и предпочтительно с использованием статистических параметров распределения Пуассона для обеспечения точного подсчета снижения частоты появления.

Аналогично, в настоящем изобретении также предложены наборы, которые полезны в диагностике и контроле PTK7-ассоциированных расстройств, таких как рак. С этой целью в настоящем изобретении предпочтительно предложено изделие, полезное для диагностики или лечения PTK7-ассоциированных расстройств, содержащее контейнер, содержащий модулятор PTK7 и инструкции по применению указанного модулятора PTK7 для лечения или диагностики PTK7-ассоциированного расстройства.

В других предпочтительных воплощениях изобретения также используются свойства раскрытых модуляторов как инструмента, полезного для идентификации, выделения, разделения или обогащения популяций или субпопуляций опухоль-инициирующих клеток посредством таких методов, как проточный цитометрический анализ, сортировка флуоресцентно-активированных клеток (FACS) или лазерное отделение.

Таким образом, другое предпочтительное воплощение настоящего изобретения направлено на способ идентификации, выделения, разделения или обогащения популяции опухоль-инициирующих клеток, включающий стадию приведения указанных опухоль-инициирующих клеток в контакт с модулятором PTK7.

Вышеизложенное представляет собой краткое изложение сущности изобретения и, таким образом, содержит, по необходимости, упрощения, обобщения и опускания деталей; следовательно, специалистам в данной области техники будет понятно, что краткое изложение является лишь иллюстративным и не предназначено являться каким-либо ограничением. Другие аспекты, характеристики и преимущества способов, композиций и/или устройств и/или других объектов, описанных здесь, станут очевидными из изложенного здесь руководства. Краткое изложение представлено для того, чтобы изложить в упрощенной форме ряд концепций, которые дополнительно описаны ниже в Подробном описании изобретения. Это краткое изложение не предназначено для определения ключевых или существенных признаков заявленного изобретения и не предназначено для использования в качества помощи для определении объема заявленного изобретения

Краткое описание графических материалов

На Фиг. 1А-В показаны, соответственно, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий PTK7 (SEQ ID NO: 1), аминокислотная последовательность типичного варианта PTK7 человека (SEQ ID NO: 2), а на Фиг. 1В показаны выровненные и снабженные условными обозначениями последовательности четырех типичных изоформ PTK7 (SEQ ID NO: 3-6), где подчеркнутый участок на Фиг. 1А представляет собой открытую рамку считывания PTK7-1 открытая рамка считывания, подчеркнутый участок на Фиг. 1Б указывает внеклеточный домен PTK7, как определено здесь, а на Фиг. 1В показано белковое выравнивание четырех известных типичных изоформ белка PTK7 человека, как описано в базе данных генов NCBI (Национальный центр биотехнологической информации США) (учетные номера белков: изоформа a=NP_002812, изоформа b=NP_690619; изоформа c=NP_690620; изоформа d=NP_690621), где на Фиг. 1 В также раскрыты пептидные мотивы "GxGxFGxV," "HRDLxxxN" и "SDVWSxG" как SEQ ID NO: 11-13 соответственно.

На Фиг. 2 показаны графики, представляющие уровни экспрессии генов PTK7 у необработанных (-) и у обработанных иринотеканом (+) мышей при измерении с использованием секвенирования всей последовательности транскриптома популяций, значительно обогащенных клетками-предшественниками опухоли (TProg), и клетками, поддерживающими опухоль (TPC), и неонкогенными клетками (NTG), полученными из подгруппы всех образцов колоректальной опухоли.

На Фиг. 3 представлен график, показывающий относительные уровни генной экспрессии человеческого PTK7 в популяциях, значительно обогащенных клетками-предшественниками опухоли (TProg), и клетками, поддерживающими опухоль (TPC), полученных из мышей, несущих одну из четырех разных нетрадиционных ксенотрансплантатных (NTX) клеточных линий колоректальной опухоли или опухоли поджелудочной железы, и нормализированных относительно популяций, обогащенных неонкогенными клетками (NTG), при измерении с использованием количественной ОТ-ПЦР (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией).

На Фиг. 4А и 4Б представлены графики, показывающие относительные уровни экспрессии гена человеческого PTK7 при измерении с использованием ОТ-ПЦР во всех образцах колоректальной опухоли от пациентов с I-IV стадией болезни, нормализованных относительно средней экспрессии в нормальной ткани толстой и прямой кишки (Фиг. 4А) или относительно нормальной соседней ткани (Фиг. 4Б).

На Фиг. 5А и 5Б показаны относительные и абсолютные уровни экспрессии генов, соответственно, человеческих генов PTK7 при измерении с помощью ОТ-ПЦР в целых образцах опухоли (серые точки) или сопоставимой NAT (нормальной соседней ткани; белые точки) из пациентов с одним из восемнадцати разных типов солидных опухолей.

На Фиг. 6А и 6Б представлены в табличном виде близлежащие аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей ряда мышиных и гуманизированных типичных модуляторов PTK7, выделенных, клонированных и разработанных, как описано в Примерах в данном описании.

На Фиг. 7А-7Д в графической и табличной форме представлены физико-химические характеристики типичных модуляторов PTK7, где на Фиг. 7А показаны характеристики связывания некоторых модуляторов с мышиным и человеческим PTK7, На Фиг. 7Б показаны данные по аффинности, биннингу и перекрестной реакционной способности для выбранных модуляторов, на Фиг. 7В и 7Г показаны сравнительные характеристики связывания выбранного мышиного модулятора и его гуманизированного аналога, а на Фиг. 7Д представлены аффинности связывания выбранных модуляторов с человеческим PTK7 и его мышиным ортологом.

На Фиг. 8А-8Ж показаны различные конструкции PTK7 в соответствии с настоящим изобретением, где на Фиг. 8А-8Е показаны аминокислотные последовательности шести вариантов модулятора PTK7 в форме конструкций Ig-PTK7-ECD, где варьируется участок внеклеточного домена каждой конструкции, а на Фиг. 8Ж схематически изображены семь Ig-доменов внеклеточной области PTK7 вместе с выявленными посредством ELISA участками связывания нескольких модуляторов PTK7, как указано с помощью скобок.

На Фиг. 9А-9Д показаны уровни белка PTK7 в разных лизатах опухоли и в NTX-образцах, где на Фиг. 9А-9Г показаны уровни в лизатах разных опухолей и на разных стадиях заболевания по сравнению с контролями нормальной соседней ткани и на Фиг. 9Д представлены гистограммы, иллюстрирующие окрашивание человеческих нетрадиционных ксенотрансплантатов выбранными модуляторами, где контрольное окрашивание (серый) сравнивали с окрашиванием неопухолевых (пунктирная линия) и предполагаемых раковых стволовых клеточных популяций (непрерывная линия).

На Фиг. 10А-10Д графически показана способность выбранного модулятора по настоящему изобретению интернализоваться при связывании с PTK7 на клеточной поверхности, где на Фиг. 10В показан сдвиг флуоресценции, связанный с типичным модулятором (то есть SC6.10.2, называемым H10 на Фиг. 10В), на Фиг. 10А и 10Б представлены контроли, а на Фиг. 10Г показано, что типичные модуляторы из супернатантов гибридомы могут быть подвергнуты скринингу в отношении интернализации по сравнении с очищенными контролями (SC6.2.35, SC6.10.2 и SC6.25.1, называемыми H2.35, H10.2 и H25.1 соответственно) и на Фиг. 10Д продемонстрирована степень интернализации различных модуляторов (каждая точка на графике представляет отдельный модулятор), где пунктирная линия указывает пороговое значения для фона и число молекул PTK7, которые интернализируются клеткой в ответ на событие связывания, откладывают по оси y.

На Фиг. 11А-11Г графически показана способность раскрытых модуляторов иммуноспецифически опосредовать доставку цитотоксических агентов и содействовать клеточной гибели, где на Фиг. 11А представлено применение трех типичных модуляторов (SC6.2.35, SC6.10.2 и SC6.25.3, называемых Н2.35, Н10.2 и Н25.3, соответственно) в качестве группировок, обеспечивающих направленную прямую доставку, чтобы направлять цитотоксические полезные грузы в клетки, экспрессирующие PTK7, и где на Фиг. 11Б-11Г проиллюстрирована способность четырех дополнительных типичных модуляторов уничтожать три отдельные клеточные линии, где на каждой фигуре нисходящая кривая свидетельствует о гибели клеток в результате интернализации токсина.

Фиг. 12 свидетельствует о способности трех типичных модуляторов PTK7 иммуноспецифически опосредовать доставку цитотоксических агентов и, тем самым, уменьшать жизнеспособность опухолевых клеток в различных NTX-опухолевых клеточных линиях.

На Фиг. 13А-13В показана способность раскрытых модуляторов уменьшать частоту появления клеток, поддерживающих опухоль, и ингибировать их онкогенный потенциал, где на Фиг. 13А и 13Б показано, что модулятор (то есть SC6.2.35 меченный SC6.H2) опосредует доставку цитотоксических агентов, влияющих на жизнеспособность двух отдельных NTX-клеточных популяций рака молочной железы, а на Фиг. 13В показана пониженная онкогенность обработанных клеточных линий при имплантации мышам с ослабленным иммунитетом.

На Фиг. 14 показана способность типичных гуманизированных модуляторов PTK7 по настоящему изобретению эффективно опосредовать иммуноспецифическую доставку и интернализацию цитотоксических агентов в PTK7-экспрессирующие клетки.

Подробное описание изобретения

I. Введение

В то время как настоящее изобретение может быть воплощено во многих разных формах, здесь описаны его конкретные иллюстративные воплощения, которые иллюстрируют принципы изобретения. Следует отметить, что настоящее изобретение не ограничено конкретными проиллюстрированными воплощениями. Кроме того, любые используемые здесь заголовки разделов, предназначены только для организационных целей и не должны быть истолкованы как ограничивающие описываемый объект.

Как уже упоминалось, неожиданно было обнаружено, что экспрессия PTK7 связана с опухолевым ростом и гиперпролиферативными расстройствами и, что такие лиганды представляют собой полезные опухолевые маркеры, которые можно использовать в лечении связанных с этим заболеваний. Более конкретно, было обнаружено, что модуляторы PTK7, такие как описаны здесь, можно с успехом использовать в диагностике, терагнозисе, лечении или предупреждении опухолевых заболеваний у пациентов, нуждающихся в этом. Соответственно, в то время как предпочтительные воплощения изобретения будут подробно рассмотрены ниже, в частности, в контексте раковых стволовых клеток и их взаимодействий с раскрытыми модуляторами, специалистам в данной области понятно, что объем настоящего изобретения не ограничен такими иллюстративными воплощениями. Точнее, настоящее изобретение и прилагаемая формула изобретения в целом и определенно направлены на модуляторы PTK7 и их применение в диагностике, терагнозисе, лечении или предупреждении различных PTK7-ассоциированных или - опосредованных расстройств, в том числе опухолевых или гиперпролиферативных расстройств, независимо от любого конкретного механизма действия или конкретного целевого опухолевого компонента.

Кроме того, следует понимать, что в отличие от многих раскрытий из уровня техники, настоящее изобретение в значительной степени направлено на иммуноспецифические модуляторы различных изоформ PTK7, а не на общие модуляторы протеинтирозинкиназы. То есть, в то время как класс протеинтирозинкиназных рецепторов широко вовлечен в некоторые типы расстройств и обычно является целью терапевтического вмешательства, специфические модуляторы PTK7 до сих пор привлекали меньше внимания.

Частично, это может быть связано с уверенностью в том, что вмешательство в общую PTK-активность (в частности малыми молекулами, которые взаимодействуют с консервативными доменами киназы) являются более эффективными с терапевтической точки зрения, так как избыточность киназы, скорее всего, компенсирует любой специфический антагонизм отдельных членов этого класса. Кроме того, PTK7, по сообщениям, содержит неактивный киназный домен (или псевдокиназный домен), который может препятствовать использованию ее в качестве терапевтической мишени.

В противоположность этому, настоящее изобретение включает применение иммуноспецифических модуляторов, которые предпочтительно взаимодействуют с одной или более изоформами PTK7, для обеспечения терапевтических преимуществ. Как кратко обсуждается выше, в некоторых воплощениях модуляторы по настоящему изобретению могут быть образованы и выбраны так, чтобы соединяться с одной изоформой PTK7, в то время как в других воплощениях выбранные модуляторы могут взаимодействовать с более чем одной изоформой или со всеми общепризнанными изоформами PTK7. В этих последних воплощениях настоящее изобретение может включать модуляторы, которые соединяются или взаимодействуют с более чем одной изоформой PTK7, тем самым обеспечивая неожиданный аддитивный или синергетический эффект, который может обеспечить инактивацию более чем одного пути, опосредованного PTK7.

В общем, как показано в настоящей заявке, раскрытые иммуноспецифические модуляторы PTK7 можно эффективно использовать для нацеливания на онкогенные клетки и их устранения или другого способа выведения из строя онкогенных клеток и лечения PTK7-ассоциированных расстройств (например, неоплазии). При использовании здесь термин "PTK7-ассоциированное расстройство" означает любое расстройство или заболевание (включая пролиферативные расстройства), которое отмечено, диагностировано или идентифицировано с помощью фенотипической аберрации экспрессии PTK7 в течение или на основании этиологии заболевания или расстройства. В этой связи фенотипическая аберрация может, например, включать повышенные или пониженные уровни экспрессии PTK7, аномальную экспрессию PTK7 на некоторых поддающихся определению клеточных популяциях или аномальную экспрессию PTK7 в неподходящей фазе или на неподходящей стадии клеточного цикла.

Кроме общей связи, охарактеризованной непосредственно выше, авторы настоящего изобретения обнаружили до сих пор неизвестную фенотипическую связь между выбранными опухоль-инициирующими клетками (TIC) и PTK7. В связи с этим было установлено, что выбранные TIC экспрессируют повышенные уровни PTK7 по сравнению с нормальными тканями и неонкогенными клетками (NTG), которые вместе составляют большую часть солидной опухоли. Таким образом, изоформы PTK7 содержат ассоциированные с опухолью маркеры (или антигены, или иммуногены) и, как было обнаружено, обеспечивают эффективные агенты для обнаружения и подавления TIC и ассоциированной с ними неоплазии благодаря измененным уровням белков на клеточной поверхности или микроокружению в опухоли. В частности, также было обнаружено, что модуляторы PTK7, в том числе иммунореактивные антагонисты и антитела, которые ассоциируют, связываются или взаимодействуют с белками, эффективно уменьшают частоту опухоль-инициирующих клеток и, следовательно, полезны для устранения, истощения, выведения из строя, уменьшения, содействия дифференцировке или иным образом исключения или ограничения способности этих опухоль-инициирующих клеток находиться в инактивированном состоянии и/или продолжать поддерживать рост опухоли, метастазирование или рецидив у пациента. Как описано более подробно ниже, субпопуляция TIC-опухолевых клеток состоит как из клеток, поддерживающих опухоль (TPC), так и из высокопролиферативных опухолевых клеток-предшественников (TProg).

В свете этих открытий, специалистам в данной области очевидно, что в настоящем изобретении также предлагаются модуляторы PTK7 и их применение в уменьшении частоты опухоль-инициирующих клеток. Как будет подробно обсуждаться ниже, модуляторы PTK7 по изобретению в широком смысле включают любое соединение, которое узнает, вступает с реакцию, конкурирует, выступает как антагонист, взаимодействует, связывается, выступает как агонист или соединяется с PTK7 или PTK7 или их генами. Посредством этих взаимодействий модуляторы PTK7 уменьшают или понижают частоту опухоль-инициирующих клеток. Раскрытые здесь типичные модуляторы содержат нуклеотиды, олигонуклеотиды, полинуклеотиды, пептиды или полипептиды. В некоторых предпочтительных воплощениях выбранные модуляторы содержат антитела к PTK7 или их иммунореактивные фрагменты или производные. Такие антитела могут быть антагонистическими или агонистическими по природе и возможно могут быть конъюгированы или соединены с цитотоксическим агентом. В других воплощениях модуляторы в рамках настоящего изобретения содержат PTK7-конструкцию, содержащую изоформу PTK7 или ее реакционноспособный фрагмент. Следует понимать, что такие конструкции могут содержать слитые белки и могут включать реакционноспособные домены из других полипептидов, таких как иммуноглобулины или модификаторы биологического ответа. В других аспектах модулятор PTK7 содержит совокупность нуклеиновых кислот, оказывающую нужные эффекты на уровне генома. Другие модуляторы, совместимые с данным руководством, будут подробно описаны ниже.

Независимо от выбранной, в конечном счете, формы модулятора, он предпочтительно находится в выделенном и очищенном состоянии перед введением субъекту. В связи с этим, термин "выделенный модулятор PTK7" следует понимать в широком смысле и в соответствии со стандартной фармацевтической практикой как обозначающий любой препарат или композицию, содержащую модулятор в состоянии, по существу не содержащем нежелательных примесей (биологических или иных). Как будет обсуждаться более подробно ниже, эти препараты могут быть очищены и приготовлены в виде необходимого препарата с использованием различных известных в данной области методов. Конечно, следует понимать, что такие выделенные препараты могут быть намеренно изготовлены или скомбинированы с целесообразными инертными или активными ингредиентами для улучшения коммерческих, производственных или терапевтические аспектов готового продукта и получения фармацевтических композиций.

II. Физиология PTK7

Протеинтирозинкиназа (PTK7), также известная как киназа карциномы толстой кишки 4 (CCK4), представляет собой рецепторную тирозинкиназу, первоначально клонированную из нормальных человеческих меланоцитов (Lee et al., Oncogene 8 (12). 1993) и отдельно из ткани карциномы толстой кишки (Mossie et al., Oncogene 11 (10). 1995). Ген PTK7 локализован на 6р21.1-р12.2. Пять сплайс-изоформ человеческого PTK7 были клонированы из кДНК яичек (Jung, Ji et al., Biochim Biophys Acta 1579. 2002). Относительное содержание изоформ относительно друг друга различается между яичками и линиями гепатомы или карциномы толстой кишки, но функциональное значение этих изоформ, если таковое имеется, неизвестно. Биоинформатические анализы позволили предположить, что мыши могут экспрессировать растворимую изоформу Ptk7 из альтернативно сплайсируемых мРНК (Forrest, Taylor et al., Genome Biol 7, 2006). В контексте настоящей заявки, следует понимать, что термины "PTK7" и "CCK4" могут быть использованы взаимозаменяемо и включают варианты сплайсинга, изоформы, видовые ортологи и гомологи человеческого PTK7, если иное не диктуется контекстными ограничениями. Кроме того, следует понимать, что эти термины также могут относиться к любому производному или фрагменту нативной или вариантной формы PTK7, которая содержит эпитоп, с которым модулятор белка PTK7 (например, антитело или иммунореактивный фрагмент) может специфически связываться.

Полноразмерный белок PTK7 представляет собой трансмембранный белок I типа с внеклеточным доменом (ECD) из 674 аминокислот, за которым следует короткий ТМ (трансмембранный) участок и цитоплазматический домен из 345 аминокислот. Полная нуклеиновокислотная последовательность типичной изоформы человеческого PTK7 (то есть вариант транскрипции PTK7-1) имеет учетный номер Genbank NMJ302821 и представлен на Фиг. 1А (SEQ ID NO: 1). Аналогично, полноразмерная типичная аминокислотная последовательность белка PTK7-1 показана на Фиг. 1Б (SEQ ID NO: 2). Следует отметить, что белок PTK7 в SEQ ID NO: 2 отличается от продукта трансляции подчеркнутой последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1 (то есть изоформы а, как показано в SEQ ID NO: 3) тем, что в положении 93 на Фиг. 1Б имеется точечная мутация (L→P). Что касается изоформ, то на Фиг. 1В показано аннотированное выравнивание аминокислотных последовательностей четырех типичных изоформ PTK7, как сообщается в Genbank (учетные номера белков: изоформа a=NP_002812, SEQ ID NO: 3; изоформа b=NP_690619, SEQ ID NO: 5; изоформа c=NP_690620, SEQ ID NO: 6; изоформа d=NP_690621, SEQ ID NO: 4). Как ранее упоминалось, последовательность, соответствующая изоформе а, соответствует продукту трансляции открытой рамки считывания варианта 1 PTK7, представленного на Фиг. 1А и является самой длинной из изоформ. Как показано, другие сплайс-изоформы кодируют внеклеточные домены, лишенные различных Igcam доменов, относительно изоформы a. Все изоформы кодируют тот же самый внутриклеточный домен. Консервативные субмотивы в каталитическом домене протеинсерин/тирозинкиназы показаны ниже выравниваний PTK7, как и аннотации изменений в белке PTK7, которые, как полагают, приводят его киназный домен в неактивное состояние (например, изменения в субдоменах I и VII).

В любом случае зрелый полноразмерный PTK7 ECD содержит семь иммуноглобулин-подобных доменов, при этом, как показано на Фиг. 1В, различные сплайс-варианты кодируют изоформы PTK7, которые отличаются структурой своих ECD. Все изоформы содержат цитоплазматический домен с существенной гомологией к домену, обнаруженному в общем классе тирозинкиназ. Однако PTK7 не имеет обнаруживаемой тирозинкиназной активности и, как таковая, принадлежит к подсемейству псевдокиназ, у которых несколько аминокислотных замен в различных консервативных субдоменах киназ, приводят к нарушению связывания с ATP (Kroiher et al. Bioessays 23 (1), 2001). В частности, ключевые остатки в субдоменах I и VII изменены в PTK7 так, что нарушены непосредственные взаимодействия с не подлежащими переносу фосфатами ATP, а также хелатирование кофактора Mg2+, соединяющего эти фосфаты (Hanks et al., Methods Enzymol 200.1991).

Также следует принимать во внимание, что полипептиды PTK7, совместимые с настоящим изобретением, могут находиться в форме "зрелого" белка или могут быть частью более крупного белка, такого как слитый белок. Часто является полезным включать дополнительные аминокислотные последовательности, которые содержат секреторные или лидерные последовательности, пре-, про- или препробелковую последовательность, или последовательность, которая способствует очистке, такую как аффинная метка, например, но без ограничения ими, несколько остатков гистидина, FLAG-метка, HA-метка или myc-метка. Также могут быть использованы дополнительные последовательности, которые могут обеспечить стабильность при рекомбинантном получении. Такие последовательности возможно могут быть удалены, как того требует включение отщепляемой последовательности в качестве дополнительной последовательности или ее части. Таким образом, полипептид PTK7, как определено здесь, может содержать конструкции, слитые со вспомогательными группировками, включающими другие полипептиды. Такие дополнительные последовательности и аффинные метки хорошо известны в данной области и могут быть получены с использованием стандартных биохимических методов.

Заключение о биологическом значении функции PTK7, несмотря на ее неактивный киназный домен, может быть сделано на основании присутствия консервативных ортологов у видов от Hydra через Drosophila до курицы и человека, у каждого из которых, согласно анализу последовательности, прогнозируется отсутствие киназной активности (Kroiher et al., 2001). На основании высокой консервативности специфического мотива TM-домена, связанного со склонностью к спираль-спиральной ассоциации и того факта, что PTK обычно димеризуется в ответ на вхождение в контакт с лигандом, было сделано предположение, что TM-домен может опосредовать димеризацию PTK7 (Kroiher et al., 2001). Более позднее исследование позволило предположить, что TM-домен PTK7 не способствует преимущественной самоассоциации (Kobus et al., Biochemistry 44(5). 2005), но не исключает гетеромерных взаимодействий с TM-доменами других RTK или компонентов сигнального комплекса. Таким образом, предполагается, что псевдокиназный домен PTK7 сам по себе непосредственно не передает сигнал, но может взаимодействовать в качестве каркаса для других молекул в пути передачи сигнала или может рекрутировать другую(ие) тирозинкиназу(ы) (Kroiher et al., 2001).

PTK7 человека не экспрессируется в толстой кишке взрослых людей, хотя она экспрессируется в толстой кишке эмбриона и различных клеточных линиях карциномы толстой кишки (Mossie et al. выше, 1995), а также в метастатическом колоректальном раке (Saha et al., Science 294 (5545) 2001). Другие нормальные ткани и клетки, о которых сообщалось, что они экспрессируют PTK7, включают легкие, щитовидную железу и яичники (Mossie, Jallal et al. 1995), CD4+ ранние Т-клетки, мигрирующие из тимуса (Haines et al., J Exp Med 206 (2) 2009), и нормальные миелоидные предшественники и CD34+CD38- клетки костного мозга (Prebet et al., Blood 116(13). 2010). В отношении раковых тканей, экспрессия PTK7 также была обнаружена в клетках карциномы ободочной кишки (Mossie et al. 1995); в образцах AML (острый миелоидный лейкоз) (Muller-Tidow, et al. Clin Cancer Res 10 (4), 2004); в CD34 - пре-TALL (T-клеточный острый лимфобластный лейкоз) клетках (Shangguan et al., J Proteome Res 7 (5) 2008) и в карциноме желудка (Gorringe et al., Genes Chromosomes Cancer 42 (3), 2005). Интересно, что несмотря на первоначальное клонирование из нормальных меланоцитов, PTK7, как сообщается, была утеряна в метастазирующей меланоме (Easty et al., Int J Cancer 71 (6), 1997). PTK7 также может быть утеряна в некоторых видах рака груди, содержащих делеции хромосомы 6р21 (Piao et al., Genes Chromosomes Cancer 30(2), 2001), хотя экспрессия варьируется в клеточных линиях рака груди (Su et al., J Cancer 1 2010). PTK7 также экспрессируется аденокарциномой легких, где более сильные уровни экспрессии коррелируют с более благоприятным прогнозом для этих опухолей (Endoh et al., J Clin Oncol 22 (5), 2004). Тонкое картирование амплификаций участка 6p12-p21 в остеосаркомах показало, что увеличения числа копий не обязательно приводят к повышенной экспрессии PTK7, как определено с помощью количественной ОТ-ПЦР (Lu et al., Mol Cancer Res 6 (6), 2008).

Лиганд или лиганды PTK7 неизвестны, хотя PTK7 была связана с различными биологическими путями передачи сигнала и процессами развития. Структура иммуноглобулинподобного ECD-домена белка позволяет предположить, что он может быть участником или детектором межклеточного контакта и адгезии. Ортолог PTK7 у Drosophila, ОТК, ассоциируется с плексином в качестве потенциального корецептора для передачи сигнала посредством семафорина при поиске пути аксонами (Winberg et al., Neuron 32 (1), 2001). Недавно было продемонстрировано взаимодействие между плексином А1 и PTK7 у Xenopus (Wagner et al., Biochem Biophys Res Commun 402 (2) 2010), в то время как ортолог PTK7 у курицы, KLG, как было показано, взаимодействует с плексином А1 и Sema6D в комплексе, важном для морфогенеза сердца курицы ((Toyofuku et al., Genes Dev 18 (4). 2004). Растворимый PTK7 (sPTK7) использовали, чтобы показать роль PTK7 в VEGF-индуцированном ангиогенезе, а также в in vitro формировании трубки, миграции и инвазии эндотелиальных клеток человека (Shin et al., Biochem Biophvs Res Commun 371 (4), 2008). Мышиный PTK7 также был связан с эпидермальными процессами заживления ран, для которых требовалась реорганизация актинового цитоскелета и клеточная миграция (Caddy et al., Dev Cell 19 (1), 2010).

Что касается конкретных сигнальных каскадов, то PTK7, по-видимому, является компонентом различных сигнальных путей Wnt, важных для развития (Puppo et al., EMBO Rep 12 (1), 2010). Мыши, не экспрессирующие или экспрессирующие сильно гипоморфную мутацию в Ptk7, умирают перинатально, демонстрируя фенотипы, согласующиеся с ролью PTK7 в пути планарной клеточной полярности (PCP) (Lu et al., Nature 430 (6995), 2004). Аналогично, chuzhoi мыши, содержащие мутантные белки PTK7 с тремя аминокислотными вставками в ECD демонстрируют PCP-дефектные фенотипы (Paudyal, Damrau et al. 2010). Было показано, что мышиная PTK7 генетически взаимодействует с другими PCP-генами, включая Vangl2 (Lu et al., 2004), Celsr1 (Paudyal, Damrau et al. 2010), Scrb1 и Grhl3 (Caddy et al., 2010). Матричная металлопротеиназа мембранного типа 1 (MT1-MMP) расщепляет PTK7 с высвобождением растворимой PTK7 (то есть sPTK7) и дисрегуляция баланса МТ1-ММР активности и продуцирования sPTK7 приводит к дефектам конвергентного растяжения (convergent extension) у рыб данио (zebrafish), что также сопоставимо с ролью PTK7 в PCP-пути (Golubkov et al., J Biol Chem 285 (46), 2010). У Xenopus PTK7 был обнаружен в комплексе с dsh и Wnt-рецептором fz7 в неканоническом сигнальном пути Wnt (Shnitsar et al., Development 135 (24), 2008), поскольку можно было показать, что на взаимодействия между PTK7 и β-катенином динамически влияет на канонический сигнальный путь Wnt в мышиных клетках. (Puppo et al., 2010). Дополнительно, консервативный сайт связывания транскрипционного фактора TCF/LEF в промоторе PTK7 позволяет предположить, что он является Wnt-регулируемый геном и может объяснить активацию PTK7 в некоторых типах колоректального рака, так как в этих опухолях часто нарушен сигнальный путь Wnt (Katoh, Int J Mol Med 20 (3), 2007).

В раковых тканях в дополнение к ее способности модулировать Wnt-пути, описанные выше, PTK, по-видимому, передает пропролиферативные и антиапоптотические сигналы в линии карциномы толстой кишки НСТ116, фенотипы, которых можно реверсировать посредством РНКи (интерференция РНК)-опосредованного нокдауна PTK7 (Meng et al., PLoS One 5 (11), 2010). PTK7 антиапоптотические сигналы придают резистентность к антрациклин-опосредованной гибели клеток в AML бластах, которые можно реверсировать с использованием растворимого белка PTK7-Fc (Prebet et al., 2010). Избыточная экспрессия PTK7 определенными раковыми клетками используется в стратегии направленной доставки даунорубицина в T-ALL клетки в культуре с использованием аптамеров, которые связываются с PTK7 и затем подвергаются интернализации (Xiao et al., Chemistry 14 (6), 2008).

В дополнение к вышеупомянутым характеристикам в настоящем описании продемонстрировано, что экспрессия PTK7 повышена в различных популяциях опухоль-инициирующих клеток. Наряду с сопутствующей активацией PTK7 по меньшей мере в некоторых неонкогенных клетках объемной опухоли, увеличивается вероятность того, что PTK7-опосредованные взаимодействия лиганда с рецептором могут запускать клеточные сигнальные каскады, связанные с пролиферацией, неоангиогенезом и/или метастазированием опухоли. Без связи с какой-либо конкретной теорией считается, что модуляторы PTK7 по настоящему изобретению (особенно антагонистические или нейтрализирующие воплощения) действуют, по меньшей мере частично, путем либо снижения частоты или устранения опухоль-инициирующих клеток, тем самым препятствуя распространению опухоли или ее выживанию способом, отличающимся от традиционных стандартных схем лечения (например, иринотеканом), или через иммунотерапевтическую передачу сигнала или доставку полезной нагрузки, способной убить PTK7-экспрессирующие клетки. Например, снижение активности раковых стволовых клеток посредством антагонизации PTK7 может включать просто стимулирование клеточной пролиферации на фоне химиотерапевтических схем лечения, которые ликвидируют пролиферирующие клетки, или индукцию дифференцировки опухоль-инициирующих клеток таким образом, что их способность к самообновлению (то есть неограниченная пролиферация и поддержание мультипотентности) теряется. Альтернативно, в предпочтительных воплощениях рекрутмент цитотоксических Т-клеток к PTK7-экспрессирующим клеткам или доставка эффективного токсина, конъюгированного с анти-PTK7 антителом, способным к интернализации, может селективно убивать TPC.

II. Клетки, поддерживающие опухоль

В отличие от руководств в уровне техники, в настоящем изобретении предложены модуляторы PTK7, которые особенно полезны для нацеливания на опухоль-инициирующие клетки и особенно на клетки, поддерживающие опухоль, тем самым облегчая лечение, ведение или предупреждение опухолевых заболеваний. Более конкретно, как указано ранее, неожиданно было обнаружено, что специфические субпопуляции опухолевых клеток экспрессируют PTK7 и могут модифицировать локализованную координацию передачи сигналов посредством морфогена, важную для самообновления раковых стволовых клеток и выживаемости клеток. Таким образом, в предпочтительных воплощениях модуляторы PTK7 можно использовать для снижения частоты появления опухоль-инициирующих клеток, в соответствии с настоящим руководством, и, тем самым, облегчения лечения и ведения гиперпролиферативных заболеваний.

При использовании здесь термин "опухоль-инициирующая клетка" (TIC) охватывает как клетки, поддерживающие опухоль (TPC; то есть раковые стволовые клетки или CSC), так и высокопролиферативные клетки-предшественники опухоли (называемые TProg), которые вместе, как правило, составляют уникальную субпопуляцию (то есть 0,1-40%) объема опухоли или массы. В контексте данного описания термины "клетки, поддерживающие опухоль" и "раковые стволовые клетки" или "неопластические стволовые клетки" являются эквивалентными и могут быть использованы здесь взаимозаменяемо. Наоборот, TPC отличаются от TProg тем, что они могут полностью повторять состав опухолевых клеток, существующий в опухоли, и обладают способностью к неограниченному самообновлению, как показано с помощью серийной трансплантации (два или более пассажей у мышей) небольших количеств выделенных клеток. Как будет обсуждаться более подробно ниже, сортировка флуоресцентно-активированных клеток (FACS) с использованием подходящих клеточных поверхностных маркеров представляет собой надежный способ выделения высокообогащенных клеточных субпопуляций (например, с чистотой более 99,5%) благодаря, по меньшей мере частично, своей способности различать одиночные клетки и скопления клеток (то есть дублеты и т.д.). С помощью таких методов было показано, что при трансплантации мышам с ослабленным иммунитетом небольшого количества высокоочищенных клеток TProg, они могут поддерживать рост опухоли в первичном трансплантате. Однако в отличие от очищенных субпопуляций TPC, TProg образовывали опухоли, которые не отражают полностью фенотипическую клеточную гетерогенность родительской опухоли и являются явно неэффективными в возобновлении серийного онкогенеза при последующих трансплантациях. Напротив, субпопуляции TPC полностью восстанавливают клеточную гетерогенность родительских опухолей и могут эффективно инициировать опухоли при серийном выделении и трансплантации. Таким образом, специалистам в данной области понятно, что определяющей разницей между TPC и TProg, хотя они обе могут индуцировать опухоли в первичных трансплантатах, является уникальная способность TPC постоянно поддерживать рост гетерогенной опухоли при серийных трансплантациях с небольшим числом клеток. Другие общие подходы для характеристики TPC включают морфологию и определение клеточных поверхностных маркеров, транскрипционного профиля и реакции на лекарственные средства, хотя экспрессия маркера может меняться в зависимости от условий культивирования и пассажа клеточной линии in vitro.

Соответственно, в контексте настоящего изобретения, клетки, поддерживающие опухоль, аналогично нормальным стволовым клеткам, которые поддерживают клеточную иерархию в нормальной ткани, предпочтительно, определяют по их способности к бесконечному самообновлению при сохранении способности к мультилинейной дифференцировке. Клетки, поддерживающие опухоль, таким образом, способны образовать как онкогенное потомство (то есть опухоль-инициирующие клетки: TPC и TProg), так и неонкогенное (NTG) потомство. При использовании здесь, неонкогенная клетка (NTG) относится к опухолевой клетке, которая происходит из опухоль-инициирующих клеток, но сама по себе не обладает способностью к самообновлению или образованию гетерогенных линий опухолевых клеток, составляющих опухоль. В эксперименте NTG-клетки не способны воспроизводимо образовывать опухоли у мышей, даже при трансплантации избыточных количеств клеток.

Как указано, TProg также относятся к категории опухоль-инициирующих клеток (или TIC) благодаря их ограниченной способности генерировать опухоли у мышей. TProg являются потомством TPC и обычно способны к конечному числу несамообновляющихся клеточных делений. Кроме того, клетки TProg можно дополнительно разделить на ранние клетки-предшественники опухоли (ЕТР) и поздние клетки-предшественники опухоли (LTP), каждые из которых можно отличить по фенотипу (например, клеточным поверхностным маркерам) и разным способностям воссоздавать архитектуру опухолевой клетки. Несмотря на такие технические различия, и ЕТР, и LTP функционально отличаются от TPC тем, что они, как правило, менее способны к серийному воссозданию опухолей при трансплантации небольших количеств клеток и, как правило, не отражают гетерогенность родительской опухоли. Несмотря на вышеуказанные различия, также было показано, что различные популяции TProg могут, в редких случаях, приобретать способность к самообновлению, обычно присущую стволовым клеткам, и сами становятся TPC (или CSC). В любом случае оба типа опухоль-инициирующих клеток, по всей видимости, представлены в массе типичной опухоли одного пациента и подлежат лечению модуляторами, как описано здесь. То есть, описанные композиции, как правило, эффективны в снижении частоты появления или в изменении хемочувствительности таких PTK7-положительных опухоль-инициирующих клеток, независимо от конкретного воплощения или смеси, представленных в опухоли.

В контексте настоящего изобретения TPC являются более онкогенными, относительно более неактивными и часто более химиорезистентными, чем TProg (как ЕТР, так и LTP), NTG-клетки и инфильтрующие опухоль клетки, происходящие не из TPC (например, фибробласты/строма, эндотелиальные и гемопоэтические клетки), которые составляют основной объем опухоли. Учитывая, что обычные способы лечения и схемы лечения в значительной степени были разработаны так, чтобы и уменьшать массу опухолей, и атаковать быстро пролиферирующие клетки, TPC, вероятно, являются более резистентными к обычным терапевтическим средствам и схемам лечения, чем быстрее пролиферирующие TProg и другие клеточные популяции массивных опухолей. Кроме того, TPC часто проявляют другие характеристики, которые делают их относительно химиорезистентными к обычным терапевтическим средствам, такие как повышенная экспрессия транспортеров множественной лекарственной резистентности, усиленные механизмы репарации ДНК и антиапоптотические белки. Эти свойства, каждое из которых вносит вклад в устойчивость TPC к лекарственным средствам, являются главной причиной неудач стандартных онкологических схем лечения в обеспечении длительной пользы для большинства пациентов с поздней стадией неоплазии; то есть не удается адекватно нацелиться и уничтожить те клетки, которые поддерживают постоянный рост опухоли и ее повторное проявление (то есть TPC или CSC).

В отличие от многих вышеупомянутых способов лечения из уровня техники, новые композиции по настоящему изобретению предпочтительно снижают частоту появления опухоль-инициирующих клеток при введении субъекту независимо от формы и конкретной мишени (например, генетический материал, PTK7-антитело или слитая лигандная конструкция) выбранного модулятора. Как отмечалось выше, снижение частоты появления опухоль-инициирующих клеток может происходить в результате а) удаления, истощения, сенсибилизации, подавления или ингибирования опухоль-инициирующих клеток; б) контролирования роста, распространения или повторного появления опухоль-инициирующих клеток; в) нарушения инициации, распространения, сохранения или пролиферации опухоль-инициирующих клеток; или г) препятствования иным способом выживаемости, регенерации и/или метастазированию онкогенных клеток. В некоторых воплощениях снижение частоты появления опухоль-инициирующих клеток происходит в результате изменения одного или более физиологических путей. Изменение пути посредством сокращения или удаления опухоль-инициирующих клеток или модификации их активности (например, индуцированная дифференцировка, нарушение ниши) или иное вмешательство в их способность оказывать воздействия на окружение опухоли или другие клетки, в свою очередь обеспечивает возможность более эффективного лечения PTK7-ассоциированных расстройств путем ингибирования онкогенеза, поддержания опухоли и/или метастазирования и повторного появления.

В число методов, которые можно использовать для оценки такого сокращения частоты появления опухоль-инициирующих клеток, входит анализ методом серийных разведений либо in vitro, либо in vivo, предпочтительно с последующим подсчетом с использованием статистических параметров распределения Пуассона или оценкой частоты появления предварительно установленных определяющих событий, таких как наличие или отсутствие способности генерировать опухоли in vivo. В то время как такой анализ методом серийных разведений является предпочтительным методом подсчета снижения частоты появления опухоль-инициирующих клеток, другие менее требовательные методы также могут быть использованы для эффективного, хотя и немного менее точного, определения нужных значений, и являются полностью совместимые с данным руководством. Таким образом, как очевидно специалистам в данной области, также можно определить снижение значений частоты появления с помощью хорошо известных методов проточной цитометрии или иммуногистохимического анализа. В отношении всех указанных выше способов см., например, Dylla et al. 2008, PMCID: PMC2413402 и Hoey et al. 2009, PMID: 19664991; каждый из которых включен в данную заявку посредством ссылки во всей полноте.

Что касается анализа методом серийных разведений, in vitro подсчет частоты появления опухоль-инициирующих клеток может быть осуществлен путем помещения либо фракционированных, либо нефракционированных опухолевых клеток человека (например, из обработанных и необработанных опухолей соответственно) в ростовые условия in vitro, которые способствуют колониеобразованию. Таким образом, колониеобразующие клетки можно сосчитать с помощью простого подсчета и характеристики колоний, или посредством анализа, состоящего, например, из помещения человеческих опухолевых клеток в планшеты в серийных разведениях и оценки каждой лунки, либо как положительной, либо как отрицательной в отношении образования колоний по меньшей мере через 10 суток после посева. Эксперименты или анализы с серийным разведением in vivo, которые, как правило, являются более точными по их способности определить частоту появления опухоль-инициирующих клеток, включают трансплантацию человеческих опухолевых клеток, либо из необработанного контроля, либо из обработанных клеток, например мышам с ослабленным иммунитетом в серийных разведениях, и последующую оценку каждой мыши либо как положительную, либо как отрицательную в отношении образования опухоли через по меньшей мере 60 суток после трансплантации. Выведение значений частоты появления клеток посредством анализа методом серийных разведений in vitro или in vivo предпочтительно выполняли, применяя статистические параметры распределения Пуассона к известной частоте появления положительных и отрицательных событий, тем самым получая частоту событий, соответствующих определению положительного события; в данном случае образования колонии или опухоли соответственно.

Что касается других методов, совместимых с настоящим изобретением, которые можно использовать для вычисления частоты появления опухоль-инициирующих клеток, наиболее распространенными являются методы количественной проточной цитометрии и метода иммуногистохимического окрашивания. Хотя эти методы не так точны, как анализ методом серийных разведений, описанный непосредственно выше, эти методики гораздо менее трудоемки и обеспечивают приемлемые значения за относительно короткий период времени. Таким образом, следует понимать, что специалист может применять определение профиля маркеров клеточной поверхности с помощью проточной цитометрии с использованием одного или более антител или реагентов, связывающих белки клеточной поверхности, которыми, как известно из уровня техники, богаты опухоль-инициирующие клетки (например, потенциально совместимые маркеры, как описано в Примере 1 ниже) и таким образом измерять уровни TIC в различных образцах. С помощью еще одного совместимого метода специалист в данной области может определить частоту появления TIC in situ (например, в срезе ткани) посредством иммуногистохимии с использованием одного или более антител или реагентов, которые способны связывать белки клеточной поверхности, которыми, как предполагается, отличаются эти клетки.

Используя любой из вышеупомянутых методов, можно затем количественно определить снижения частоты появления TIC (или TPC в них), обеспечиваемую раскрытыми модуляторами PTK7 (в том числе конъюгированными с цитотоксическими агентами) в соответствии с руководством в данной заявке. В некоторых случаях соединения по настоящему изобретению могут снижать частоту появления TIC (с помощью различных механизмов, указанных выше, включая удаление, индуцированную дифференцировку, разрушение ниши, подавление и т.д.) на 10%, 15%, 20%, 25%, 30% или даже на 35%. В других воплощениях снижение частоты появления TIC может составлять около 40%, 45%, 50%, 55%, 60% или 65%. В некоторых воплощениях раскрытые соединения могут снижать частоту появления TIC на 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или даже 95%. Конечно, следует понимать, что любое снижение частоты появления TIC вероятно приведет к соответствующему снижению онкогенности, устойчивости, повторного проявления и агрессивности неоплазии.

IV. Модуляторы PTK7

В любом случае настоящее изобретение направлено на применение модуляторов PTK7, в том числе антагонистов PTK7 для диагностики, терагнозиса, лечения и/или профилактики различных расстройств, включая любое из числа PTK7-ассоциированных злокачественных образований. Раскрытые модуляторы можно использовать отдельно или в сочетании с широким спектром противораковых соединений, таких как химиотерапевтические или иммунотерапевтические агенты (например, терапевтические антитела) или модификаторы биологического ответа. В других выбранных воплощениях два или более отдельных модуляторов PTK7 можно использовать в комбинации, чтобы обеспечить усиленные противоопухолевые эффекты или можно использовать для изготовления полиспецифических конструкций.

В некоторых воплощениях модуляторы PTK7 по настоящему изобретению включают нуклеотиды, олигонуклеотиды, полинуклеотиды, рептиды или полипептиды. Еще более предпочтительно, модуляторы включают растворимый PTK7 (sPTK7) или его форму, вариант, производное или фрагмент, включая, например, слитые PTK7-конструкции (например, PTK7-FC, PTK7-нацеленная группировка и т.д.) или PTK7-конъюгаты (например, PTK7-PEG (полиэтиленгликоль), PTK7-цитотоксический агент, PTK7-brm (модификатор биологического ответа), и т.д.). Следует также иметь в виду, что, в других воплощениях, модуляторы PTK7 включают антитела или их иммунореактивные фрагменты или производные. В особенно предпочтительных воплощениях модуляторы по настоящему изобретению включают нейтрализирующие антитела или их производные или их фрагменты. В других воплощениях модуляторы PTK7 могут содержать интернализованные антитела или их фрагменты. В других воплощениях модуляторы PTK7 могут включать истощающие антитела или их фрагменты. Кроме того, как и вышеупомянутые слитые конструкции, эти антительные модуляторы могут быть конъюгированы, связаны или иным образом соединены с выбранными цитотоксическими агентами, полимерами, модификаторами биологического ответа (BRM) и т.п.для обеспечения направленной иммунотерапии с различными (и возможно многочисленными) механизмами действия. Как упоминалось выше, такие антитела могут быть пан-PTK7 антителами и соединяться с двумя или более изоформами PTK7 или иммуноспецифическими антителами, которые селективно взаимодействуют с одной изоформой. В других воплощениях модуляторы могут работать на генетическом уровне и могут содержать такие компоненты, как антисмысловые конструкции, миРНК (малые интерферирующие РНК), микроРНК и т.п.

Кроме того, следует понимать, что раскрытые модуляторы PTK7 могут истощать, подавлять активность, нейтрализовать, устранять или ингибировать рост, размножение или выживаемость опухолевых клеток, в частности TPC, и/или ассоциированную неоплазию посредством различных механизмов, включая агонизм и антагонизм выбранных путей или устранение специфических клеток в зависимости, например, от формы модулятора PTK7, любой присоединенной полезной нагрузки или дозы и способа доставки. Соответственно, в то время как предпочтительные воплощения, раскрытые в данной заявке, направлены на истощение, ингибирование или подавление субпопуляций специфических опухолевых клеток, таких как клетки, поддерживающие опухоль, следует подчеркнуть, что такие воплощения являются только иллюстративными, и ни в каком смысле не ограничивающими. Скорее, как изложено в прилагаемой формуле изобретения, настоящее изобретение в широком смысле направлено на модуляторы PTK7 и их применение в лечении, терапии или профилактике различных PTK7-ассоциированных гиперпролиферативных расстройств независимо от любого конкретного механизма или целевой популяции опухолевых клеток.

В том же смысле раскрытые воплощения настоящего изобретения могут включать один или более антагонистов PTK7, которые соединены с PTK7. В связи с этим следует иметь в виду, что антагонисты PTK7 по настоящему изобретению могут включать любой лиганд, полипептид, пептид, слитый белок, антитело или его иммунологически активный фрагмент или производное, который распознает, вступает во взаимодействие, связывается, объединяется, конкурирует, соединяется или иным образом взаимодействует с белком PTK7 или его фрагментом и устраняет, подавляет активность, уменьшает, ингибирует, препятствует, сдерживает или контролирует рост опухоль-инициирующих клеток или других опухолевых клеток, включая клетки опухолевой массы или NTG. В выбранных воплощениях модуляторы PTK7 включают антагонисты PTK7.

При использовании здесь "антагонист" относится к молекуле, способной нейтрализовать, блокировать, ингибировать, отменять, уменьшать или препятствовать активностям конкретного или специфического белка, включая связывание рецепторов с лигандами или взаимодействие ферментов с субстратами. В более общем смысле антагонисты по изобретению могут включать антитела и их антигенсвязывающие фрагменты или производные, белки, пептиды, гликопротеины, гликопептиды, гликолипиды, полисахариды, олигосахариды, нуклеиновые кислоты, антисмысловые конструкции, миРНК, микроРНК, биоорганические молекулы, пептидомиметики, фармакологические агенты и их метаболиты, последовательности, контролирующие транскрипцию и трансляцию, и тому подобное. Антагонисты также могут включать низкомолекулярные ингибиторы, слитые белки, рецепторные молекулы и производные, которые специфически связываются с белком, тем самым блокируя его связывание с целевым субстратом, антагонистические варианты белка, антисмысловые молекулы, направленные на белок, РНК-аптамеры и рибозимы против белка.

При использовании здесь и применении к двум или более молекулам или соединениям, термины "узнает" или "соединяется" означают реакцию, связывание, специфическое связывание, комбинацию, взаимодействие, соединение, связь, объединение, слияние, поглощение или присоединение, ковалентное или нековалентное, молекул, где одна молекула оказывает эффект на другую молекулу.

Кроме того, как показано в примерах в данной заявке, некоторые модуляторы PTK7 человека могут, в некоторых случаях, перекрестно реагировать с PTK7 из видов, не являющихся человеком (например, мыши). В других случаях типичные модуляторы могут быть специфичными к одной или более изоформам PTK7 человека и не обнаруживают перекрестной реактивности с ортологами PTK7 из других видов. Конечно, в сочетании с идеями данной заявки такие воплощения могут включать пан-PTK7 антитела, которые соединяются с двумя или более изоформами из одного вида или антитела, которые исключительно соединяются с одной изоформой.

В любом случае, как будет обсуждаться более подробно ниже, специалистам в данной области очевидно, что раскрытые модуляторы можно использовать в конъюгированной или неконъюгированной форме. Таким образом, модулятор может быть соединен или конъюгирован (например, ковалентно или нековалентно) с фармацевтически активными соединениями, модификаторами биологического ответа, противораковыми агентами, цитотоксическими или цитостатическими агентами, диагностическими группировками или биосовместимыми модификаторами. В этом отношении следует иметь в виду, что такие конъюгаты могут включать пептиды, полипептиды, белки, слитые белки, молекулы нуклеиновой кислоты, малые молекулы, миметики, синтетические лекарственные препараты, неорганические молекулы, органические молекулы и радиоизотопы. Кроме того, как указано в данном описании, выбранный конъюгат может быть ковалентно или нековалентно связан с модулятором PTK7 в различных молярных соотношениях в зависимости, по меньшей мере частично, от метода, используемого для осуществления конъюгации.

Антитела

а. Обзор

Как уже упоминалось, особенно предпочтительные воплощения настоящего изобретения включают модуляторы PTK7 в форме антител, которые, предпочтительно, соединяются с одной или более изоформами PTK7. Термин "антитело" используется в наиболее широком смысле и конкретно включает синтетические антитела, моноклональные антитела, олигоклональные или поликлональные антитела, мультиклональные антитела, рекомбинантные антитела, интратела, полиспецифические антитела, биспецифические антитела, моновалентные антитела, поливалентные антитела, человеческие антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела, CDR-привитые антитела, приматизированные антитела, Fab-фрагменты, P(ab')-фрагменты, одноцепочечные FvFcs (scFvFc), одноцепочечные Fvs (scFv), антиидиотипические (анти-Id) антитела и любые другие иммунологически активные фрагменты антител, при условии, что они проявляют нужную биологическую активность (то есть иммуноспецифическое или иммунопредпочтительное соединение или связывание с PTK7). В более широком смысле, антитела по настоящему изобретению включают иммуноглобулиновые молекулы и иммунологически активные фрагменты иммуноглобулиновых молекул, то есть молекулы, которые содержат антигенсвязывающий сайт, причем эти фрагменты могут быть или могут не быть слитыми с другим иммуноглобулиновым доменом, включая, но не ограничиваясь ими, с Fc-участком или его фрагментом. Кроме того, как описано более подробно в данной заявке, термины "антитело" и "антитела", в частности, включают Fc-варианты, как описано ниже, в том числе полноразмерные антитела и варианты Fc-слияний, содержащие Fc-участки или их фрагменты, возможно содержащие по меньшей мере одну модификацию аминокислотного остатка и слитые с иммунологически активным фрагментом иммуноглобулина.

Как описано более подробно ниже, общие термины "антитело" или "иммуноглобулин" содержат пять различных классов антител, которые можно различить биохимически и, в зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей, можно легко отнести к соответствующему классу. В силу исторических причин основные классы интактных антител называются IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. У человека классы IgG и IgA можно дополнительно разделить на признанные подклассы (изотипы), то есть IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2 в зависимости от структуры и некоторых биохимических свойств. Следует понимать, что изотипы IgG у человека названы в порядке их распространенности в сыворотке, причем наиболее распространенным является IgG1.

Хотя все пять классов антител (то есть IgA, IgD, IgE, IgG и IgM) и все изотипы (то есть IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2), а также их варианты входят в объем настоящего изобретения, предпочтительные воплощения, включающие класс иммуноглобулина IgG обсуждаются более подробно исключительно для иллюстрации. Однако следует понимать, что такое описание просто демонстрирует типичные композиции и способы осуществления настоящего изобретения на практике и никоим образом не ограничивает объем изобретения или прилагаемой формулы изобретения.

В этом отношении человеческие иммуноглобулины IgG содержат две идентичные легкие полипептидные цепи с молекулярной массой приблизительно 23000 дальтон и две идентичные тяжелые цепи с молекулярной массой 53000-70000 в зависимости от изотипа. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют разным классам антител, обозначены соответствующей строчной греческой буквой α, δ, δ, γ и μ соответственно. Легкие цепи антител из любого вида позвоночных могут быть отнесены к одному из двух четко отличающихся типов, называемых каппа (κ) и лямбда (λ), на основании аминокислотных последовательностей их константных доменов. Специалистам в данной области понятно, что структуры субъединиц и трехмерные конфигурации разных классов иммуноглобулинов хорошо известны.

Четыре цепи соединены дисульфидными связями в Y-конфигурацию, где легкие цепи захватывают в вилку тяжелые цепи, начиная с устья Y и далее через вариабельную область до двух концов Y. Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, в то время как две дисульфидные связи в шарнирной области соединяют тяжелые цепи. Соответствующие тяжелые и легкие цепи также имеют расположенные на регулярном расстоянии друг от друга внутрицепочечные дисульфидные мостики, число которых может меняться в зависимости от изотипа IgG.

Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (VH), за которым следует ряд константных доменов. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен на одном конце (VL) и константный домен на другом конце; константный домен легкой цепи выровнен с первым константным доменом тяжелой цепи, и вариабельный домен легкой цепи выровнен с вариабельным доменом тяжелой цепи. В связи с этим следует понимать, что вариабельные домены участков как легкой (VL), так и тяжелой (VH) цепи определяют антигенное распознавание и специфичность к антигену. Напротив, константные домены легкой цепи (CL) и тяжелой цепи (CH1, CH2 или CH3) придают и регулируют важные биологические свойства, такие как секреция, трансплацентарная подвижность, время полужизни в кровотоке, связывание комплемента и тому подобное. Принято, что нумерация доменов константного участка увеличивается по мере удаления от сайта связывания антигена или амино-конца антитела. Таким образом, амино- или N-конец антитела содержит вариабельную область, а карбокси- или С-конец содержит константный участок. Таким образом, домены CH3 и CL фактически включают карбокси-конец тяжелой и легкой цепи соответственно.

Термин "вариабельный" связан с тем, что некоторые участки вариабельных доменов значительно различаются своими последовательностями у иммуноглобулинов и эти горячие точки в значительной степени определяют связывание и специфические характеристик конкретного антитела. Эти гипервариабельные сайты проявляются в трех сегментах, известных как области, определяющие комплементарность (CDR), в вариабельных доменах как легкой цепи, так и тяжелой цепи соответственно. Наиболее консервативные участки вариабельных доменов, фланкирующие CDR, называются каркасными участками (FR). Более конкретно, в природных мономерных IgG-антителах шесть CDR, присутствующих на каждом плече антитела, представляют собой короткие, несоприкасающиеся аминокислотные последовательности, которые специфически располагаются с образованием антигенсвязывающего сайта, когда антитело приобретает свою трехмерную конфигурацию в водной среде.

Каркасные участки, содержащие остатки вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи, демонстрируют меньшую межмолекулярную вариабельность аминокислотной последовательности. Скорее, каркасные участки большей частью принимают β-складчатую конформацию, а CDR образуют петли, которые соединяются и в некоторых случаях образуют часть β-складчатой структуры. Таким образом, эти каркасные участки действуют, чтобы сформировать остов, который обеспечивает размещение шести CDR в правильной ориентации посредством межцепочечных нековалентных взаимодействий. Антигенсвязывающий сайт, образованный таким образом расположенными CDR, определяет поверхность, комплементарную эпитопу на иммунореактивном антигене. Эта комплементарная поверхность способствует нековалентному связыванию антитела с эпитопом иммунореактивного антигена. Понятно, что положения и состав CDR могут быть легко определены специалистом в данной области техники с использованием определений, приведенных в данном описании изобретения.

Как описано более подробно ниже, все или часть вариабельных областей тяжелой и легкой цепи могут быть рекомбинированы или сконструированы с использованием стандартных методов рекомбинации и экспрессии с получением эффективных антител. То есть вариабельная область тяжелой или легкой цепи из первого антитела (или любой ее участок) может быть смешана и подобрана к любому выбранному участку вариабельной области тяжелой или легкой цепи из второго антитела. Например, в одном воплощении, целая вариабельная область легкой цепи, содержащая три CDR легкой цепи первого антитела, может быть спарена с целой вариабельной областью тяжелой цепи, содержащей три CDR тяжелой цепи второго антитела, с получением функционального антитела. Кроме того, в других воплощениях отдельные CDR тяжелой и легкой цепи, полученные из различных антител, могут быть смешаны или подобраны с получением нужного антитела, имеющего оптимизированные характеристики. Таким образом, типичное антитело может содержать три CDR легкой цепи из первого антитела, две CDR тяжелой цепи, полученные из второго антитела, и третью CDR тяжелой цепи из третьего антитела.

Более конкретно, в контексте настоящего изобретения следует понимать, что любая из раскрытых CDR тяжелой и легкой цепи, происходящая из аминокислотных последовательностей мышиной вариабельной области, представленная на Фиг. 6А или Фиг. 6Б может быть трансформирована таким образом, чтобы обеспечить оптимизированные анти-PTK7 (например, анти-hPTK7) антитела согласно настоящему руководству. То есть, одна или более CDR, полученных из близлежащих аминокислотных последовательностей вариабельной области легкой цепи, представленных на Фиг. 6А (SEQ ID NO: 20-60, четные номера) или близлежащих аминокислотных последовательностей вариабельной области тяжелой цепи, представленных на Фиг. 6Б (SEQ ID NO: 21-61, нечетные номера) могут быть включены в модулятор PTK7 и, в особенно предпочтительных воплощениях, в CDR-привитое или гуманизированное антитело, которое иммуноспецифически связывается с одной или более изоформами PTK7. Примеры аминокислотных последовательностей вариабельной области легкой (SEQ ID NO: 62-68, четные номера) и тяжелой (SEQ ID NO: 63-69, нечетные номера) цепи таких гуманизированных модуляторов также представлены на Фиг. 6А и 6Б. Взятые вместе эти новые аминокислотные последовательности представляют двадцать один мышиный и четыре гуманизированных типичных модулятора в соответствии с настоящим изобретением. Кроме того, соответствующие нуклеиновокислотные последовательности каждой из двадцати одного типичного мышиного модулятора и четырех гуманизированных модуляторов, представленных на Фиг. 6А и 6Б, включены в перечень последовательностей, прилагаемый к настоящей заявке (SEQ ID NO: 120-169).

В любом случае, номера остатков области, определяющей комплементарность, можно определить по Kabat et al. (1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va.), в частности остатки 24-34 (CDR1), 50-56 (CDR2) и 89-97 (CDR3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (CDR1), 50-65 (CDR2) и 95-102 (CDR3) в вариабельном домене тяжелой цепи. Следует обратить внимание на то, что CDR значительно варьируются от антитела к антителу (и в сущности не проявляют гомологии с консенсусными последовательностями Kabat). Максимальное выравнивание остатков каркаса часто требует вставки спейсерных остатков в системе нумерации, используемой для области Fv. Кроме того, идентичность некоторых отдельных остатков для любого взятого номера положения по Kabat может варьироваться от одной цепи антитела к другой цепи антитела из-за межвидовой или аллельной дивергенции. См. также Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987); Chothie et al., Nature 342, pp. 877-883 (1989), MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996) и S. Dubel, ed., Handbooko of Therapeutic Abtibodies, 3rd ed., WILEY-VCH Verlag GmbH and Co. (2007), где определения включают перекрывание или подмножества аминокислотных остатков при сравнении друг с другом. Каждая из вышеупомянутых работ включена в данную заявку посредством ссылки во всей полноте, и аминокислотные остатки, которые содержат участки связывания или CDR, как определено в каждой из вышеупомянутых ссылок, и которые приведены для сравнения ниже.

Определения СОК

Как обсуждалось здесь, специалист в данной области может легко определить, идентифицировать, установить происхождение и/или пронумеровать CDR по Kabat et al., Chothia et al. или MacCallum et al. для каждой соответствующей последовательности тяжелой и легкой цепи, представленной на Фиг. 6А или Фиг. 6Б. Соответственно, каждая из исследуемых CDR, а также антитела, содержащие CDR, определенные согласно всем таким системам нумерации прямо включены в объем настоящего изобретения. В более широком смысле термин "аминокислотный остаток вариабельной области CDR" включает аминокислоты в CDR, определенные при использовании любого основанного на последовательности или структуре метода, как изложено выше.

При использовании здесь термин "аминокислотные остатки каркасного участка (FR) вариабельной области" относится к аминокислотам каркасного участка цепи Ig. Термин "каркасный участок" или "FR-участок", при использовании здесь, включает аминокислотные остатки, которые являются частью вариабельной области, но не частью CDR (например, с использованием определения CDR по Kabat). Следовательно, каркасный участок вариабельной области является прерывистой последовательностью длиной примерно 100-120 аминокислот, но включает только аминокислоты, расположенные за пределами CDR.

В качестве конкретного примера вариабельной области тяжелой цепи и CDR, определенных по Kabat et al., каркасный участок 1 соответствует домену вариабельной области, содержащему аминокислоты 1-30; каркасный участок 2 соответствует домену вариабельной области, содержащему аминокислоты 36-49; каркасный участок 3 соответствует домену вариабельной области, содержащему аминокислоты 66-94, и каркасный участок 4 соответствует домену вариабельной области от аминокислоты 103 до конца вариабельной области. Каркасные участки легкой цепи аналогично разделены каждой из вариабельных областей CDR легкой цепи. Аналогично, при использовании определения CDR по Chothia et al. (например, CDR-L1 23-34, CDR-L2 50-56, CDR-L3 89-97; CDR-H1 26-32, CDR-H2 50-58, CDR-H3 95-102) или по McCallum et al. границы каркасные участки разделены соответствующими концами CDR, как описано выше.

Учитывая вышеупомянутые структурные соображения, специалистам в данной области понятно, что антитела по настоящему изобретению могут включать любое из ряда функциональных воплощений. В этом отношении, совместимые антитела могут включать любое иммунореактивное антитело (как этот термин определен в данном описании), которое обеспечивает нужный физиологический ответа у субъекта. В то время как любые раскрытые антитела можно использовать в сочетании с идеями настоящего изобретения, определенные воплощения изобретения включают химерные, гуманизированные или человеческие моноклональные антитела или их иммунореактивные фрагменты. Тем не менее, другие воплощения могут, например, включать гомогенные или гетерогенные мультимерные конструкции, Fc-варианты и конъюгированные или измененные посредством гликозилирования антитела. Кроме того, следует понимать, что такие конфигурации не являются взаимоисключающими и, что совместимые отдельные антитела могут включать один или более функциональных аспектов, раскрытых в данной заявке. Например, совместимое антитело может включать одноцепочечное диатело с гуманизированными вариабельными областями или полностью человеческое полноразмерное антитело IgG3 с модификациями Fe, которые меняют профиль гликозилирования для изменения времени полужизни в сыворотке. Другие типичные воплощения очевидны специалистам в данной области и могут быть легко узнаны как входящие в объем изобретения.

б. Получение антител

Хорошо известно и показано в Примерах ниже, что различные животные-хозяева, в том числе кролики, мыши, крысы и т.д., могут быть привиты и использованы для получения антител в соответствии с идеями данной заявки. Известные в данной области адъюванты, которые можно использовать для усиления иммунного ответа, в зависимости от вида привитого животного включают, но не ограничиваются ими, адъювант Фрейнда (полный и неполный), минеральные гели, такие как гидроксид алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, плюроновые полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианины фиссурелии, динитрофенол и потенциально полезные адъюванты человека, такие как BCG (бацилла Кальметта-Герена) и Corynebacterium parvum. Такие адъюванты могут защищать антиген от быстрого рассредоточения путем ограничения его в локальном отложении, или они могут содержать вещества, которые стимулируют организмы-хозяева секретировать факторы, хемотаксические для макрофагов и других компонентов иммунной системы. Предпочтительно, при введении полипептида схема иммунизации будет включать два или более введений полипептида, произведенных в течение несколько недель.

После иммунизации животного иммуногеном PTK7 (например, растворимым PTK7 или sPTK7), который может содержать выбранные изоформы и/или пептиды, или живыми клетками или клеточными препаратами, экспрессирующими нужный белок, антитела и/или антителопродуцирующие клетки можно получить из этого животного, используя известные в данной области методы. В некоторых воплощениях поликлональную анти-PTK7 антителосодержащую сыворотку получают посредством обескровливания или умерщвления животного. Сыворотку можно использовать в исследовательских целях в форме, полученной из животного, или, альтернативно, анти-PTK7 антитела могут быть частично или полностью очищены с получением иммуноглобулиновых фракций или гомогенных препаратов антител.

в Моноклональные антитела

В то время как поликлональные антитела могут быть использованы в некоторых аспектах настоящего изобретения, предпочтительные воплощения включают использование PTK7-реакционноспособных моноклональных антител. При использовании здесь, термин "моноклональное антитело" или "mAb" относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, то есть отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных мутаций, например естественных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Таким образом, модификатор "моноклональное" указывает, что антитело по природе не является смесью отдельных антител и может быть использовано вместе с любым типом антитела. В некоторых воплощениях такое моноклональное антитело включает антитело, содержащее полипептидную последовательность, которая связывается или соединяется с PTK7, где PTK7-связывающую полипептидную последовательность получали посредством процесса, включающего селекцию одной связывающей мишень полипептидной последовательности из множества полипептидных последовательностей.

В предпочтительных воплощениях антителопродуцирующие клеточные линии получают из клеток, выделенных из иммунизированного животного. После иммунизации животное умерщвляют и лимфатические узлы и/или В-клетки селезенки иммортализуют хорошо известными в данной области способами, как показано в прилагаемых Примерах. Методы иммортализации клеток включают, без ограничения ими, трансфекцию их онкогенами, инфицирование их онкогенным вирусом и культивирование их в условиях, селетирующих иммортализованные клетки, воздействие на них канцерогенных или мутагенных соединений, слияние их с иммортализованной клеткой, например клеткой миеломы, и инактивацию генов-супрессоров опухолей. При слиянии с клетками миеломы, клетки миеломы предпочтительно не секретируют полипептиды иммуноглобулинов (несекреторная клеточная линия). Как показано в Примерах ниже, иммортализованные клетки можно подвергнуть скринингу с использованием PTK7 (включая выбранные изоформы) или ее иммунореактивного участка. В предпочтительном воплощении первичный скрининг выполняли с использованием иммуноферментного анализа (ELISA) или радиоиммуноанализа.

В общем случае, отдельные моноклональные антитела в соответствии с настоящим изобретением могут быть приготовлены с использованием разнообразных методов, известных в данной области техники, включая гибридомы, рекомбинантные методы, технологии фагового дисплея, дрожжевые библиотеки, трансгенных животных (например, XenoMouse® или HuMAb Mouse®) или их комбинации. Например, моноклональные антитела могут быть получены с использованием метода гибридомы, как в общих чертах описано выше и более подробно в Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling, et al., в: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981), каждый из которых включен в данное описание изобретения. Используя описанные протоколы, антитела предпочтительно генерируют у млекопитающих посредством множества подкожных или внутрибрюшинных инъекций соответствующего антигена и адъюванта. Как обсуждалось ранее, эта иммунизация обычно вызывает иммунный ответ, который включает продукцию антигенреактивных антител (которые могут быть полностью человеческими, если иммунизированное животное является трансгенным) из активированных спленоцитов или лимфоцитов. В то время как полученные антитела могут быть собраны из сыворотки животного с получением поликлональных препаратов, обычно более желательно выделить отдельные лимфоциты из селезенки, лимфатических узлов или периферической крови, чтобы получить гомогенные препараты моноклональных антител. Как правило, лимфоциты получают из селезенки и иммортализуют для получения гибридом.

Например, как описано выше, процесс селекции может заключаться в селекции уникального клона из множества клонов, таких как пул гибридомных клонов, фаговых клонов и рекомбинантных ДНК-клонов. Следует понимать, что выбранная PTK7-связывающаяся последовательность может быть дополнительно изменена, например с целью улучшения аффинности к мишени, гуманизации мишеньсвязывающей последовательности, улучшения ее продуцирования в клеточной культуре, снижения ее иммуногенности in vivo, создания полиспецифического антитела и т.д., и что антитело, содержащее измененную мишеньсвязывающую последовательность, также представляет собой моноклональное антитело по данному изобретению. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно включают отдельные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело препарата моноклонального антитела направлено против одной детерминанты на антигене. В дополнение к их специфичности, преимуществом препаратов моноклональных антител является то, что они, как правило, не загрязнены другими иммуноглобулинами, которые могут обладать перекрестной реакционной способностью.

г. Химерные антитела

В другом воплощении антитело по изобретению может содержать химерные антитела, полученные из ковалентно связанных сегментов белка из по меньшей мере двух разных видов или типов антител. Следует понимать, что при использовании здесь термин "химерные антитела" относится к конструкциям, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, происходящих из определенных видов или принадлежащих конкретному классу или подклассу антител, тогда как остальная часть цепи(ей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, происходящих из других видов или принадлежащих другому классу или подклассу антител, а также к фрагментам таких антител, при условии, что они проявляют нужную биологическую активность (патент США 4816567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). В одном типичном воплощении химерное антитело согласно данному изобретению может содержать мышиные аминокислотные последовательности VH и VL и константные участки, происходящие из человека. В других совместимых воплощениях химерное антитело по настоящему изобретению может содержать CDR-привитое или гуманизированное антитело, как описано ниже.

Как правило, целью создания химерного антитела является создание химеры, в которой количество аминокислот от предполагаемого вида является максимальным. Одним примером является CDR-привитое антитело, в котором антитело содержит одну или более областей, определяющих комплементарность (CDR), из конкретных видов или принадлежащих конкретному классу или подклассу антител, в то время как остальная часть цепи(ей) антител(а) является/являются идентичной(ыми) или гомологичной(ыми) соответствующей последовательности антител, происходящих из других видов или принадлежащих другому классу или подклассу антител. Для применения у людей, вариабельную область или выбранные CDR из антитела грызуна часто прививают в антитело человека, заменяя природные вариабельные области или CDR человеческого антитела. Преимуществами этих конструкций, как правило, является обеспечение полной силы модуляторный функций (например, CDC, ADCC и т.д.) при одновременном снижении нежелательных иммунных ответов на антитело у субъекта.

д. Гуманизированные антитела

Гуманизированное антитело аналогично CDR-привитому антителу. Как правило, гуманизированное антитело получают из моноклонального антитела, изначально образованного у животного, не являющегося человеком. При использовании здесь, гуманизированные формы нечеловеческих (например, мышиных) антител представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, происходящую из нечеловеческого иммуноглобулина. В одном воплощении гуманизированное антитело представляет собой человеческий иммуноглобулин (реципиентное или акцепторное антитело), в котором остатки из CDR реципиентного антитела замещены остатками из CDR нечеловеческих видов (донорное антитело), таких как мышь, крыса, кролик или примат, не являющийся человеком, имеющих нужную специфичность, аффинность и/или активность.

Как правило, гуманизация антитела включает анализ гомологии последовательностей и канонических структур как донорного, так и реципиентного антитела. В выбранных воплощениях реципиентное антитело может содержать консенсусные последовательности. Чтобы создать консенсусные человеческие каркасы, каркасы из нескольких аминокислотных последовательностей человеческой тяжелой цепи или легкой цепи могут быть выравнены, чтобы идентифицировать консенсусную аминокислотную последовательность. Кроме того, во многих случаях один или более каркасных остатков в вариабельном домене человеческого иммуноглобулина замещены соответствующими нечеловеческими остатками из донорного антитела. Эти каркасные замещения определяют методами, хорошо известными в данной области техники, например путем моделирования взаимодействий CDR и каркасных остатков для идентификации каркасных остатков, важных для связывания антигена, и сравнения последовательности для идентификации необычных каркасных остатков в конкретных положениях. Такие замещения помогают поддерживать подходящую трехмерную конфигурацию привитого(ых) CDR и часто улучшают множество показателей по сравнению с аналогичными конструкциями без замещений в каркасе. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не встречаются в реципиентном антителе или в донорном антителе. Эти модификации могут быть сделаны, чтобы дополнительно улучшить эффективность антител с использованием хорошо известных методов.

CDR-привитые и гуманизированные антитела описаны, например, в патентах США 6180370, 5693762, 5693761, 5585089 и 5530101. В общем случае, гуманизированное антитело содержит по существу все из по меньшей мере одного и обычно двух вариабельных доменов, где все или по существу все CDR соответствуют CDR нечеловеческого иммуноглобулина, и все или по существу все каркасные участки являются каркасными участками последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело возможно также содержит по меньшей мере часть константного участка иммуноглобулина (Fe), обычно человеческого иммуноглобулина. Более подробно см., например, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992). См. также, например, Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23: 1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5: 428-433 (1994); и патенты США 6982321 и 7087409. Еще один способ называется гуманиринг (humaneering) и описан, например, в патенте США 2005/0008625. В контексте настоящей заявки термин "гуманизированные антитела" включает CDR-привитые антитела (то есть человеческие антитела, содержащие одну или более привитую нечеловеческую CDR) без замещений в каркасе или с минимальными замещениями в каркасе.

Дополнительно, нечеловеческое анти-EFNA антитело также может быть модифицировано посредством специфической делеции эпитопов человеческих Т-клеток или деиммунизации способами, раскрытыми в WO 98/52976 и WO 00/34317. В кратком изложении, вариабельные области тяжелой и легкой цепи антитела можно проанализировать в отношении пептидов, которые связываются с MHC (главный комплекс гистосовместимости) класса II; эти пептиды представляют собой потенциальные эпитопы Т-клеток (как определено в WO 98/52976 и WO 00/34317). Для обнаружения потенциальных эпитопов Т-клеток можно применить подход с использованием компьютерного моделирования, называемый «методом протягивания пептида", а также в базе данных пептидов, связывающих человеческий МНС класса II, можно искать мотивы, присутствующие в последовательностях VH и VL, как описано в WO 98/52976 и WO 00/34317. Эти мотивы связываются с любым из 18 основных DR-аллотипов MHC класса II и, таким образом, образуют потенциальные эпитопы Т-клеток. Обнаруженные потенциальные эпитопы Т-клеток могут быть удалены путем замещения небольших количеств аминокислотных остатков в вариабельных областях или посредством единичных аминокислотных замен. Если возможно, осуществляют консервативные замены. Часто, но не исключительно, можно использовать аминокислоты, свойственные для этого положения в последовательностях антитела зародышевой линии человека. После идентификации деиммунизирующих изменений можно сконструировать нуклеиновые кислоты, кодирующие VH и VL, посредством мутагенеза или других синтетических методов (например, синтеза de novo, замещения кассет и так далее). Мутагенизированные вариабельные последовательности возможно могут быть слиты с человеческим константным участком.

В выбранных воплощениях по меньшей мере 60%, 65%, 70%, 75% или 80% остатков вариабельной области гуманизированного антитела соответствуют остаткам родительских последовательностей каркасного участка (FR) и CDR. В других воплощениях по меньшей мере 85% или 90% остатков гуманизированного антитела соответствуют остаткам родительских последовательностей каркасного участка (FR) и CDR. В еще одном предпочтительном воплощении более чем 95% остатков гуманизированного антитела соответствуют остаткам родительских последовательностей каркасного участка (FR) и CDR.

Гуманизированные антитела могут быть изготовлены с использованием обычных методов молекулярной биологии и биомолекулярной инженерии, как описано здесь. Эти методы включают выделение, обработку и экспрессию нуклеиновокислотных последовательностей, которые кодируют все или часть вариабельных областей Fv иммуноглобулина по меньшей мере из одной тяжелой или легкой цепи. Источники таких нуклеиновых кислот хорошо известны специалистам в данной области и могут быть получены, например, из гибридомы, эукариотической клетки или фага, продуцирующих антитело или иммунореактивный фрагмент против определенной мишени, как описано выше, из генов иммуноглобулина зародышевой линии или из синтетических конструкций. Рекомбинантная ДНК, кодирующая гуманизированное антитело, затем может быть клонирована в подходящий экспрессирующий вектор.

Последовательности зародышевой линии человека, например, раскрыты в Tomlinson, I. A. et al. (1992) J. Mol. Biol. 227: 776-798; Cook, G. P. et al. (1995) Immunol. Today 16: 237-242; Chothia, D. et al. (1992) J. Mol. Bio. 227:799-817; и Tomlinson et al. (1995) EMBO J 14:4628-4638. Каталог V BASE предоставляет собой полный каталог последовательностей вариабельной области человеческого иммуноглобулина (см. Retter et al., (2005) Nuc Acid Res 33: 671-674). Эти последовательности можно использовать в качестве источника человеческих последовательностей, например каркасных участков и CDR. Как указано здесь, также можно использовать консенсусные человеческие каркасные участки, например, как описано в патенте США 6300064.

е. Человеческие антитела

Специалистам в данной области понятно, что, в дополнение к вышеупомянутым антителам, антитела по настоящему изобретению могут включать полностью человеческие антитела. В контексте настоящей заявки термин "человеческое антитело" включает антитело, которое имеет аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности антитела, продуцируемого человеком, и/или было изготовлено с использованием любого из методов изготовления человеческих антител, как описано здесь. Данное определение человеческого антитела, в частности, исключает гуманизированное антитело, содержащее нечеловеческие антигенсвязывающие остатки.

Человеческие антитела можно получить с использованием различных методов, известных в данной области. Как упоминалось выше, можно использовать методы фагового дисплея для обеспечения иммуноактивных связывающих областей в соответствии с настоящим описанием. Таким образом, в некоторых воплощениях изобретения предложены способы получения анти-PTK7 антител или их антигенсвязывающих участков, включающие стадии синтеза библиотеки антител (предпочтительно человеческих) на фаге, скрининга этой библиотеки с помощью выбранной PTK7 или ее антителосвязывающего участка, выделения фага, связывающего PTK7, и получения иммунореактивных фрагментов из фага. В качестве примера один способ получения библиотеки антител для применения в методах фагового дисплея включает стадии иммунизации животных, не являющихся человеком, содержащих локус человеческого или нечеловеческого иммуноглобулина, выбранной PTK7 или ее антигенным участком для получения иммунного ответа, выделение антителопродуцирующих клеток из иммунизированного животного; выделение РНК, кодирующей тяжелые и легкие цепи антитела по изобретению из выделенных клеток, обратное транскрибирование РНК с получением кДНК, амплификация кДНК с использованием праймеров, и вставка кДНК в вектор для фагового дисплея таким образом, чтобы антитела экспрессировались на фаге. Более конкретно, ДНК, кодирующую домены VH и VL, рекомбинируют с линкером scFv посредством PCR и клонируют в фагмидный вектор (например, pCANTAB 6 или pComb 3 HSS). Затем этот вектор может быть подвергнут электропорации в E.coli, после чего E.coli инфицируют хелперным фагом. Используемый в данных способах фаг, как правило, представляет собой нитчатый фаг, включающий fd и M13, а домены VH и VL обычно рекомбинантно слиты либо с фаговым геном III, либо с геном VIII.

Рекомбинантные человеческие анти-PTK7 антитела по изобретению могут быть выделены посредством скрининга библиотеки рекомбинантных комбинаторных антител, полученной как описано выше. В предпочтительном воплощении эта библиотека представляет собой библиотеку scFv-фагового дисплея, полученную с использованием человеческих VL и VH кДНК, полученных из мРНК, выделенных из В-клеток. Методы получения и скрининга таких библиотек хорошо известны в данной области и наборы для создания библиотек фагового дисплея имеются в продаже (например, the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, номер по каталогу 27-9400-01; и Stratagene SurfZAP™ phage display kit, номер по каталогу 240612). Имеются также другие методы и реагенты, которые можно использовать в создании и скрининге библиотек дисплея антител (см., например, патент США 5223409; публикации РСТ WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; Fuchs et al., Bio/Technology 9: 1370-1372 (1991); Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81-85 (1992); Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989); McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990); Griffiths et al., EMBO J. 12: 725-734 (1993); Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226: 889-896 (1992); Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3576-3580 (1992); Garrad et al., Bio/Technology 9: 1373-1377 (1991); Hoogenboom et al., Nue. Acid Res. 19: 4133-4137 (1991); и Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982 (1991).

Антитела, продуцируемые интактными библиотеками (природными или синтетическими), могут обладать умеренной аффинностью (Ka примерно от 106 до 107 М-1), но созревание аффинности также можно имитировать in vitro путем конструирования и повторной селекции из вторичных библиотек, как описано в данной области техники. Например, мутация может быть введена случайным образом in vitro посредством применения допускающей ошибки полимеразы (как сообщается в Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989)) в способе Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992) или в способе Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3576-3580 (1992). Дополнительно, созревание аффинности может быть выполнено посредством случайных мутаций одного или более CDR, например с использованием PCR с праймерами, имеющими произвольные последовательности, охватывающие представляющий интерес CDR, в выбранных отдельных Fv клонах, и скрининга клонов с высокой аффинностью. В WO 9607754 описан способ индукции мутагенеза в области, определяющей комплементарность, легкой цепи иммуноглобулина для создания библиотеки генов легкой цепи. Другой эффективный подход состоит в рекомбинации доменов VH или VL, выбранных посредством фагового дисплея, с репертуарами природных вариантов домена V, полученных из неиммунизированных доноров, и скрининге на более высокую аффинность в нескольких раундах реорганизации цепи, как описано в Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992). Этот метод позволяет получать антитела и фрагменты антител с константой диссоциации Kd (koff/kon) примерно 10-9 M или менее.

Кроме того, следует понимать, что можно использовать аналогичные методики с применением библиотек, содержащих эукариотические клетки (например, дрожжи), которые экспрессируют связывающие пары на своей поверхности. Как и в методе фагового дисплея, эукариотические библиотеки подвергают скринингу в отношении интересующего антигена (то есть PTK7) и выделяют и клонируют клетки, экспрессирующие кандидатсвязывающие пары. Могут быть выполнены стадии оптимизации содержания библиотеки и созревания аффинности реактивных связывающих пар. См., например, патент США 7700302 и заявку 12/404059. В одном воплощении человеческое антитело выбирают из фаговой библиотеки, где фаговая библиотека экспрессирует человеческие антитела (Vaughan et al. Nature Biotechnology 14: 309-314 (1996): Sheets et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 6157-6162 (1998)); Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol, 222: 581 (1991)). В других воплощениях человеческие связывающие пары могут быть выделены из библиотек комбинаторных антител, образованных в эукариотических клетках, таких как дрожжи. См. например, патент США 7700302. Такие методы, предпочтительно, позволяют осуществить скрининг большого числа кандидатов-модуляторов и обеспечивают относительно легкую обработку последовательностей кандидатов (например, посредством созревания аффинности или рекомбинантных перегруппировок).

Человеческие антитела также могут быть получены путем введения локуса человеческого иммуноглобулина трансгенным животным, например мышам, у которых эндогенные гены иммуноглобулина частично или полностью инактивированы. При введении наблюдается продуцирование человеческого антитела, которое во всех отношениях очень близко напоминает наблюдаемое у людей, в том числе перегруппировку и сборку генов, и репертуар антител. Такой подход описан, например, в патентах США 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5661016, а также 6075181 и 6150584, рассматривающих Xenomouse® технологию, наряду со следующими научными публикациями: Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995). Альтернативно, человеческое антитело может быть получено посредством иммунизации человеческих В-лимфоцитов, продуцирующих антитела, направленные против целевого антигена (такие В-лимфоциты могут быть извлечены из субъекта, страдающего опухолевым заболеванием, или могут быть иммунизированы in vitro). См., например, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol, 147 (1): 86-95 (1991); и патент США 5750373.

VI. Характеристики антител

Независимо от того, как он получены, и какую из вышеупомянутых форм принимает антительный модулятор (например, гуманизированный, человеческий и т.д.), предпочтительные воплощения раскрытых модуляторов могут обладать различными характеристиками. В связи с этим, анти-PTK7 антителопродуцирующие клетки (например, гибридомы или дрожжевые колонии) могут быть отобраны, клонированы и дополнительно подвергнуты скринингу в отношении нужных характеристик, включающих, например, устойчивый рост, высокий уровень продуцирования антител и, как описано более подробно ниже, желательные свойства антител. Гибридомы могут быть размножены in vivo в сингенных животных, в животных, лишенных иммунной системы, например бестимусных мышах, или в культуре клеток in vitro. Методы селекции, клонирования и размножения гибридом и/или колоний, каждая из которых продуцирует отдельный вид антител, хорошо известны специалистам в данной области техники.

а. Нейтрализирующие антитела

В особенно предпочтительных воплощениях модуляторы по настоящему изобретению включают нейтрализирующие антитела или их производные или фрагменты. Термин "нейтрализирующее антитело" или "нейтрализирующий антагонист" относится к антителу или антагонисту, который связывается или взаимодействует с молекулой PTK7 и препятствует связыванию или ассоциации лиганда с любым связывающим партнером, прерывая таким образом биологический ответ (например, фосфорилирование или VEGF-индуцированный ангиогенез), который в противном случае будет иметь место при взаимодействии молекул. При оценке связывания и специфичности антитела или его иммунологически функционального фрагмента или производного, антитело или фрагмент будет по существу ингибировать связывание лиганда с его связывающим партнером или субстратом, когда избыток антитела снижает количество связывающего партнера, соединенного с целевой молекулой, по меньшей мере примерно на 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% или более при измерении, например, с помощью фосфорилирования или выбранных субстратов (Shin et al, Biochem and Biophys Res Com, Vol. 371: 4) или в in vitro конкурентном связывающем анализе. В случае антител к PTK7, например, нейтрализующее антитело или антагонист предпочтительно ослабляет способность к фосфорилированию PTK7 в отношении специфического субстрата по меньшей мере примерно на 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% или более. Следует иметь в виду, что эту уменьшенную активность можно измерить непосредственно, используя известные в данной области техники методы, или можно измерить по влиянию, которое такое уменьшение оказывает на вторичные активности, такие как ангиогенез.

б. Интернализированные антитела

Хотя данные показывают, что PTK7 или его выбранные изоформы могут присутствовать в растворимой форме, по меньшей мере некоторые PTK7 вероятно остаются в ассоциации с клеточной поверхностью, тем самым обеспечивая возможность интернализации раскрытых модуляторов. Соответственно, анти-PTK7 антитела по настоящему изобретению могут быть интернализованы, по меньшей мере до некоторой степени, клетками, которые экспрессируют PTK7. Например, анти-PTK7 антитело, которое связывается с PTK7 на поверхности опухоль-инициирующей клетки, может быть интернализовано опухоль-инициирующей клеткой. В особенно предпочтительных воплощениях такие анти-PTK7 антитела могут быть соединены или конъюгированы с противораковыми агентами, такими как цитотоксические группировки, которые убивают клетки при интернализации.

При использовании здесь, интернализованное анти-PTK7 антитело представляет собой антитело, захваченное клеткой при связывании с PTK7, соединенной с клеткой млекопитающего. Интернализованное антитело включает фрагменты антитела, человеческое или гуманизированное антитело и конъюгаты антител. Интернализация может происходить in vitro или in vivo. Для терапевтического применения интернализация может происходить in vivo. Количество интернализованых молекул антител может быть достаточным или эффективным для уничтожения PTK7-экспрессирующей клетки, особенно PTK7-экспрессирующей опухоль-инициирующей клетки. В зависимости от активности антитела или конъюгата антитела, в некоторых случаях захват одной молекулы антитела клеткой является достаточным для уничтожения целевой клетки, с которой связывается антитело. Например, некоторые токсины являются высокоактивными в уничтожении, так что интернализация одной молекулы токсина, конъюгированной с антителом, является достаточной для уничтожения опухолевой клетки. Интернализуется ли анти-PTK7 антитело при связывании PTK7 с клеткой млекопитающего можно определить с помощью различных анализов, в том числе описанных в Примерах ниже (например, Примеры 12 и 13). Методы обнаружения интернализации антитела клеткой также описаны в патенте США 7619068, который включен в данную заявку посредством ссылки во всей своей полноте.

в. Истощающие антитела

В других предпочтительных воплощениях модуляторы по настоящему изобретению включают истощающие антитела или их производные или фрагменты. Термин "истощающее антитело" относится к антителу или фрагменту, который связывается или соединяется с PTK7 на или около поверхности клетки и индуцирует, стимулирует или вызывает смерть или ликвидацию клетки (например, посредством комплементзависимой цитотоксичности или антителозависимой клеточной цитотоксичности). В некоторых воплощениях, обсуждаемых более подробно ниже, выбранные истощающие антитела соединены или конъюгированы с цитотоксическим агентом. Предпочтительно, истощающее антитело способно удалить, инактивировать, ликвидировать или убить по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% или 99% клеток, поддерживающих опухоль, в определенной клеточной популяции. В некоторых воплощениях клеточная популяция может содержать обогащенные, разделенные, очищенные или выделенные клетки, поддерживающие опухоль. В других воплощениях клеточная популяция может содержать образцы целой опухоли или экстракты гетерогенной опухоли, которые содержат клетки, поддерживающие опухоль. Специалистам в данной области понятно, что стандартные биохимические методы, как описано в Примерах ниже (например, в Примерах 13 и 14) можно использовать для мониторинга и количественной оценки истощения онкогенных клеток или клеток, поддерживающих опухоль, согласно данному руководству.

г. Связывание с эпитопом

Кроме того, следует иметь в виду, что раскрытые анти-PTK7 антитела будут вступать в ассоциацию или связываться с отдельными эпитопами или детерминантами, представленными выбранной(ыми) мишенью(ями). При использовании здесь, термин "эпитоп" относится к той части антигена-мишени, который может распознаваться и специфически связываться конкретным антителом. Когда антиген представляет собой полипептид, такой как PTK7, эпитопы могут быть сформированы как соседними аминокислотами, так и несоседними аминокислотами, которые стали соседними посредством третичного складывания белка. Эпитопы, образованные соседними аминокислотами, как правило, сохраняются при денатурации белка, в то время как эпитопы, образованные в результате третичного складывания, обычно теряются при денатурации белка. Эпитоп, как правило, включает по меньшей мере 3, а еще чаще по меньшей мере 5 или 8-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Более конкретно, специалисту понятно, что термин "эпитоп" включает любую белковую детерминанту, способную к специфическому связыванию с иммуноглобулином или Т-клеточным рецептором, или к иному взаимодействию с молекулой. Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты, или углеводы, или боковые цепи Сахаров, и обычно имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические зарядные характеристики. Кроме того, эпитоп может быть линейным или конформационным. В линейном эпитопе все точки взаимодействия между белком и взаимодействующей молекулой (например, антителом) расположены линейно вдоль первичной аминокислотной последовательности белка. В конформационном эпитопе точки взаимодействие расположены на аминокислотных остатках в белке, которые линейно отделены друг от друга.

Если нужный эпитоп на антигене определен, можно создать антитела к этому эпитопу, например путем иммунизации пептидом, содержащим этот эпитоп, с использованием методов, описанных в настоящем изобретении. Альтернативно, в процессе поиска, создание и характеристика антител может дать информацию о нужных эпитопах. На основании этой информации затем можно конкурентно отбирать антитела на связывание с этим же эпитопом. Подход к достижению этого заключается в проведении конкурентных исследований для обнаружения антител, которые конкурентно связываются друг с другом, то есть антител, конкурирующих за связывание с антигеном. Высокопроизводительный процесс сортировки антител, основанный на их перекрестной конкуренции, описан в WO 03/48731.

При использовании здесь термин "сортировка" относится к способу группировки антител на основании их антигенсвязывающих характеристик. Оценка групп является в некоторой степени произвольной, зависящей от того, насколько различаются наблюдаемые связывающие партнеры тестируемых антител. Таким образом, в то время как данный метод является полезным инструментом классификации антител по настоящему изобретению, группы не всегда прямо коррелируют с эпитопами и такие первоначальные результаты определения следует дополнительно подтвердить другими известными в данной области методами.

С такой оговоркой можно определить, связывается выбранное первичное антитело (или его фрагмент) с тем же эпитопом или перекрестно конкурирует за связывание со вторым антителом, посредством использования методов, известных в данной области и изложенных здесь в Примерах. В одном воплощении первичному антителу по изобретению позволяют связываться с PTK7 в насыщающих условиях и затем измеряют способность вторичных антител связываться с PTK7. Если тестируемое антитело способно связываться с PTK7 одновременно с первичным анти-PTK7 антителом, тогда вторичное антитело связывается с другим эпитопом, чем первичное антитело. Однако, если вторичное антитело не способно связываться с PTK7 одновременно с первичным антителом, тогда вторичное антитело связывается с тем же самым эпитопом, перекрывающимся эпитопом или эпитопом, который находится в непосредственной близости от эпитопа, связанного с первичным антителом. Как известно в данной области техники и подробно описано в Примерах ниже, необходимые данные могут быть получены с использованием твердофазного прямого или непрямого радиоиммунологического анализа (RIA), твердофазного прямого или непрямого иммуноферментного анализа (EIA), конкурентного сэндвич-анализа, системы Biacore™ (то есть поверхностного плазмонного резонанса - GE Healthcare), анализатора ForteBio® (то есть двухполосной интерферометрии - ForteBio, Inc.) или метода проточной цитометрии. Термин "поверхностный плазмонный резонанс", при использовании здесь, относится к оптическому явлению, которое позволяет проводить анализ специфических взаимодействий в режиме реального времени путем обнаружения изменений концентраций белка на биосенсоре матрицы. В особенно предпочтительном воплощении анализ выполняют с использованием аппаратов Biacore или ForteBio, как показано в Примерах ниже.

Термин "конкурировать" при использовании в контексте антител означает конкуренцию между антителами, определенную посредством анализа, в котором тестируемое антитело или иммунологически функциональный фрагмент предупреждает или ингибирует специфическое связывание контрольного антитела с общим антигеном. Как правило, такой анализ включает использование очищенного антигена, связанного с твердой поверхностью, или клеток, несущих либо немеченый тестируемый иммуноглобулин, либо меченый контрольный иммуноглобулин. Конкурентное ингибирование измеряют путем определения количества метки, связанной с твердой поверхностью или клетками в присутствии тестируемого иммуноглобулина. Обычно тестируемый иммуноглобулин присутствует в избытке. Антитела, идентифицированные посредством конкурентного анализа (конкурирующие антитела), включают антитела, связывающиеся с тем же эпитопом, что и контрольное антитело, и антитела, связывающиеся с соседним эпитопом, расположенным достаточно близко к эпитопу, связанному контрольным антителом, для того чтобы имело место пространственное затруднение. Дополнительные подробности методов определения конкурентного связывания приведены здесь в Примерах. Обычно, когда конкурирующее антитело присутствует в избытке, оно ингибирует специфическое связывание контрольного антитела с общим антигеном по меньшей мере на 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% или 75%. В некоторых случаях связывание ингибируется по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95% или 97% или более.

Кроме эпитопной специфичности раскрытые антитела могут быть охарактеризованы с использованием ряда разных физических характеристик, включающих, например, аффинности связывания, температуру плавления (Tm) и изоэлектрические точки.

д. Аффинность связывания

В связи с этим настоящее изобретение также охватывает применение антител, которые имеют высокую аффинность связывания с выбранным PTK7 или, в случае пан-антител, более чем с одним типом PTK7. Считается, что антитело по изобретению специфически связывается со своим целевым антигеном, когда константа диссоциации Kd (koff/kon) составляет ≤10-8 М. Антитело специфически связывается с антигеном с высокой аффинностью, когда Kd составляет ≤5×10-9 М и с очень высокой аффинностью, когда Kd составляет ≤5×10-10 М. В одном воплощении изобретения антитело имеет Kd≤10-9 М и скорость диссоциации составляет примерно 1×10-4/ сек. В одном воплощении изобретения скорость диссоциации составляет <1×10-5/сек. В других воплощениях изобретения антитела связываются с PTK7 с Kd между примерно 10-8 М и 10-10 М, а в еще одном воплощении они связываются с Kd≤2×10-10 М. Другие выбранные воплощения настоящего изобретения включают антитела, которые имеют константу диссоциации или Kd (koff/kon) менее 10-2 М, менее 5×10-2 М, менее 10-3 М, менее 5×10-3 М, менее 10-4 М, менее 5×10-4 М, менее 10-5 М, менее 5×10-5 М, менее 10-6 М, менее 5×10-6 М, менее 10-7 М, менее 5×10-7 М, менее 10-8 М, менее 5×10-8 М, менее 10-9 М, менее 5×10-9 М, менее 10-10 М, менее 5×10-10 М, менее 10-11 М, менее 5×10-11 М, менее 10-12 М, менее 5×10-12 М, менее 10-13 М, менее 5×10-13 М, менее 10-14 М, менее 5×10-14 М, менее 10-15 М или менее 5×10-15 М.

В конкретных воплощениях антитело по изобретению, которое иммуноспецифически связывается с PTK7, имеет константу скорости ассоциации или скорость kon по меньшей мере 105 М-1 с-1, по меньшей мере 2×105 М-1 с-1, по меньшей мере 5×105 М-1 сек-1, по меньшей мере 106 М-1 с-1, по меньшей мере 5×106 М-1 с-1, по меньшей мере 107 М-1 с-1, по меньшей мере 5×107 М-1 с-1 или по меньшей мере 108 М-1 сек-1.

В другом воплощении антитело по изобретению, которое иммуноспецифически связывается с PTK7 имеет константу скорости диссоциации или скорость kon менее 10-1 с-1, менее 5×10-1 с-1, менее 10-2 с-1, менее 5×10-2 с-1, менее 10-3 с-1, менее 5×10-3 с-1, менее 10-4 с-1, менее 5×10-4 с-1, менее 10-5 с-1, менее 5×10-5 с-1, менее 10-6 с-1 менее 5×10-6 с-1, менее 10-7 с-1, менее 5×10-7 с-1, менее 10-8 с-1, менее 5×10-8 с-1, менее 10-9 с-1, менее 5×10-9 с-1 или менее 10-10 с-1.

В других выбранных воплощениях настоящего изобретения анти-PTK7 антитела имеют константу аффинности или Ka (kon/koff) по меньшей мере 102 М-1, по меньшей мере 5×102 М-1, по меньшей мере 103 М-1, по меньшей мере 5×103 М-1, по меньшей мере 104 М-1, по меньшей мере 5×104 М-1 по меньшей мере 105 М-1, по меньшей мере 5×105 М-1 по меньшей мере 106 М-1, по меньшей мере 5×106 М-1, по меньшей мере 107 М-1, по меньшей мере 5×107 М-1, по меньшей мере 108 М-1, по меньшей мере 5×108 М-1 по меньшей мере 109 М-1, по меньшей мере 5×109 М-1, по меньшей мере 1010 М-1, по меньшей мере 5×1010 М-1, по меньшей мере 1011 М-1, по меньшей мере 5×1011 М-1 по меньшей мере 1012 М-1, по меньшей мере 5×1012 М-1, по меньшей мере 1013 М-1 по меньшей мере 5×1013 М-1, по меньшей мере 1014 М-1 по меньшей мере 5×1014 М-1, по меньшей мере 1015 М-1 или по меньшей мере 5×1015 М-1.

е. Изоэлектрические точки

В дополнение к вышеупомянутым связывающим свойствам, анти-PTK7 антитела и их фрагменты, подобно всем полипептидам, имеют изоэлектрическую точку (pI), которую обычно определяют как pH, при котором полипептид не несет суммарного заряда. В данной области техники известно, что растворимость белка обычно является самой низкой при pH раствора, равном изоэлектрической точке (pI) этого белка. Таким образом, можно оптимизировать растворимость путем изменения количества и локализации ионизируемых остатков в антителе для корректировки pI. Например, на pI полипептида можно влиять посредством осуществления подходящих аминокислотных замен (например, путем замены заряженной аминокислоты, такой как лизин, на незаряженный остаток, такой как аланин). Без привязки к какой-либо конкретной теории, аминокислотные замены в антителе, которые приводят к изменению pI указанного антитела, могут улучшать растворимость и/или стабильность этого антитела. Специалисту в данной области понятно, какие аминокислотные замещения будут наиболее подходящими для конкретного антитела для достижения нужной pI.

pI белка может быть определена различными способами, включая, но не ограничиваясь ими, изоэлектрическую фокусировку и различные компьютерные алгоритмы (см., например Bjellqvist et al., 1993, Electrophoresis 14: 1023). В одном воплощении pI анти-PTK7 антител по изобретению находится между или является выше, чем примерно 6,5, примерно 7,0, примерно 7,5, примерно 8,0, примерно 8,5, или примерно 9,0. В другом воплощении pI анти-PTK7 антител по изобретению находится между или является выше, чем 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, или 9,0. В еще одном воплощении, замены, приводящие к изменениям PI антител по изобретению, не уменьшают значительно их аффинность связывания с PTK7. Как описано более подробно ниже, конкретно предусмотрено, что замещение(я) Fc-участка, которое(ые) приводит(ят) к изменению связывания с FcγR, также может(ут) привести к изменению pI. В предпочтительном воплощении замещение(я) Fc-участка специально выбрано(ы) так, чтобы осуществлять и желательное изменение FcγR-связывания, и любое желательное изменение pI. При использовании здесь, значение pI определяют как pI преобладающей заряженной формы.

ж. Термическая стабильность

Также следует понимать, что Tm Fab-домена антитела может служить хорошим индикатором термической стабильности антитела и может дополнительно служить показателем срока годности. Tm представляет собой температуру 50%-ного разворачивания для данного домена или последовательности. Более низкая Tm указывает на большее агрегирование/меньшую стабильность, в то время как более высокая Tm указывает на меньшее агрегирование/большую стабильность. Таким образом, антитела или фрагменты или производные, имеющие высокую Tm, являются предпочтительными. Кроме того, используя признанные в данной области методы, можно изменить композицию антиPTK7 антител или их доменов, чтобы увеличить или оптимизировать молекулярную стабильность. См., например, патент США 7960142. Таким образом, в одном воплощении, Fab-домен выбранного антитела имеет значение Tm выше, чем по меньшей мере 50°C, 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C, 80°C, 85°C, 90°C, 95°C, 100°C, 105°C, 110°C, 115°C или 120°C. В другом воплощении, Fab-домен антитела имеет значение Tm выше, чем по меньшей мере примерно 50°C, примерно 55°C, примерно 60°C, примерно 65°C, примерно 70°C, примерно 75°C, примерно 80°C, примерно 85°C, примерно 90°C, примерно 95°C, примерно 100°C, примерно 105°C, примерно 110°C, примерно 115°C или примерно 120°C. Температуры термического плавления (Tm) белкового домена (например, домена Fab) могут быть измерены с использованием любого стандартного метода, известного в данной области техники, например посредством дифференциальной сканирующей калориметрии (см., например, Vermeer et al., 2000, Biophys. J. 78: 394-404; Vermeer et al., 2000, Biophys. J. 79: 2150-2154, обе включены в данное описание изобретения посредством ссылки).

VII. Фрагменты и производные модулятора PTK7

Независимо от того включают ли агенты по настоящему изобретению интактные слитые конструкции, антитела, фрагменты или производные, выбранные модуляторы будут вступать в реакцию, связываться, объединяться, образовывать комплекс, присоединяться, прикрепляться, смыкаться, взаимодействовать или иным образом вступать в ассоциацию с PTK7 и тем самым обеспечивать нужные противоопухолевые эффекты. Специалистам в данной области понятно, что модуляторы, включающие анти-PTK7 антитела, взаимодействуют или вступают в ассоциацию с PTK7 посредством одного или более связывающих сайтов, экспрессируемых на антителе. Более конкретно, при использовании здесь, термин "связывающий сайт" включает участок полипептида, которая отвечает за селективное связывание с целевой молекулой, представляющей интерес (например, ферментом, антигеном, лигандом, рецептором, субстратом или ингибитором). Связывающие домены содержат по меньшей мере один связывающий сайт (например, интактное антитело IgG имеет два связывающих домена и два связывающих сайта). Типичные связывающие домены включают вариабельный домен антитела, рецептор-связывающий домен лиганда, лигандсвязывающий домен рецептора или ферментативный домен. В контексте настоящего изобретения типичный активный участок PTK7 (например, часть слитой конструкции Fc-PTK7) может содержать сайт связывания с субстратом или способствовать фосфорилированию.

а. Фрагменты

Независимо от того, какая форма модулятора (например, химерная, гуманизированная и т.д.) выбрана для осуществления изобретения на практике, следует понимать, что его иммунореактивные фрагменты можно использовать в соответствии с данным руководством. В самом широком смысле термин "фрагмент антитела" включает по меньшей мере часть интактного антитела (например, природного иммуноглобулина). Более конкретно, термин "фрагмент" относится к части или участку антитела или цепи антитела (или молекулы PTK7 в случае Fc-слияний), содержащей меньше аминокислотных остатков, чем интактное или полное антитело или цепь антитела. Термин "антигенсвязывающий фрагмент" относится к полипептидному фрагменту иммуноглобулина или антитела, который связывается с антигеном или конкурирует с интактным антителом (то есть с интактным антителом, из которого они были получены) за связывание с антигеном (то есть специфическое связывание). При использовании здесь термин "фрагмент молекулы антитела" включает антигенсвязывающие фрагменты антитела, например легкую цепь антитела (VL), тяжелую цепь антитела (VH), одноцепочечное антитело (scFv), фрагмент F(ab')2, фрагмент Fab, фрагмент Fd, фрагмент Fv, фрагменты однодоменного антитела, диатела, линейные антитела, молекулы одноцепочечного антитела и полиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. Аналогичным образом, активный фрагмент PTK7 содержит часть молекулы PTK7, которая сохраняет способность взаимодействовать с субстратами или рецепторами PTK7 и модифицировать их таким же образом, что и интактный PTK7 (например, фосфорилированием - хотя, возможно, с несколько меньшей эффективностью).

Специалистам в данной области понятно, что фрагменты можно получить посредством химической или ферментативной обработки интактного или полного модулятора (например, антитела или цепи антитела) или рекомбинантными способами. В связи с этим, в то время как различные фрагменты антител определены в терминах расщепления интактного антитела, специалисту понятно, что такие фрагменты можно синтезировать de novo либо химически, либо используя методы рекомбинантной ДНК. Таким образом, при использовании здесь, термин "антитело" явным образом включает антитела или их фрагменты или производные, получаемые посредством модификации целых антител или синтезируемые de novo с использованием методов рекомбинантных ДНК.

Более конкретно, в результате расщепления антител папаином получают два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, называемых Fab-фрагментами, каждый из которых имеет один антигенсвязывающий сайт, и остаточный фрагмент Fe, название которого отражает его способность легко кристаллизоваться. В результате обработки пепсином получают фрагмент F(ab')2, который имеет два антигенсвязывающих сайта и все еще способен к перекрестному связыванию антигена. Fab-фрагмент также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (CH1) тяжелой цепи. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов добавлением нескольких остатков на карбоксильном конце CH1-домена тяжелой цепи, включая один или более цистеинов из шарнирной области антитела. Fab'-SH является здесь обозначением Fab', в котором цистеиновый(е) остаток(ки) константных доменов несет(ут) по меньшей мере одну свободную тиольную группу. Фрагменты Р(ab')2-антитела первоначально были получены, как пара фрагментов Fab' с шарнирными цистеинами между ними. Известны также другие химические сочетания фрагментов антител. Более подробное описание других фрагментов антител см., например, в Fundamental Immunology, W.Ε. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1999).

Также следует понимать, что фрагмент Fv представляет собой фрагмент антитела, который содержит полный сайт узнавания и связывания антигена. Эта область состоит из димера вариабельного домена одной тяжелой и одной легкой цепи в близкой ассоциации, которая может быть ковалентной по природе, например в scFv. Именно в этой конфигурации три CDR каждого вариабельного домена взаимодействуют с образованием антигенсвязывающего сайта на поверхности димера VH-VL. Вместе шесть CDR или их подмножество придают антителу антигенсвязывающую специфичность. Однако, даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три CDR, специфичных к антигену) обладает способностью узнавать и связывать антиген, хотя обычно с более низкой аффинностью, чем полный связывающий сайт.

В других воплощениях фрагмент антитела, например, содержащий Fc-участок, сохраняет по меньшей мере одну из биологических функций, обычно ассоциированных с Fc-участком в случае присутствия в интактном антителе, такую как связывание FcRn, модуляция времени полужизни антитела, функция ADCC (антителозависимая клеточная цитотоксичность) и связывание комплемента. В одном воплощении фрагмент антитела является моновалентным антителом, которое имеет время полужизни in vivo по существу аналогичное интактному антителу. Например, такой фрагмент антитела может содержать антигенсвязывающее плечо, соединенное с последовательностью Fe, способной придать фрагменту стабильность in vivo.

б. Производные

В другом воплощении также понятно, что модуляторы по изобретению могут быть моновалентными или поливалентными (например, бивалентными, трехвалентными и т.д.). При использовании здесь, термин "валентность" относится к числу возможных сайтов связывания мишени (то есть PTK7), ассоциированных с антителом. Каждый сайт связывания мишени специфически связывает одну целевую молекулу или конкретное положение или локус на целевой молекуле. Когда антитело по настоящему изобретению содержит более одного сайта связывания мишени (поливалентное антитело), каждый сайт связывания мишени может специфически связывать одинаковые или разные молекулы (например, может связываться с разными лигандами, или разными антигенами, или разными эпитопами или положениями на одном и том же антигене). В контексте настоящего изобретения рассматриваемые антитела предпочтительно имеют по меньшей мере один сайт связывания, специфичный к человеческому PTK7. В одном воплощении антитела по настоящему изобретению являются моновалентными, так что каждый связывающий сайт молекулы специфически связывается с одним положением или эпитопом PTK7. В других воплощениях антитела являются поливалентными, так что они содержат больше одного связывающего сайта, и разные связывающие сайты специфически ассоциируют более чем с одним положением или эпитопом. В таких случаях множественные эпитопы могут присутствовать на выбранном PTK7-полипептиде или сплайс-варианте, или один эпитоп может присутствовать на PTK7 в то время как второй, другой эпитоп может присутствовать на другой молекуле или поверхности. См., например, патент США 2009/0130105.

Как упоминалось выше, поливалентные антитела могут иммуноспецифически связываться с разными эпитопами нужной целевой молекулы или могут иммуноспецифически связываться как с целевой молекулой, так и с гетерологичным эпитопом, таким как гетерологичный полипептид или твердый материал носителя. Хотя предпочтительные воплощения анти-PTK7 антител связывают только два антигена (то есть биспецифические антитела), антитела с дополнительными специфичностями, такие как триспецифические антитела, также охвачены настоящим изобретением. Примеры биспецифических антител включают, без ограничения ими, антитела с одним плечом, направленным против PTK7, и другим плечом, направленным против любого другого антигена (например, модуляторного клеточного маркера). Методы получения биспецифических антител известны в данной области. Традиционное получение полноразмерных биспецифических антител основано на со-экспрессии двух пар тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулина, где две цепи обладают разной специфичностью (Millstein et al., 1983, Nature, 305:537-539). Другие, более сложные, совместимые, полиспецифические конструкции и способы их получения описаны в патенте США 2009/0155255.

В других воплощениях вариабельные домены антитела с нужными специфичностями связывания (сайты объединения антитело-антиген) слиты с последовательностями константного домена иммуноглобулина. Слияние предпочтительно осуществляют с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащим по меньшей мере часть шарнирной области, CH2- и/или CH3-области. В одном примере первая константная область тяжелой цепи (CH1), содержащая сайт, необходимый для связывания с легкой цепью, присутствует по меньшей мере в одном из слияний. ДНК, кодирующие слияния тяжелой цепи иммуноглобулина и, если необходимо, легкой цепи иммуноглобулина, встроены в отдельные экспрессирующие векторы и котрансфецированы в подходящий организм-хозяин. Это обеспечивает большую гибкость в корректировке взаимных соотношений трех полипептидных фрагментов в воплощениях, где неравные соотношения трех полипептидных цепей, используемых в конструкции, обеспечивают оптимальные результаты. Однако можно встраивать кодирующие последовательности для двух или всех трех полипептидных цепей в один экспрессирующий вектор, когда экспрессия по меньшей мере двух полипептидных цепей в равных соотношениях приводит к высоким выходам или когда соотношения не имеют особого значения.

В одном воплощении такого подхода биспецифические антитела состоят из гибридной тяжелой цепи иммуноглобулина с первой специфичностью связывания в одном плече (например, PTK7) и гибридной пары тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулина (представляющей вторую специфичность связывания) в другом плече. Было обнаружено, что ассиметричная структура облегчает отделение нужного биспецифического соединения от нежелательных комбинаций цепей иммуноглобулина, так как присутствие легкой цепи иммуноглобулина только в одной половине биспецифической молекулы обеспечивает легкий способ отделения. Такой подход раскрыт в WO 94/04690. Дополнительные подробности получения биспецифических антител см., например, в Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology, 121:210. Согласно другому подходу, описанному в WO96/27011, можно сконструировать пару молекул антител для максимизации процента гетеродимеров, выделяемых из рекомбинантной клеточной культуры. Предпочтительная поверхность раздела включает по меньшей мере часть домена CH3 константного домена антитела. В данном способе одну или более небольших боковых цепей аминокислот с поверхности раздела первой молекулы антитела заменяют более крупными боковыми цепями (например, тирозином или триптофаном). Компенсационные полости размера, идентичного или аналогичного большой(им) боковой(ым) цепи(ям) создаются на поверхности раздела второй молекулы антитела путем замены больших аминокислотных боковых цепей меньшими (например, аланин или треонин). Это обеспечивает механизм увеличения выхода гетеродимера по сравнению с другими нежелательными конечными продуктами, такими как гомодимеры.

Биспецифические антитела также включают сшитые или гетероконъюгированные антитела. Например, одно из антител в гетероконъюгате может быть связано с авидином, а другое с биотином. Такие антитела, например, предложены для нацеливания клеток иммунной системы на нежелательные клетки (патент США 4676980) и для лечения ВИЧ-инфекции (WO 91/00360, WO 92/200373 и EP 03089). Гетероконъюгированные антитела могут быть получены с использованием любого удобного метода сшивания. Пригодные сшивающие агенты хорошо известны в данной области и раскрыты в патент США 4676980, наряду с рядом сшивающих методик

VIII. Модуляторы PTK7 - Модификации константного участка

а. Fc-участок и Fc-рецепторы

Специалистам в данной области понятно, что в дополнение к различным модификациям, заменам, вставкам или делециям в вариабельной или связывающей области раскрытых модуляторов (например, FC-PTK7 или анти-PTK7 антител), представленных выше, выбранные воплощения настоящего изобретения также могут содержать замещения или модификации константного участка (то есть Fc-участка). В частности, предполагается, что модуляторы PTK7 по изобретению могут содержать, помимо прочего, одну или более дополнительных замен, мутаций и/или модификаций аминокислотных остатков, что приводит к соединению с предпочтительными характеристиками, включающими, без ограничения ими: измененную фармакокинетику, увеличенное времени полужизни в сыворотке, повышенную аффинность связывания, пониженную иммуногенность, повышенное продуцирование, измененное связывание Fc-лиганда, повышенную или пониженную активность ADCC или CDC (комплементзависимая цитотоксичность), измененное гликозилирование и/или дисульфидные связи, и измененная специфичность связывания. В связи с этим следует иметь в виду, что эти Fc-варианты преимущественно могут быть использованы для усиления эффективных противоопухолевых свойств раскрытых модуляторов.

Термин "Fc-участок" используется в данной заявке для обозначения C-концевого участка тяжелой цепи иммуноглобулина, включая Fc-участки с нативной последовательностью и вариантные Fc-участки. Хотя границы Fc-участка тяжелой цепи иммуноглобулина могут варьироваться, Fc-участок тяжелой цепи IgG человека обычно простирается от аминокислотного остатка в положении Cys226 или от Pro230, до его карбоксильного конца. C-концевой лизин (остаток 447 согласно европейской системе нумерации) Fc-участка может быть удален, например в процессе изготовления или очистки антитела или при рекомбинантном конструировании нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь антитела. Соответственно, композиция интактных антител может содержать популяции антител, где все остатки K447 удалены, популяции антител, где остатки K447 не удалены, и популяции антител, имеющие смесь антител с остатком или без остатка K447. Функциональный Fc-участок обладает эффекторной функцией Fc-участка с нативной последовательностью. Типичные эффекторные функции включают связывание C1q; CDC; связывание Fc-рецептора; ADCC; фагоцитоз; уменьшение числа клеточных поверхностных рецепторов (например, B-клеточного рецептора; BCR) и т.д. Для таких эффекторных функций, как правило, требуется, чтобы Fc-участок был объединен со связывающим доменом (например, вариабельным доменом антитела), и они могут быть оценены с помощью различных анализов, как раскрыто, например, в определениях в данном описании.

Fc-рецептор или FcR обозначает рецептор, который связывается с Fc-участком антитела. В некоторых воплощениях FcR представляет собой нативный человеческий FcR. В некоторых воплощениях FcR связывается с IgG антителом (гамма-рецептор) и включает рецепторы подклассов FcγRI, Fc.RM и FcγRIII, в том числе аллельные варианты и альтернативно сплайсированные формы этих рецепторов. Рецепторы FcγII включают FcγRIIA (активирующий рецептор) и FcγRIIB (ингибирующий рецептор), которые имеют аналогичные аминокислотные последовательности, отличающиеся главным образом своими цитоплазматическими доменами. Активирующий рецептор Fey RIIA содержит иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив (ITAM) в своем цитоплазматическом домене. Ингибирующий рецептор FγRIIB содержит иммунорецепторный тирозиновый ингибирующий мотив (ITIM) в своем цитоплазматическом домене (см., например, Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). FcR рассматриваются, например, в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Другие FcR, в том числе те, которые будут идентифицированы в будущем, охвачены здесь термином FcR. Термин Fc-рецептор или FcR также включает неонатальный рецептор, FcRn, который, в некоторых случаях, отвечает за перенос материнских IgG плоду (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)) и регуляцию гомеостаза иммуноглобулинов. Известны методы измерения связывания с FcRn (см., например, Ghetie and Ward., Immunol. Today 18 (12): 592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004); WO 2004/92219 (Hinton et al.).

б. Функции Fc

При использовании здесь "комплементзависимая цитотоксичность" и "CDC" относится к лизису целевой клетки в присутствии комплемента. Путь активации комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с молекулой, например антитела, образующей комплекс с когнатным антигеном. Для оценки активации комплемента можно выполнить анализ CDC, например, как описано в Gazzano-Santoro et al., 1996, J. Immunol. Methods, 202 :163.

Кроме того, антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность или ADCC относится к форме цитотоксичности, при которой секретируемый Ig, связанный с Fc-рецепторами (FcR), присутствующими на некоторых цитотоксических клетках (например, естественных киллерах (NK), нейтрофилах и макрофагах) позволяет этим цитотоксическим эффекторным клеткам специфически связываться с целевой клеткой, несущей антиген, и затем убивать эту целевую клетку цитотоксинами. Специфические высокоаффинные IgG антитела направлены на целевое плечо цитотоксических клеток и абсолютно необходимы для такой гибели. Лизис целевой клетки является внеклеточным, требует непосредственного контакта между клетками и не требует участия комплемента.

Варианты PTK7-модулятора с измененной аффинностью связывания FcR или активностью ADCC обладают либо повышенной, либо ослабленной активностью связывания FcR и/или активностью ADCC по сравнению родительским или немодифицированным антителом или с модулятором, содержащим Fc-участок с нативной последовательностью. Вариант модулятора, который демонстрирует повышенное связывание с FcR, связывается по меньшей мере с одним FcR с лучшей аффинностью, чем родительское или немодифицированное антитело или модулятор, содержащий Fc-участок с нативной последовательностью. Вариант, который демонстрирует уменьшенное связывание с FcR, связывается по меньшей мере с одним FcR с меньшей аффинностью, чем родительское или немодифицированное антитело или модулятор, содержащий Fc-участок с нативной последовательностью. Такие варианты, которые демонстрируют уменьшенное связывание с FcR, могут обладать незначительным связыванием или не иметь существенного связывания с FcR, например 0-20% связывания с FcR по сравнению с нативной последовательностью Fc-участка IgG, например, как определено с помощью хорошо известных в данной области методов.

Что касается FcRn, антитела по настоящему изобретению также содержат или охватывают варианты Fe с модификациями в константном участке, которые обеспечивают время полужизни (например, время полужизни в сыворотке) у млекопитающего, предпочтительно человека, более 5 суток, более 10 суток, более 15 суток, предпочтительно более 20 суток, более 25 суток, более 30 суток, более 35 суток, более 40 суток, более 45 суток, более 2 месяцев, более 3 месяцев, более 4 месяцев или более 5 месяцев. Увеличение времени полужизни антител (или Fc-содержащих молекул) по настоящему изобретению у млекопитающего, предпочтительно человека, приводит к более высокому титру сыворотки указанных антител или фрагментов антител у млекопитающего и, таким образом, снижает частоту введения указанных антител или фрагментов антитела, и/или снижает вводимую концентрацию указанных антител или фрагментов антител. Антитела с увеличенным временем полужизни in vivo можно получить с помощью методов, хорошо известных специалистам в данной области. Например, антитела с увеличенным временем полужизни in vivo можно получить путем модификации (например, замены, делеции или добавления) аминокислотных остатков, которые определены как участвующие во взаимодействие между Fc-доменом и рецептором FcRn (см., например, международную публикацию WO 97/34631; WO 04/029207; патент США 6737056 и патент США 2003/0190311). Связывание с человеческим FcRn in vivo и время полужизни в сыворотке человеческих высокоаффинных FcRn-связывающих полипептидов можно оценить, например, на трансгенных мышах или в трансфицированных клеточных линиях человека, экспрессирующих человеческий FcRn, или на приматах, которым вводят полипептиды с вариантным Fc-участком. В WO 2000/42072 описаны варианты антител с улучшенным или ослабленным связыванием с FcRns. См. также, например, Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001).

в. Модификации гликозилирования

В других воплощениях профили гликозилирования или композиции антител по изобретению являются модифицированными. Более конкретно, предпочтительные воплощения настоящего изобретения могут содержать одну или более сконструированных гликоформ, то есть измененный профиль гликозилирования или измененную композицию углеводов, ковалентно присоединенных к молекуле, содержащей Fc-участок. Сконструированные гликоформы могут быть полезны для различных целей, включая, но не ограничиваясь ими, повышение или снижение эффекторной функции, увеличение аффинности антитела к целевому антигену или облегчение получения антитела. В случаях, когда желательной является пониженная эффекторная функция, следует понимать, что молекула может быть сконструирована для экспрессии в агликозилированной форме. Такие углеводные модификации могут быть выполнены, например, путем изменения одного или более сайтов гликозилирования в последовательности антитела. Это означает, что можно сделать одну или более аминокислотных замен, что приводит к удалению одного или более сайтов гликозилирования вариабельной области каркасного участка, тем самым устраняя гликозилирование в этом сайте (см., например, патенты США 5714350 и 6350861). С другой стороны, повышенные эффекторные функции или улучшенное связывание может быть придано Fc-содержащей молекуле посредством конструирования одного или более дополнительных сайтов гликозилирования.

Дополнительно или альтернативно можно получить вариант Fe, который имеет измененную гликозилированную композицию, например гипофукозилированное антитело, имеющее пониженное количество фукозильных остатков, или антитело, имеющее увеличенные гемисекционные GlcNAc структуры. Было показано, что эти и подобные профили гликозилирования увеличивают ADCC-способность антител.

Сконструированные гликоформы можно получить любым способом, известным специалисту в данной области, например, используя сконструированные штаммы или штаммы, экспрессирующие варианты, посредством коэкспрессии с одним или более ферментами (например, N-ацетилглюкозаминилтрансферазой III (GnTH 1)), посредством экспрессии молекулы, содержащей Fc-участок в различных организмах или клеточных линиях из различных организмов или посредством модификации углевода(ов) после экспрессии молекулы, содержащей Fc-участок. См., например, Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277: 26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17: 176-1, а также европейский патент ЕР 1176195; РСТ публикации WO 03/035835; WO 99/54342, Umana et al, 1999, Nat. Biotechnol 17: 176-180; Davies et al., 20017 Biotechnol Bioeng 74: 288-294; Shields et al, 2002, J Biol Chem 277: 26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278: 3466-3473) патент США 6602684; заявки США 10/277370; 10/113929; РСТ WO 00/61739А1; РСТ WO 01/292246А1; РСТ WO 02/311140А1; РСТ WO 02/30954А1; Potillegent™ технологию (Biowa, Inc.); технологию конструирования гликозилирования GlycoMAb™ (GLYCART biotechnology AG); WO 00061739; EA 01229125; патент США 2003/0115614; Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49.

IX. Экспрессия модулятора

а. Обзор

ДНК, кодирующая нужные модуляторы EFNA, может быть легко выделена и секвенирована с использованием обычных процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антител). Выделенные и субклонированные гибридомные клетки (или колонии, полученные из фагов и дрожжей) могут являться предпочтительным источником такой ДНК, если модулятор представляет собой антитело. Если необходимо, нуклеиновую кислоту можно дополнительно обработать, как описано здесь, для создания агентов, включающих слитые белки или химерные, гуманизированные или полностью человеческие антитела. Более конкретно, выделенную ДНК (которую может быть модифицирована) можно использовать для клонирования последовательностей константной и вариабельной области для получения антител, как описано в патенте США 7709611.

Такой типичный способ предусматривает экстракцию РНК из выбранных клеток, превращение в кДНК, и амплификацию посредством PCR с использованием антителоспецифических праймеров. Подходящие праймеры хорошо известны в данной области и, как приведено в качестве примера в данном описании, легкодоступны из различных коммерческих источников. Следует понимать, что для экспрессии рекомбинантного человеческого или нечеловеческого антитела, выделенного путем скрининга комбинаторной библиотеки, ДНК, кодирующую антитело, клонируют в рекомбинантный экспрессирующий вектор и вводят в клетки-хозяева, включающие клетки млекопитающих, клетки насекомых, клетки растений, дрожжи и бактерии. В других воплощениях модуляторы вводят и экспрессируют при помощи обезьяньих клеток COS (африканской зеленой мартышки), клеток NS0, клеток яичника китайского хомячка (CHO) или клеток миеломы, которые иначе не продуцируют нужную конструкцию. Как обсуждается более подробно ниже, трансформированные клетки, экспрессирующие нужный модулятор, могут быть выращены в относительно больших количествах, чтобы обеспечить клинические и коммерческие поставки слитой конструкции или иммуноглобулина.

Независимо от того, получали или выделяли нуклеиновую кислоту, кодирующую необходимую часть модулятора PTK7, с помощью метода фагового дисплея, из дрожжевых библиотек, с помощью метода, основанного на гибридоме, синтетически или из коммерческих источников, следует понимать, что настоящее изобретение явным образом охватывает молекулы нуклеиновой кислоты и последовательности, кодирующие модуляторы PTK7, включая слитые белки и анти-PTK7 антитела или их антигенсвязывающие фрагменты или производные. Данное изобретение также охватывает нуклеиновые кислоты или молекулы нуклеиновых кислот (например, полинуклеотиды), которые гибридизуются в условиях гибридизации высокой жесткости или, альтернативно, в условиях гибридизации средней или низкой жесткости (например, как определено ниже), с полинуклеотидами, комплементарными нуклеиновым кислотам, имеющим полинуклеотидную последовательность, которая кодирует модулятор по изобретению или его фрагмент или вариант. Термин "молекула нуклеиновой кислоты" или "выделенная молекула нуклеиновой кислоты", используемый здесь, как предполагается, включает по меньшей мере молекулы ДНК и молекулы РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно является двухцепочечной ДНК. Кроме того, настоящее изобретение включает любой носитель или конструкцию, включающую такой полинуклеотид, кодирующий модулятор, включая, без ограничения ими, векторы, плазмиды, клетки-хозяева, космиды или вирусные конструкции.

Термин "выделенная нуклеиновая кислота" означает, что нуклеиновую кислоту (1) амплифицировали in vitro, например посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР), (2) рекомбинантно получали посредством клонирования, (3) очищали, например путем расщепления и гель-электрофоретического фракционирования, или (4) синтезировали, например посредством химического синтеза. Выделенная нуклеиновая кислота представляет собой нуклеиновую кислоту, которая подходит для обработки методами рекомбинантной ДНК.

Более конкретно также предложены нуклеиновые кислоты, которые кодируют модулятор, в том числе одну или обе цепи антитела по изобретению, или его фрагмент, производное, мутеин или вариант, полинуклеотиды, достаточные для использования в качестве гибридизационных зондов, PCR-праймеры или праймеры для секвенирования для идентификации, анализа, мутации или амплификации полинуклеотида, кодирующего полипептид, антисмысловые нуклеиновые кислоты для ингибирования экспрессии полинуклеотида и комплементарные последовательности вышеизложенного. Нуклеиновые кислоты могут быть любой длины. Они могут быть длиной, например, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1000, 1500, 3000, 5000 или более нуклеотидов, и/или могут содержать одну или более дополнительных последовательностей, например регуляторных последовательностей, и/или являться частью более крупной нуклеиновой кислоты, например вектора. Эти нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или двухцепочечными и могут включать РНК- и/или ДНК-нуклеотиды и их искусственные варианты (например, пептидные нуклеиновые кислоты). Нуклеиновые кислоты, кодирующие модуляторы по изобретению, в том числе антитела или их иммунореактивные фрагменты или производные, предпочтительно выделены, как описано выше.

б. Гибридизация и идентичность

Как указано, в изобретении также предлагаются нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются с другими нуклеиновыми кислотами в определенных условиях гибридизации. Методы гибридизации нуклеиновых кислот хорошо известны в данной области техники. См., например, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. В контексте настоящей заявки в качестве умеренно жестких условий гибридизации используют раствор для предварительного промывания, содержащий 5х хлорид натрия/цитрат натрия (SSC), 0,5% SDS (додецилсульфат натрия), 1,0 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) (pH 8,0), буфер для гибридизации, состоящий из примерно 50% формамида, 6×SSC, и температуру гибридизации 55°C (или другие аналогичные растворы для гибридизации, например раствор, содержащий примерно 50% формамида, с температурой гибридизации 42°C), и следующие условия для промывания - 60°C, в 0,5×SSC, 0,1% SDS. В жестких условиях гибридизация происходит в 6xSSC при 45°C, с последующими одним или более промываниями в 0,1xSSC, 0,2% SDS при 68°C.Кроме того, специалист в данной области техники может управлять условиями гибридизации и/или промывания с целью увеличения или уменьшения жесткости гибридизации, таким образом, чтобы нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, которые по меньшей мере на 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичны друг другу, обычно остаются гибридизованными друг с другом. В целом, в контексте настоящего описания изобретения термин "по существу идентичная" в отношении последовательности нуклеиновой кислоты следует понимать, как последовательность нуклеотидов, демонстрирующую по меньшей мере примерно 85%, или 90%, или 95%, или 97%-ую идентичность последовательности со стандартной нуклеиновокислотной последовательностью.

Основные параметры, влияющие на выбор условий гибридизации, и руководство для разработки подходящих условий, изложены, например, в Sambrook, Fritsch and Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., chapters 9 и 11; и Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 и 6.3-6.4) и могут быть легко определены специалистами в данной области на основании, например, длины и/или совокупности оснований нуклеиновой кислоты.

Следует понимать, что нуклеиновые кислоты могут, согласно изобретению, присутствовать отдельно или в комбинации с другими нуклеиновыми кислотами, которые могут быть гомологичными или гетерологичными. В предпочтительных воплощениях нуклеиновая кислота функционально связана с последовательностями, контролирующими экспрессию, которые могут быть гомологичными или гетерологичными в отношении указанной нуклеиновой кислоты. В этом контексте термин "гомологичный" означает, что нуклеиновая кислота в природных условиях также функционально связана с последовательностью, контролирующей экспрессию, и термин "гетерологичный" означает, что нуклеиновая кислота в природных условиях функционально не связана с последовательностью, контролирующей экспрессию.

в. Экспрессия

Нуклеиновая кислота, такая как нуклеиновая кислота, экспрессирующая РНК и/или белок или пептид, и последовательность, контролирующая экспрессию, функционально связаны друг с другом, если они ковалентно соединены друг с другом таким образом, что экспрессия или транскрипция указанной нуклеиновой кислоты находится под контролем или под влиянием указанной последовательности, контролирующей экспрессию. Если нуклеиновую кислоту следует транслировать в функциональный белок, тогда, при последовательности, контролирующей экспрессию, функционально связанной с кодирующей последовательностью, индукция указанной последовательности, контролирующей экспрессию, приводит к транскрипции указанной нуклеиновой кислоты, не вызывая сдвига рамки считывания кодирующей последовательности или же указанная кодирующая последовательность не способна транслироваться в нужный белок или пептид.

Термин "последовательность, контролирующая экспрессию" включает, согласно изобретению, промоторы, сайты связывания рибосомы, энхансеры и другие контролирующие элементы, которые регулируют транскрипцию гена или трансляцию мРНК. В конкретных воплощениях изобретения последовательности, контролирующие экспрессию, можно регулировать. Точная структура последовательностей, контролирующих экспрессию, может варьироваться в зависимости от вида или типа клетки, но, как правило, содержит 5-нетранскрибируемые и 5'- и 3'-нетранслируемые последовательности, которые вовлечены в инициацию транскрипции и трансляции, соответственно, такие как TATA-бокс, кэпирующая последовательность, последовательность CAAT и тому подобное. Более конкретно, 5'-нетранскрибируемые последовательности, контролирующие экспрессию, содержат промоторную область, которая включает промоторную последовательность для контроля транскрипции функционально связанной нуклеиновой кислоты. Последовательности, контролирующие экспрессию, также могут содержать энхансерные последовательности или вышерасположенные активаторные последовательности.

Согласно изобретению, термин "промотор" или "промоторная область" относится к нуклеиновокислотной последовательности, которая расположена выше (5') экспрессируемой последовательности нуклеиновой кислоты и контролирует экспрессию последовательности, обеспечивая узнавание и сайт связывания РНК-полимеразы. Промоторная область может включать дополнительные сайты узнавания и связывания дополнительных факторов, вовлеченных в регуляцию транскрипции гена. Промотор может контролировать транскрипцию прокариотического или эукариотического гена. Кроме того, промотор может быть индуцибельным и может инициировать транскрипцию в ответ на индуцирующий агент, или может быть конститутивным, если транскрипция не контролируется индуцирующим агентом. Ген, находящийся под контролем индуцибельного промотора, не экспрессируется или лишь незначительно экспрессируется в случае отсутствия индуцирующего агента. В присутствии индуцирующего агента ген включается или уровень транскрипции увеличивается. Это опосредовано, в большинстве случаев, связыванием конкретного транскрипционного фактора.

Предпочтительные промоторы по изобретению включают промоторы SP6, T3 и T7 полимераз, человеческий U6 RNA промотор, CMV промотор и их искусственные гибридные промоторы (например, CMV), где участок или участки слиты с участком или участками промоторов генов других клеточных белков, таких как, например, человеческий GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа), включая или не включая дополнительный(е) интрон(ы).

Согласно изобретению, термин "экспрессия" используется в своем наиболее широком значении и включает продуцирование РНК или РНК и белка/пептида. Он также включает частичную экспрессию нуклеиновых кислот. Кроме того, экспрессия может осуществляться временно или стабильно.

В предпочтительном воплощении молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению находится в векторе, если целесообразно, вместе с соответствующим промотором, который контролирует экспрессию этой нуклеиновой кислоты. Термин "вектор" используется здесь в своем наиболее широком значении и включает любой вспомогательный носитель нуклеиновой кислоты, который позволяет вводить указанную нуклеиновую кислоту, например, в прокариотические и/или эукариотические клетки и, если целесообразно, встраивать в геном. Векторы такого типа предпочтительно реплицируются и/или экспрессируются в клетках. Векторы могут включать плазмиды, фагмиды, бактериофаги или вирусные геномы. При использовании здесь термин "плазмида", как правило, относится к конструкции экстрахромосомного генетического материала, обычно кольцевому ДНК дуплексу, который может реплицироваться независимо от хромосомной ДНК.

При осуществлении на практике настоящего изобретения следует понимать, что можно использовать многие общепринятые методы молекулярной биологии, микробиологии и рекомбинантной ДНК. Такие общепринятые методы относятся к векторам, клеткам-хозяевам и рекомбинантным методам, описанным здесь. Эти методы хорошо известны и объяснены, например, в Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Sambrook et al., Molecular Cloning-Α Laboratory Manual (3rd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 2000 и Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., выше. Другие полезные ссылки, например по выделению и культивированию клеток (например, для последующего выделения нуклеиновой кислоты или белка), включают Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, третье издание, Wiley-Liss, New York и ссылки, указанные в нем; Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, N.Y.; Gamborg and Phillips (Eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) and Atlas and Parks (Eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, Fla. Методы получения нуклеиновых кислот (например, посредством in vitro амплификации, очистки из клеток или химического синтеза), методы обработки нуклеиновых кислот (например, сайт-направленный мутагенез, расщепление рестриктазами, лигирование и т.д.) и различные векторы, клеточные линии и т.д., полезные в обработке и получении нуклеиновых кислот, описаны в вышеупомянутых ссылках. Кроме того, по существу любой полинуклеотид (в том числе, например, меченные или биотинилированные полинуклеотиды) может быть индивидуально или стандартно заказан в любом из множества коммерческих источников.

Таким образом, в одном аспекте настоящего изобретения предлагаются рекомбинантные клетки-хозяева, обеспечивающие возможность рекомбинантной экспрессии антител по изобретению или их участков. Антитела, продуцируемые путем экспрессии в таких рекомбинантных клетках-хозяевах, называются в данной заявке рекомбинантными антителами. В настоящем изобретении также предлагаются клетки, являющиеся потомками таких клеток-хозяев, и антитела, продуцируемые ими.

При использовании здесь термин "рекомбинантная клетка-хозяин" (или просто "клетка-хозяин") означает клетку, в которую был встроен рекомбинантный экспрессирующий вектор. Следует понимать, что рекомбинантная клетка-хозяин и клетка-хозяин означает не только клетку конкретного субъекта, но также и потомство такой клетки. Так как некоторые модификации могут иметь место в последующих поколениях в результате либо мутаций, либо влияния окружающей среды, такое потомство может, на самом деле, не быть идентичным родительской клетке, но тем не менее оно включено в объем используемого здесь термина "клетка-хозяин". Такие клетки могут содержать вектор по изобретению, как описано выше.

В другом аспекте настоящего изобретения предлагается способ получения антитела или его участка, как описано здесь. Согласно одному воплощению, указанный способ включает культивирование клетки, трансфицированной или трансформированной вектором, как описано выше, и воспроизводящий антитело или его участок.

Как указано выше, экспрессия антитела по изобретению (или его фрагмента или вариантов) предпочтительно включает экспрессирующий(е) вектор(ы), содержащий(е) полинуклеотид, который кодирует нужное анти-PTK7 антитело. Методы, которые хорошо известны специалистам в данной области, можно использовать для конструирования экспрессирующих векторов, содержащих последовательности, кодирующие антитело, и соответствующие транскрипционные и трансляционные контрольные сигналы. Эти методы включают, например, методы рекомбинантной ДНК in vitro, методы синтеза и методы генетической рекомбинации in vivo. В воплощениях изобретения, таким образом, предлагаются реплицируемые векторы, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую анти-PTK7 антитело по изобретению (например, целое антитело, тяжелую или легкую цепь антитела, вариабельный домен тяжелой или легкой цепи антитела, или его часть, или CDR тяжелой или легкой цепи, одноцепочечный Fv или их фрагменты или варианты), функционально связанную с промотором. В предпочтительных воплощениях такие векторы могут включать нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь молекулы антитела (или ее фрагмент), нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь антитела (или ее фрагмент) или и тяжелую и легкую цепь.

Когда нуклеотиды по настоящему изобретению выделены и модифицированы согласно данному руководству, их можно использовать для получения выбранных модуляторов, включая анти-PTK7 антитела или их фрагменты.

X. Получение и очистка модулятора

Используя общепризнанные методы молекулярной биологии и современные методы экспрессии белка, можно получить значительные количества необходимых модуляторов. Более конкретно, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие модуляторы, такие как антитела, полученные и сконструированные, как описано выше, могут быть встроены в хорошо известные и коммерчески доступные системы продуцирования белка, содержащие различные типы клеток-хозяев, для получения преклинических, клинических или коммерческих количеств нужного фармацевтического продукта. Следует понимать, что в предпочтительных воплощениях нуклеиновокислотные молекулы, кодирующие модуляторы, встроены в векторы или экспрессирующие векторы, которые обеспечивают эффективную интеграцию в выбранные клетки-хозяева с последующим высоким уровнем экспрессии нужного модулятора PTK7.

Предпочтительно, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие модуляторы PTK7 и векторы, содержащие эти нуклеиновокислотные молекулы, можно использовать для трансфекции подходящей клетки-хозяина млекопитающего, растения, бактерии или дрожжей, хотя следует понимать, что для производства модулятора можно использовать прокариотические системы. Трансфекцию можно осуществлять посредством любого известного метода введения полинуклеотидов в клетку-хозяина. Способы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих хорошо известны в данной области техники и включают декстран-опосредованную трансфекцию, осаждение фосфатом кальция, полибрен-опосредованную трансфекцию, слияние протопластов, электропорацию, инкапсуляцию полинуклеотида(ов) в липосомы и непосредственную микроинъекцию ДНК в ядро. Кроме того, молекулы нуклеиновых кислот можно вводить в клетки млекопитающих с помощью вирусных векторов. Методы трансформации клеток млекопитающих хорошо известны в данной области техники. См., например, патенты США 4399216, 4912040, 4740461 и 4959455. Кроме того, методы трансформации клеток растений хорошо известны в данной области техники, в том числе, например, трансформация, опосредованная агробактерией, биолистическая трансформация, прямая инъекция, электропорация и вирусная трансформация. Методы трансформации бактериальных и дрожжевых клеток также хорошо известны в данной области техники.

Кроме того, клетка-хозяин может быть котрансфицирована двумя экспрессирующими векторами по изобретению, например первым вектором, кодирующим полипептид, полученный из тяжелой цепи, и вторым вектором, кодирующим полипептид, полученный из легкой цепи. Эти два вектора могут содержать идентичные селектируемые маркеры, что обеспечивает по существу эквивалентную экспрессию полипептидов тяжелой и легкой цепи. Альтернативно можно использовать один вектор, который кодирует и способен экспрессировать полипептиды и тяжелой и легкой цепи. В таких ситуациях легкую цепь предпочтительно помещают перед тяжелой цепью, чтобы избежать избытка токсичной свободной тяжелой цепи. Кодирующие последовательности тяжелых и легких цепей могут содержать кДНК или геномную ДНК.

а. Системы экспрессии хозяина

Множество систем экспрессирующих векторов в клетках-хозяевах, многие из которых имеются в продаже, совместимы с данным руководством и могут быть использованы для экспрессии модуляторов по изобретению. Такие системы экспрессии хозяина представляют собой носители, с помощью которых интересующие кодирующие последовательности можно экспрессировать и затем очищать, а также представляют собой клетки, которые могут, будучи трансформированы или трансфицированы соответствующими нуклеотидными кодирующими последовательностями, экспрессировать молекулу по изобретению in situ. Такие системы включают, но не ограничиваются ими, микроорганизмы, такие как бактерии (например, E.coli, B.subtilis, Streptomyces), трансформированные экспрессирующими векторами на основе рекомбинантной ДНК бактериофага, плазмидной ДНК или космидной ДНК, содержащими последовательности, кодирующие модулятор; дрожжи (например, Saccharomyces, Pichia), трансфицированные рекомбинантными дрожжевыми экспрессирующими векторами, содержащими последовательности кодирующие модулятор; системы клеток насекомых, инфицированные рекомбинантными вирусными экспрессирующими векторами (например, бакуловирус), содержащие последовательности, кодирующие модулятор; системы клеток растений (например, Nicotiana, Arabidopsis, ряска, зерновые, пшеница, картофель и т.д.), инфицированные рекомбинантными вирусными экспрессирующими векторами (например, вирусом мозаики цветной капусты, CaMV; вирусом табачной мозаики, TMV) или трансфицированные рекомбинантными плазмидными экспрессирующими векторами (например, Ti плазмида), содержащими последовательности, кодирующие модулятор; или системы клеток млекопитающих (например, клетки COS, CHO, BHK, 293, 3T3), имеющие рекомбинантные экспрессирующие конструкции, содержащие промоторы, полученные из генома клеток млекопитающих (например, металлотионеиновый промотор) или из вирусов млекопитающих (например, поздний промотор аденовируса; 7.5K промотор вируса осповакцины).

В бактериальных системах число экспрессирующих векторов может быть преимущественно выбрано в зависимости от предполагаемого использования экспрессируемой молекулы. Например, когда должно быть произведено большое количество такого белка для получения фармацевтических композиций модулятора, может быть желательно использовать векторы, которые управляют экспрессией высоких уровней слитых белковых продуктов, которые легко очищаются. Такие векторы включают, но не ограничиваются ими, Е.coli экспрессирующий вектор pUR278 (Ruther et al., EMBO 1. 2: 1791 (1983)), в котором кодирующая последовательность может быть лигирована отдельно в вектор в рамке с кодирующей областью lac Z, так что продуцируется слитый белок; pIN векторы (Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24: 5503-5509 (1989)); и тому подобное. Также можно использовать pGEX векторы для экспрессии чужеродных полипептидов в виде слитых белков с глутатион-5-трансферазой (GST). В целом, такие слитые белки являются растворимыми и могут быть легко очищены из лизируемых клеток посредством абсорбции и связывания с матриксными глутатион-агарозными сферообразными частицами и затем элюированы в присутствии свободного глутатиона. Разработаны pGEX векторы, включающие сайты расщепления тромбином или протеазой фактором Ха, так чтобы клонируемый продукт целевого гена мог быть высвобожден из GST-группировки.

В системе насекомых можно использовать Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) (вирус ядерного полиэдроза калифорнийской люцерновой совки) в качестве вектора, экспрессирующего чужеродные гены. Вирус выращивают в клетках Spodoptera frugiperda. Кодирующие последовательности можно клонировать отдельно в несущественные области (например, ген полиэдрина) вируса и помещать под контроль промотора AcNPV (например, промотора полиэдрина).

В клетках-хозяевах млекопитающих ряд систем, основанных на вирусной экспрессии, можно использовать для введения нужной нуклеотидной последовательности. В случае использования аденовируса в качестве экспрессирующего вектора, представляющую интерес кодирующую последовательность можно лигировать с аденовирусным транскрипционным/трансляционным контролирующим комплексом, например поздним промотором и тройной лидерной последовательностью. Этот химерный ген затем можно встроить в аденовирусный геном посредством in vitro или in vivo рекомбинации. Вставка в несущественную область вирусного генома (например, область E1 или E3) приводит к рекомбинантному вирусу, который является жизнеспособным и способен экспрессировать молекулу в инфицированных хозяевах (например, см. Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1: 355-359 (1984)). Специфические сигналы инициации также могут требоваться для эффективной трансляции встроенных кодирующих последовательностей. Эти сигналы включают инициирующий кодо