13.01.2017
217.015.6c64

Новые модуляторы и способы их применения

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Свернуть Развернуть
№ охранного документа
0002592672
Дата охранного документа
27.07.2016
Краткое описание РИД Свернуть Развернуть
Аннотация: Изобретение относится к биохимии. Представлено химерное, CDR-привитое, гуманизированное или рекомбинантное человеческое антитело или его фрагмент, который специфически связывается с человеческим EFNA4. Также представлен конъюгат указанного антитела с цитотоксическим агентом. Представлена фармацевтическая композиция и способ лечения EFNA4-ассоциированного расстройства. Изобретение расширяет арсенал средств борьбы с EFNA4-ассоциированными расстройствами. 10 н. и 41 з.п. ф-лы, 20 ил., 5 табл., 20 пр.
Реферат Свернуть Развернуть

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА ЗАЯВКИ

В данной заявке заявляет приоритет предварительной заявки США 61/421157 поданной 8 декабря 2010 года и заявки PCT/US2011/050451, поданной 2 сентября 2011 года, каждая из которых включена в данную заявку посредством ссылки во всей полноте.

Перечень последовательностей

Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был представлен в ASCII формате посредством EFS-Web и включен в данную заявку посредством ссылки во всей полноте. Указанная копия ASCII, созданная 22 ноября 2011 года, называется 11200PCT.txt и имеет размер 80102 байт.

Область изобретения

Заявка в целом относится к новым композициям и способам их применения в предупреждении, лечении или облегчении гиперпролиферативных расстройств и любого их распространения, повторного проявления, рецидива или метастазов. В широком аспекте настоящее изобретение относится к применению модуляторов лигандов эфринов A (EFNA), включая анти-EFNA антитела и слитые конструкции, для лечения или профилактики опухолевых заболеваний. В особенно предпочтительных воплощениях настоящего изобретения предложено применение таких EFNA-модуляторов для иммунотерапевтического лечения злокачественных образований, включающего снижение частоты появления опухоль-инициирующих клеток.

Предшествующий уровень техники

Дифференцировка стволовых клеток и клеток-предшественников, а также клеточная пролиферация являются нормальными непрерывными процессами, которые действуют совместно для поддержания роста тканей во время органогенеза, а также замены клеток и восстановления большинства тканей в течение жизни всех живых организмов. Решения о дифференцировке и пролиферации часто контролируется многочисленными факторами и сигналами, которые уравновешены так, чтобы поддерживать решения относительно судьбы клеток и архитектуры тканей. Нормальная архитектура ткани в основном сохраняется клетками в ответ на сигналы микроокружения, которые регулируют деление клеток и созревание тканей. Соответственно, клеточная пролиферация и дифференцировка обычно происходит только по мере необходимости для замены поврежденных или умирающих клеток или для роста. К сожалению, нарушение клеточной пролиферации и/или дифференцировки может быть результатом множества факторов, в том числе, например, недостатка или избытка различных химических агентов, участвующих в передаче сигналов, наличия измененного микроокружения, генетических мутаций или любой их комбинации. Нарушение или какое-либо расстройство нормальной клеточной пролиферации и/или дифференцировки может привести к различным заболеваниям или расстройствам, в том числе к гиперпролиферативным расстройствам, таким как рак.

Обычные методы лечения рака включают химиотерапию, лучевую терапию, хирургию, иммунотерапию (например, модификаторы биологического ответа, вакцины или терапевтические средства направленного действия) или их комбинации. К сожалению, слишком многие виды рака не отвечают или минимально отвечают на такие традиционные методы лечения, предоставляя пациентам небольшой выбор. Например, у ряда больных в случае некоторых видов рака обнаруживаются генные мутации, которые делают их нечувствительными, несмотря на общую эффективность выбранной терапии. Кроме того, в зависимости от типа рака, некоторые доступные виды лечения, такие как хирургия, не являются реальной альтернативой. Ограничения, присущие существующим терапевтическим средствам, представляющим стандарт лечения, особенно очевидны при попытке лечить пациентов, прошедших предыдущее лечение и имеющих после этого рецидивы. В таких случаях безрезультатные схемы лечения и результирующее ухудшение состояния пациента может содействовать трудноизлечимым опухолям, которые часто проявляются, как более агрессивное заболевание, которое в конечном счете оказывается неизлечимым. Несмотря на большие успехи в диагностике и лечении рака на протяжении многих лет, уровень общей выживаемости для многих солидных опухолей остается в значительной степени неизменным из-за неспособности существующих методов лечения предотвратить рецидив, повторное проявление опухоли и метастазы. Таким образом, остается проблема разработки более целенаправленной и эффективной терапии.

Одно из перспективных направлений исследований предполагает использование терапевтических средств направленного действия для поиска онкогенных "затравочных" клеток, которые, по-видимому, лежат в основе многих видов рака. Исходя из этого, в настоящее время известно, что большинство твердых тканей содержит популяции взрослых, расположенных в тканях, стволовых клеток, образующих дифференцированные клеточные типы, которые составляют большую часть этой ткани. Опухоли, образующиеся в этих тканях, также состоят из гетерогенных популяций клеток, которые также возникают из стволовых клеток, но заметно отличаются по своей общей пролиферации и организации. Хотя все чаще признается, что большинство опухолевых клеток имеют ограниченную способность к пролиферации, меньшая часть популяции раковых клеток (общеизвестная как раковые стволовые клетки или CSC) обладают исключительной способностью активно самообновляться, тем самым наделяя опухоль присущей ей способностью к возобновлению. Более конкретно, гипотеза раковых стволовых клеток предполагает, что существует отдельная подгруппа клеток (то есть CSC) в каждой опухоли (приблизительно 0,1-10%), которая способна неограниченно самообновляться и образовывать опухолевые клетки с постепенным ограничением их репликативной способности в результате дифференцировки в клетки-предшественники опухоли и затем в окончательно дифференцированные опухолевые клетки.

В последние годы стало более очевидно, что эти CSC (также известные как клетки, поддерживающие опухоль, или ТРС) могут быть более резистентными к традиционным химиотерапевтическим агентам или облучению и, таким образом, сохраняться после стандартного клинического лечения, чтобы позже стимулировать рост трудноизлечимых опухолей, вторичных опухолей и содействовать образованию метастазов. Кроме того, растущие доказательства свидетельствуют о том, что пути, регулирующие органогенез и/или самообновление расположенных в нормальных тканях стволовых клеток, разрегулированы или изменены в CSC, что приводит к непрерывному увеличению количества самообновляющихся раковых клеток и к образованию опухоли. См. в целом Al-Hajj et al., 2004, PMID: 15378087; и Dalerba et al., 2007, PMID: 17548814; каждый из которых включен в настоящее описание во всей полноте посредством ссылки. Таким образом, эффективность традиционных, а также более поздних методов лечения посредством направленной доставки, по-видимому, ограничена существованием и/или появлением резистентных раковых клеток, которые способны поддерживать рак, даже несмотря на эти разнообразные методы лечения. Huff et al., European Journal of Cancer 42: 1293-1297 (2006) и Zhou et al., Nature Reviews Drug Discovery 8: 806-823 (2009), каждый из которых включен в настоящее описание во всей полноте посредством ссылки. Такие наблюдения подтверждены устойчивой неспособностью традиционных циторедуктивных агентов существенно увеличивать выживаемость пациентов, страдающих от солидных опухолей, а также развитием более тонкого понимания того, как опухоли растут, рецидивируют и метастазируют. Соответственно, недавние стратегии лечения опухолевых заболеваний признали важность ликвидации, уменьшения, подавления или стимуляции дифференцировки клеток, поддерживающих опухоль, с тем, чтобы уменьшить возможность повторного проявления опухоли, метастазов или рецидивов у пациента.

Усилия по разработке таких стратегий включают последние работы с использованием нетрадиционных ксенотрансплантатных (NTX) моделей, в которых образцы первичных человеческих солидных опухолей имплантировали и пассировали исключительно мышам с ослабленным иммунитетом. На многочисленных видах раковых заболеваний такие способы подтверждают существование субпопуляции клеток с уникальной способностью образовывать гетерогенные опухоли и поддерживать их рост в течение неопределенного времени. Как ранее предполагалось, работа на NTX моделях подтверждает, что идентифицированные CSC-субпопуляции опухолевых клеток являются более резистентными к циторедуктивным схемам лечения, таким как химиотерапия и лучевая терапия, что может объяснить несоответствие между показателями клинического ответа и общей выживаемостью. Кроме того, применение NTX-моделей в исследовании CSC вызвало фундаментальное изменение в разработке лекарственных средств и в доклинической оценке кандидатов в лекарственные средства, которые могут привести к CSC-нацеленной терапии, оказывающей существенное воздействие на повторное проявление опухоли и метастазирование, и, тем самым, повышая выживаемость пациентов. Несмотря на прогресс, главными проблемами являются имеющиеся технические трудности, связанные с обработкой первичной и/или ксенотрансплантатной опухолевой ткани, наряду с отсутствием экспериментальных оснований для характеристики отличительных особенностей CSC и способности к дифференцировке. Таким образом, по-прежнему сохраняется существенная потребность в селективном нацеливании на раковые стволовые клетки и разработке диагностических, профилактических или терапевтических соединений и методов, которые можно использовать в лечении, предупреждении и/или контролировании гиперпролиферативных расстройств.

Краткое изложение сущности изобретения

Эти и другие цели предусмотрены настоящим изобретением, которое в широком смысле относится к способам, соединениям, композициям и изделиям, которые можно использовать в лечении EFNA-ассоциированных расстройств (например, гиперпролиферативных расстройств или опухолевых заболеваний). В связи с этим в настоящем изобретении предлагаются новые модуляторы EFNA (или лиганда эфрина А), которые эффективно нацелены на опухолевые или раковые стволовые клетки и могут быть использованы для лечения пациентов, страдающих от широкого спектра злокачественных образований. Как будет обсуждаться более подробно ниже, в настоящее время имеется шесть известных лигандов эфринов А (то есть EFNA 1-6) и раскрытые модуляторы могут содержать любой один или более лиганд эфрин А или соединяться с любым одним или более лигандами эфринами А. Кроме того, в некоторых воплощения раскрытые модуляторы EFNA могут содержать любое соединение, которое распознает, конкурирует, является агонистом, является антагонистом, взаимодействует, связывается или соединяется с полипептидом EFNA, его рецептором или его геном и модулирует, регулирует, изменяет, меняет или модифицирует воздействие белка EFNA на один или более физиологических путей. Таким образом, в широком смысле настоящее изобретение относится к выделенным модуляторам EFNA. В предпочтительных воплощениях изобретение более конкретно относится к выделенным модуляторам EFNA1 или выделенным модуляторам EFNA4 (то есть модуляторам, которые содержат по меньшей мере EFNA1 или EFNA4 или соединены с ними). Кроме того, как подробно рассмотрено ниже, такие модуляторы могут быть использованы для получения фармацевтических композиций.

В отдельных воплощениях изобретения модуляторы EFNA могут содержать сам лиганд эфрин А или его фрагмент либо в выделенной форме, либо слитым, либо соединенным с другими группировками (например, Fc-EFNA, PEG-EFNA или EFNA, соединенный с группировкой, обеспечивающей направленную доставку). В других выбранных воплощениях модуляторы EFNA могут содержать антагонисты EFNA, которые в контексте настоящей заявки, означают любую конструкцию или соединение, которое распознает, конкурирует, взаимодействует, связывается или соединяется с EFNA и нейтрализует, устраняет, уменьшает, сенсибилизирует, перепрограммирует, ингибирует или контролирует рост опухолевых клеток, в том числе опухоль-инициирующих клеток. В предпочтительных воплощениях модуляторы EFNA по настоящему изобретению содержат анти-EFNA антитела или их фрагменты или их производные, которые, как было неожиданно обнаружено, останавливают, нейтрализуют, снижают, уменьшают, истощают, сдерживают, ослабляют, перепрограммируют, устраняют или иным способом ингибируют способность опухоль-инициирующих клеток размножаться, сохраняться, распространяться, пролиферировать или другим способом содействовать выживанию, повторному проявлению, регенерации и/или метастазированию опухолевых клеток. В особенно предпочтительных воплощениях антитела или иммунореактивные фрагменты могут быть соединены или конъюгированы с одним или более противораковыми агентами.

В одном воплощении модулятор EFNA может содержать гуманизированное антитело, где указанное антитело содержит аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:149, SEQ ID NO:153, SEQ ID NO:157 и SEQ ID NO:161, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:151, SEQ ID NO:155, SEQ ID NO:159 и SEQ ID NO:163. В других предпочтительных воплощениях изобретение будет представлено в виде композиции, содержащей гуманизированное антитело, выбранное из группы, состоящей из hSC4.5, hSC4.15, hSC4.22 и hSC4.47, и фармацевтически приемлемого носителя. В другом предпочтительном воплощении модулятор EFNA может содержать антитело, которое содержит один или более CDR с Фиг.7А (SEQ ID NO:8-59 и 70-95). Предпочтительно, антитело, содержащее по меньшей мере одну CDR с Фиг.7А, включает гуманизированное антитело.

В некоторых других воплощениях изобретение включает модулятор EFNA, который снижает частоту появления опухоль-инициирующих клеток при введении субъекту. Предпочтительно уменьшение частоты появления определяют, используя анализ методом серийных разведений in vitro или in vivo. В особенно предпочтительных воплощениях такой анализ может быть выполнен с использованием анализа методом серийных разведений in vivo, включающего трансплантацию живых опухолевых клеток человека мышам с ослабленным иммунитетом. Альтернативно, анализ методом серийных разведений может быть выполнен с использованием анализа методом серийных разведений in vitro, включающего посев живых опухолевых клеток человека in vitro методом серийных разведений в условиях, поддерживающих образование колоний. В любом случае анализ, вычисление или количественное определение снижения частоты появления предпочтительно включает использование статистических параметров распределения Пуассона для обеспечения точного подсчета. Следует иметь в виду, что, хотя такие количественные методы являются предпочтительными, другие, менее трудоемкие методы, такие как проточная цитометрия или иммуногистохимия, также могут быть использованы для получения нужных значений и, соответственно, рассматриваются как входящие в объем настоящего изобретения. В таких случаях снижение частоты появления можно определить, используя проточный цитометрический анализ или иммуногистохимическое обнаружение поверхностных маркеров опухолевых клеток, которыми, как известно, богаты опухоль-инициирующие клетки.

Соответственно, в другом предпочтительном воплощении настоящее изобретение включает способ лечения EFNA-ассоциированного расстройства, включающий введение терапевтически эффективного количества модулятора EFNA нуждающемуся в этом субъекту, в результате чего снижается частота появления опухоль-инициирующих клеток. Кроме того, снижение частоты появления опухоль-инициирующих клеток предпочтительно определяют, используя анализ методом серийных разведений in vitro или in vivo.

В связи с этим следует иметь в виду, что настоящее изобретение основано, по меньшей мере частично, на обнаружении того, что полипептиды EFNA (и в частности EFNA4, как описано ниже) ассоциированы с клетками, поддерживающими опухоль, (то есть раковыми стволовыми клетками), которые вовлечены в этиологию различных неоплазий. В частности, в настоящей заявке неожиданно продемонстрировано, что введение различных типичных модуляторов EFNA может опосредовать, снижать, ингибировать или ликвидировать онкогенную передачу сигналов опухоль-инициирующими клетками (то есть снижать частоту появления опухоль-инициирующих клеток). Это подавляет передачу сигналов либо посредством уменьшения, удаления, перепрограммирования или подавления опухоль-инициирующих клеток, либо посредством изменения морфологии опухолевых клеток (например, индуцированной дифференцировки, разрушения ниши), что в свою очередь обеспечивает возможность более эффективного лечения EFNA-ассоциированных расстройств посредством ингибирования онкогенеза, поддержания опухоли, увеличения объема и/или метастазирования и ее повторного проявления. В других воплощениях раскрытые модуляторы могут стимулировать, поддерживать или иным образом улучшать EFNA-опосредованную передачу сигналов, что может ограничивать или задерживать рост опухоли. В других воплощениях раскрытые модуляторы могут препятствовать, подавлять или иным образом замедлять EFNA опосредованную передачу сигналов, что может способствовать росту опухоли. Кроме того, как будет обсуждаться более подробно ниже, полипептиды EFNA вовлечены в образование сил адгезии и отталкивания между клетками посредством интегрина и перегруппировки цитоскелета. Вмешательство в такие межклеточные взаимодействия с использованием новых модуляторов EFNA, описанных в данной заявке, может, таким образом, облегчать расстройство посредством более чем одного механизма (то есть сокращения опухоль-инициирующих клеток и разрушения клеточной адгезии) с обеспечением аддитивных или синергических эффектов. Также в других предпочтительных воплощениях может использоваться клеточная интернализация лигандов эфринов А для доставки модулятор-опосредованного противоракового агента. В связи с этим, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретным механизмом действия, а охватывает широкое использование раскрытых модуляторов для лечения EFNA-ассоциированных расстройств (в том числе различных неоплазий).

Таким образом, другое предпочтительное воплощение изобретения включает способ лечения EFNA-ассоциированного расстройства у субъекта, нуждающегося в этом, включающий стадию введения модулятора EFNA указанному субъекту. В особенно предпочтительных воплощениях модулятор EFNA соединен (например, конъюгирован) с противораковым агентом. Кроме того, полезные аспекты настоящего изобретения, включая любое нарушение клеточной адгезии, и сопутствующие преимущества могут быть достигнуты независимо от того демонстрирует опухолевая ткань субъекта повышенные уровни EFNA или пониженные или уменьшенные уровни EFNA по сравнению с нормальной соседней тканью.

Как упоминалось выше и обсуждается более подробно ниже, в настоящее время известно шесть лигандов эфринов А (то есть EFNA 1-6). Очевидно, что в соответствии с настоящим изобретением раскрытые модуляторы могут быть образованы, изготовлены и/или выбраны так, чтобы вступать во взаимодействие с одним лигандом эфрином А (например, EFNA4), подгруппой лигандов эфринов А (например, EFNA4 и EFNA1) или всеми шестью лигандами эфринами А. Более конкретно, как описано здесь и изложено в приведенных ниже примерах, предпочтительные модуляторы, такие как антитела, могут быть получены и выбраны таким образом, чтобы они вступали во взаимодействие или связывались с доменами или эпитопами, которые экспрессируются на одном лиганде эфрине А, или с эпитопами, которые являются консервативными (по меньшей мере в некоторой степени) и представлены в некоторых или всех полипептидах EFNA (например, EFNA 1 и 4 или EFNA 3 и 4). Это имеет большое значение в отношении настоящего изобретения, поскольку, как показано ниже в Примере 18, было обнаружено, что некоторые лиганды эфрины А предпочтительно экспрессируются на TIC и, в комбинации, могут служить в качестве особенно эффективных терапевтических мишеней, обеспечивающих селективное снижение частоты появления опухолевых клеток и/или истощение популяций раковых стволовых клеток.

Таким образом, в выбранном воплощении изобретение включает пан-модулятор EFNA, который иммуноспецифически соединяется с двумя или более лигандами эфринами А. В таких воплощениях выбранный модулятор может быть получен посредством иммунизации конкретным лигандом (например, EFNA4) и может соединяться или в большей или меньшей степени вступать в перекрестную реакцию с различными лигандами субъекта. Соответственно, в других воплощениях настоящее изобретение включает способ лечения субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение терапевтически эффективного количества пан-модулятора EFNA. Другие воплощения включают способ лечения субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение терапевтически эффективного количества модулятора EFNA, который иммуноспецифически соединен с одним или более лигандами эфринами А.

Соответственно, в других воплощениях настоящее изобретение включает пан-модулятор EFNA. В других воплощениях настоящее изобретение включает способ лечения EFNA-ассоциированного расстройства у субъекта, нуждающегося в этом, включающий стадию введения пан-модулятора EFNA указанному субъекту.

Конечно следует понимать, что раскрытые модуляторы EFNA могут быть получены, изготовлены и/или выбраны так, чтобы преимущественно взаимодействовать или соединяться с одним лигандом эфрином А (например, EFNA4) и демонстрировать минимальное соединение или не демонстрировать соединения с любым другим лигандом эфрином А. Соответственно, другие воплощения изобретения направлены на модуляторы EFNA, которые иммуноспецифически соединены с выбранным лигандом эфрином А и демонстрируют минимальное соединение или не демонстрируют соединения с любым другим лигандом эфрином А. В связи с этим предпочтительные воплощения, раскрытые здесь, включают способы лечения EFNA-ассоциированного расстройства у субъекта, нуждающегося в этом, включающие стадию введения модулятора EFNA, где модулятор EFNA иммуноспецифически соединяется с выбранным лигандом эфрином А и по существу не вступает во взаимодействие с каким-либо другим лигандом эфрином А. Кроме того, в объем настоящего изобретения входят способы получения, изготовления и выбора таких модуляторов.

В других аспектах настоящего изобретения используется способность раскрытых модуляторов потенциально разрушать клеточные адгезивные взаимодействия с одновременным подавлением опухоль-инициирующих клеток. Такие мультиактивные модуляторы EFNA (например, антагонисты EFNA) могут оказаться особенно эффективными при использовании в комбинации со стандартными противораковыми агентами или циторедуктивными агентами. Кроме того, два или более антагониста EFNA (например, антитела, которые специфически связываются с двумя отдельными эпитопами на лиганде эфрине А или которые соединяются с отдельными лигандами) можно использовать в комбинации в соответствии с идеей настоящего изобретения. Кроме того, как обсуждается более подробно ниже, модуляторы EFNA по настоящему изобретению можно использовать в конъюгированном или неконъюгированном состоянии и возможно в качестве сенсибилизирующего агента в комбинации с различными химическими или биологическими противораковыми агентами.

Таким образом, другое предпочтительное воплощение настоящего изобретения включает способ сенсибилизации опухоли субъекта к лечению противораковым агентом, включающий стадию введения модулятора EFNA указанному субъекту. В особенно предпочтительном аспекте изобретения модулятор EFNA конкретно приводит к снижению частоты появления опухоль-инициирующих клеток, определенной с использованием in vitro или in vivo анализа методом серийных разведений, тем самым сенсибилизируя опухоль к сопутствующему или последующему циторедуктивному воздействию.

Аналогично, так как соединения по настоящему изобретению могут приносить терапевтическую пользу через различные физиологические механизмы, настоящее изобретение также направлено на выбранные эффекторы или модуляторы, которые специально изготовлены так, чтобы использовать определенные клеточные процессы. Например, в некоторых воплощениях предпочтительный модулятор может быть сконструирован так, чтобы соединяться с EFNA на или около поверхности опухоль-инициирующей клетки и стимулировать иммунный ответ субъекта. В других воплощениях модулятор может содержать антитело, направленное на эпитоп, нейтрализующее активность лиганда эфрина А и взаимодействия с эфриновыми рецепторами, что может влиять на силы адгезии и отталкивания между клетками посредством интегрина и перегруппировки цитоскелета. В других воплощениях раскрытые модуляторы могут действовать путем истощения или удаления EFNA-ассоциированных клеток. Таким образом, важно понимать, что настоящее изобретение не ограничено каким-либо конкретным механизмом действия, а скорее охватывает любой способ или модулятор EFNA, который достигает нужного результата.

Предпочтительные воплощения в рамках раскрытых воплощений направлены на способ лечения субъекта, страдающего от опухолевого заболевания, включающий стадию введения терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного нейтрализующего модулятора EFNA.

Другие воплощения направлены на способ лечения субъекта, страдающего от EFNA-ассоциированного расстройства, включающий стадию введения терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного истощающего модулятора EFNA. Похожий способ направлен на истощение EFNA-ассоциированных клеток у субъекта, нуждающегося в этом, включающий стадию введения модулятора EFNA.

В еще одном воплощении в настоящем изобретении предложены способы поддерживающей терапии, в которых раскрытые эффекторы или модуляторы вводят в течение некоторого периода времени после начальной процедуры (например, химиотерапии, лучевой терапии или хирургического вмешательства), предназначенной для удаления по меньшей мере части опухолевой массы. Такие схемы лечения могут быть введены на протяжении недель, месяцев и даже лет, где модуляторы EFNA могут действовать профилактически с целью ингибирования метастазирования и/или повторного появления опухоли. В других воплощениях раскрытые модуляторы можно вводить в соответствии с известными циторедуктивными схемами для предупреждения или замедления метастазирования.

Очевидно, что, помимо терапевтических применений, описанных выше, модуляторы по настоящему изобретению можно использовать для диагностики EFNA-ассоциированных расстройств и, в частности, гиперпролиферативных расстройств. В некоторых воплощениях модулятор можно вводить субъекту и определять или контролировать in vivo. Специалистам в данной области техники понятно, что такие модуляторы могут быть мечеными или соединенными с маркерами или репортерными группами, как описано ниже, и могут быть обнаружены с использованием любого стандартного метода (например, MRI (визуализация методом ядерного магнитного резонанса) или CAT (компьютерная томография)). В других случаях модуляторы можно использовать в диагностических установках in vitro с использованием принятых в данной области операций. Таким образом, предпочтительное воплощение включает способ диагностики гиперпролиферативного расстройства у субъекта, нуждающегося в этом, включающий стадии:

а) получение образца ткани из указанного субъекта;

б) приведение образца ткани в контакт по меньшей мере с одним модулятором EFNA; и

в) обнаружение или количественное определение модулятора EFNA, соединенного с образцом.

Такие способы могут быть легко поняты с учетом настоящей заявки и могут быть легко осуществлены с использованием общедоступной промышленной технологии, таких как автоматические планшет-ридеры, специально предназначенные репортерные системы и т.д. В выбранных воплощениях модулятор EFNA соединен с клетками, поддерживающими опухоль, присутствующими в образце. В других предпочтительных воплощениях стадия обнаружения и количественного определения включает снижение частоты появления опухоль-инициирующих клеток и их обнаружение. Кроме того, анализ методом серийных разведений может быть проведен, как упоминалось выше, и предпочтительно с использованием статистических параметров распределения Пуассона для обеспечения точного подсчета снижения частоты появления.

Аналогично, в настоящем изобретении также предложены наборы, которые полезны в диагностике и контроле EFNA-ассоциированных расстройств, таких как рак. С этой целью в настоящем изобретении предпочтительно предложено изделие, полезное для диагностики или лечения EFNA-ассоциированных расстройств, содержащее контейнер, содержащий модулятор EFNA и инструкции по использованию указанного модулятора EFNA для лечения или диагностики EFNA-ассоциированного расстройства.

В других предпочтительных воплощениях изобретения также используются свойства раскрытых модуляторов как инструмента, полезного для идентификации, выделения, разделения или обогащения популяций или субпопуляций опухоль-инициирующих клеток посредством таких методов, как сортировка флуоресцентно-активированных клеток (FACS) или лазерное отделение.

Таким образом, другое предпочтительное воплощение настоящего изобретения направлено на способ идентификации, выделения, разделения или обогащения популяции опухоль-инициирующих клеток, включающий стадию приведения указанных опухоль-инициирующих клеток в контакт с модулятором EFNA.

Вышеизложенное представляет собой краткое изложение сущности изобретения и, таким образом, содержит, по необходимости, упрощения, обобщения и опускания деталей; и, следовательно, специалистам в данной области техники будет понятно, что краткое изложение является лишь иллюстративным и не предназначено являться каким-либо ограничением. Другие аспекты, характеристики и преимущества способов, композиций и/или устройств и/или другие объекты, описанные здесь, станут очевидными из изложенного здесь руководства. Краткое изложение представлено для того, чтобы изложить ряд концепций в упрощенной форме, которые дополнительно описаны ниже в Подробном описании изобретения. Это краткое изложение не предназначено для определения ключевых или существенных признаков заявленного изобретения и не предназначено для использования в определении объема заявленного изобретения.

Краткое описание графических материалов

На Фиг.1А-В показаны, соответственно, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий EFNA4 (SEQ ID NO:1), соответствующая аминокислотная последовательность изоформы человеческого EFNA4 (SEQ ID NO:2) и выравнивание последовательностей изоформ человеческого EFNA4 a, b и с, показывающее аминокислотные различия (SEQ ID NO:2-4), в то время как на Фиг.1Г-Е показаны, соответственно, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая человеческий EFNA1 (SEQ ID NO:5), соответствующая аминокислотная последовательность изоформы человеческого EFNA1 (SEQ ID NO:6) и выравнивание последовательностей изоформ EFNA1 а и b человека, показывающее аминокислотные различия (SEQ ID NO:6 и 7);

На Фиг.2А и 2Б показаны графики, представляющие уровень экспрессии генов выбранных человеческих лигандов эфринов А и эфриновых рецепторов А у необработанных (ФИГ.2А) и у обработанных иринотеканом (Фиг.2Б) мышей при измерении с использованием всей последовательности транскриптома популяций, значительно обогащенных клетками-предшественниками опухоли (TProg), и клетками, поддерживающими опухоль (ТРС), и неонкогенными клетками (NTG), полученными из подгруппы всех образцов колоректальной опухоли;

На Фиг.3А и 3Б показаны графики, представляющие уровень генной экспрессии человеческого лиганда эфрина А4 в образцах колоректальной опухоли (Фиг.3А) и образцах опухоли поджелудочной железы (Фиг.3Б) при измерении с использованием всей последовательности транскриптома из популяций, значительно обогащенных клетками-предшественниками опухоли (TProg) и клетками, поддерживающими опухоль (ТРС), и неонкогенными клетками (NTG) или популяций онкогенных (TG) и неонкогенных клеток (NTG);

На Фиг.4 представлен график, показывающий относительный уровень генной экспрессии человеческого EFNA4 в популяциях, значительно обогащенных клетками-предшественниками опухоли (TProg), и клетками, поддерживающими опухоль (ТРС), полученных из мышей, несущих одну из четырех разных нетрадиционных ксенотрансплантатных (NTX) клеточных линий колоректальной опухоли или опухоли поджелудочной железы, и нормализированных относительно популяций, обогащенных неонкогенными клетками (NTG), при измерении с использованием количественного OT-PCR;

На Фиг.5А и 5Б представлены графики, показывающие относительный уровень экспрессии гена человеческого EFNA4 при измерении с использованием OT-PCR во всех образцах колоректальной опухоли от пациентов с I-IV стадией болезни, нормализованных относительно средней экспрессии в нормальной ткани толстой и прямой кишки (Фиг.5А) или относительно нормальной соседней ткани (Фиг.5Б);

На Фиг.6А-6Д представлен уровень экспрессии генов человеческих EFNA, измеренный для EFNA4 на Фиг.6А и 6Б посредством OT-PCR в целых опухолевых образцах (серые точки) или соответствующие NAT (технология амплификации нуклеиновых кислот) (белые точки) от пациентов с одной из восемнадцати разных солидных типов опухоли, на Фиг.6В и 6Г посредством OT-PCR для EFNA4 и EFNA1 в выбранных NTX опухолевых клеточных линиях и посредством Вестерн-блот анализа на Фиг.6Д для EFNA4 в нормальной ткани и выбранных NTX опухолевых клеточных линиях;

На Фиг.7А-7Т представлены последовательности нескольких модуляторов EFNA, при этом на Фиг.7А представлена в табличном виде генетическая организация и последовательности CDR тяжелой и легкой цепи (как определено Chothia et al.) отдельных модуляторов EFNA, выделенных и клонированных, как описано здесь, на Фиг.7Б-7O представлены мышиные нуклеиновокислотные и аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепи для тех же модуляторов, представленных на Фиг.7А, и на Фиг.7П-7Т представлены нуклеиновокислотные и аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепи типичных гуманизированных вариантов раскрытых модуляторов EFNA;

На Фиг.8А-8Г представлены биохимические и иммунологические свойства типичных модуляторов в виде таблицы на Фиг.8А, сравнение аффинности мышиного SC4.47 и гуманизированного SC4.47 соответственно, при определении посредством анализа взаимодействия без использования метки, с фиксированным количеством антитела и серийными разведениями антигена на Фиг.8Б и 8В, и представленное в виде таблицы сравнение выбранных гуманизированных и мышиных модуляторов на Фиг.8Г;

На Фиг.9 показаны свойства связывания с клеточной поверхностью пятидесяти типичных модуляторов лиганда эфрина А по настоящему изобретению для клеток Jurkat E6 и клеток Z138 соответственно;

На Фиг.10А и 10Б показано связывание лиганда эфрина А с клетками, экспрессирующими рецепторы эфрина А в зависимости от дозы (Фиг.10А) и ингибирование связывания с клеточной поверхностью лиганда эфрина А при воздействии типичных раскрытых модуляторов (Фиг.10Б);

На Фиг.11А-11Г представлены графики, иллюстрирующие способность раскрытых модуляторов ингибировать связывание с клеточной поверхностью человеческого и мышиного лиганда эфрина А, при этом на Фиг.11А показаны кривые для положительного контроля, а на Фиг.11Б-11Г показана способность трех типичных модуляторов EFNA уменьшать связывание лиганда;

На Фиг.12А-12Д представлены графики, показывающие способность модуляторов по настоящему изобретению ингибировать связывание с клеточной поверхностью растворимого рецептора эфрина А, при этом на Фиг.12А представлена стандартная кривая связывания рецептора, на Фиг.12Б показаны свойства типичных модуляторов при изменении концентрации растворимого рецептора, на Фиг.12В показаны последствия изменения концентрации модулятора при сохранении неизменным количества рецептора, и на Фиг.12Г и 12Д показана способность модуляторов ингибировать связывание рецептора эфрина А с лигандами эфрином А4 и эфрином А1 соответственно;

На Фиг.13А-13В показана способность выбранных модуляторов по настоящему изобретению вступать в перекрестную реакцию с мышиным ортологом лиганда эфрина А4, при этом на Фиг.13А показан нереакционноспособный модулятор, а на Фиг.13Б и Фиг.13В показаны мышиный и гуманизированный модуляторы соответственно, которые вступают в перекрестную реакцию;

На Фиг.14А-14Г показано, что экспрессии лиганда эфрина А повышена во всех образцах колоректальной опухоли (Фиг.14А) и в онкогенных субпопуляциях колоректальных NTX опухолевых клеток (Фиг.14Б) и в онкогенных субпопуляциях NTX легочной клеточной линии (Фиг.14Г), но не в нормальных мононуклеарных клетках периферической крови (ФИГ.14В);

На Фиг.15А-15Г показана способность выбранных модуляторов по настоящему изобретению к интернализации при связывании с лигандами эфринами А, при этом на Фиг.15А показан сдвиг флуоресценции, связанный с тремя типичными модуляторами, на Фиг.15Б показано, что девятнадцать раскрытых модуляторов демонстрируют приращение средней интенсивности флуоресценции, свидетельствующую об интернализации, на Фиг.15В показана относительно небольшая интернализация в клетках с низкой экспрессией EFNA, и на Фиг.15Г показана значительная интернализация в клетках, экспрессирующих высокие уровни EFNA;

На Фиг.16А-16Е представлено доказательство того, что раскрытые модуляторы можно эффективно использовать в качестве группировок направленной доставки, чтобы направлять цитотоксические полезные грузы в клетки, экспрессирующие лиганды эфрины А, где нисходящая кривая свидетельствует о гибели клеток в результате интернализации, и где на Фиг.16А показано поражающее действие модулятора SC4.5, на Фиг.16Б показана способность выбранных модуляторов к интернализации и поражающему действию в отношении NTX опухолевых клеточных линий легких и кожи, на Фиг.16В и 16Г показано, что модуляторы переносят присоединенный цитотоксин в клетки HEK293T (Фиг.16С) и клетки HEK-.hEFNA4 (Фиг.16Г), на Фиг.16Д показано, что гуманизированные модуляторы взаимодействуют аналогично и на Фиг.16Е показана гибель целевых клеток, экспрессирующих мышиный или человеческий лиганд эфрин А4 (обратите внимание, что на Фиг.16 модуляторы могут быть названы Е, а не SC4);

На Фиг.17А-17Д графически представлены различные аспекты биохимического анализа, демонстрирующие способность раскрытых модуляторов обнаруживать секретируемый лиганд эфрин А4, при этом на Фиг.17А представлена стандартная кривая, на Фиг.17Б количественно определен уровень секретируемого EFNA из выбранных гематологических опухолей, на Фиг.17В представлена корреляция между объемом опухоли и секретируемым EFNA, на Фиг.17Г установлен диапазон циркулирующего в крови лиганда эфрина А у здоровых взрослых людей и на Фиг.17Д показано, что пациенты с выбранными солидными опухолями имеют значительно более высокий уровень циркулирующего в крови лиганда эфрина А;

На Фиг.18А-18В представлены графики, иллюстрирующие, что различные модуляторы лиганда эфрина А можно использовать в качестве группировок направленной доставки для соединения цитотоксических полезны грузов с выбранными клетками, где нисходящая кривая свидетельствует о клеточной гибели в результате интернализации токсина и где на Фиг.18А-18В, конкретно показана способность модуляторов SC4.2.1 (или Е2.1) и SC9.65 (или 9М065) опосредовать гибель клеток HEK293T, сверхэкспрессирующих лиганд эфрин А4 (Фиг.18А), лиганд эфрин А4 (Фиг.18Б) и лиганд эфрин А1 (Фиг.18В) в присутствии связанного сапорина;

На Фиг.19А и 19Б показана способность лигандов эфринов А селективно взаимодействовать с многочисленными рецепторами ЕРНА (эфрина А), где клетки HEK293T лишь незначительно связываются с конструкциями рецептора ЕРНА-ECD-Fc посредством эндогенно экспрессированных лигандов эфринов А (Фиг.19А), в то время как клетки HEK293T.hEFNA4 в различной степени связываются со всеми протестированными конструкциями рецептора ЕРНА, за исключением ЕРНА1, который несвязан (Фиг.19Б); и

На Фиг.20А и 20Б показана способность лигандов эфринов А селективно взаимодействовать с рецепторами ЕРНВ (эфрин В), где клетки HEK293Т лишь в ограниченной степени связываются с конструкциями рецептора EPHB-ECD-Fc посредством эндогенно экспрессируемых лигандов эфринов А (Фиг.20А), в то время как клетки HEK293T.hEFNA4 связывают рецепторы ЕрпВ2, но не рецепторы EphB3 и EphB4 (Фиг.20Б).

Подробное описание изобретения

I. Введение

В то время как настоящее изобретение может быть воплощено во многих разных формах, здесь описаны его конкретные иллюстративные воплощения, которые иллюстрируют принципы изобретения. Следует отметить, что настоящее изобретение не ограничено конкретными, проиллюстрированными воплощениями. Кроме того, любые используемые здесь заголовки разделов, предназначены только для организационных целей и не должны быть истолкованы как ограничивающие описываемый объект.

Как уже упоминалось, неожиданно было обнаружено, что экспрессия лигандов эфринов А (или EFNA) связана с опухолевым ростом и гиперпролиферативными расстройствами и, что такие лиганды представляют собой полезные опухолевые маркеры, которые можно использовать в лечении связанных с этим заболеваний. Более конкретно, было обнаружено, что такие модуляторы EFNA, как описаны здесь, можно с успехом использовать в диагностике, терагнозисе, лечении или предупреждении опухолевых заболеваний у пациентов, нуждающихся в этом. Соответственно, в то время как предпочтительные воплощения изобретения будут подробно рассмотрены ниже, в частности, в контексте раковых стволовых клеток и их взаимодействий с раскрытыми модуляторами, специалистам в данной области понятно, что объем настоящего изобретения не ограничен такими иллюстративными воплощениями. Точнее, настоящее изобретение и прилагаемая формула изобретения в целом и определенно направлены на модуляторы EFNA и их применение в диагностике, терагнозисе, лечении или предупреждении различных EFNA-ассоциированных или -опосредованных расстройств, в том числе опухолевых или гиперпролиферативных расстройств, независимо от любого конкретного механизма действия или конкретного целевого опухолевого компонента.

Кроме того, следует понимать, что в отличие от многих раскрытий из уровня техники, настоящее изобретение в значительной степени направлено на модуляторы эфриновых лигандов (то есть EFN), а не модуляторы эфриновых рецепторов (то есть ЕРН). То есть, в то время как эфриновые рецепторы широко вовлечены в некоторые типы расстройств и обычно являются целью терапевтического вмешательства, эфриновые лиганды до сих пор привлекали меньше внимания. Частично это может быть результатом беспорядочного поведения, характерного для лигандов, и безосновательного мнения, что такие варьирующиеся взаимодействия делают их непригодными терапевтическими мишенями, так как избыточности путей, по всей вероятности, может компенсировать антагонизм любого лиганда. Однако, как здесь показано, раскрытые модуляторы лигандов эфринов А можно эффективно использовать для нацеливания на онкогенные клетки, и устранения или выведения из строя онкогенных клеток другим способом. Кроме того, в выбранных воплощениях настоящее изобретение включает пан-EFNA модуляторы, которые ассоциированы или взаимодействуют более чем с одним лигандом эфрином А, тем самым обеспечивая неожиданный аддитивный или синергический эффект, что может обеспечить пассивность более чем одного пути, опосредованного эфриновыми лигандами.

Помимо общей связи, охарактеризованной выше, авторы настоящего изобретения обнаружили до сих пор неизвестную фенотипическую связь между выбранными "опухоль-инициирующими клетками" (TIC) и лигандами эфринами А. В связи с этим было установлено, что выбранные TIC экспрессируют повышенные уровни лигандов эфринов А по сравнению с нормальными тканями и неонкогенными клетками (NTG), которые вместе составляют большую часть солидной опухоли. Таким образом, лиганды эфрины А содержат опухоль-ассоциированные маркеры (или антигены) и, как было обнаружено, обеспечивают эффективные агенты для обнаружения и подавления TIC и ассоциированной неоплазии из-за повышенных уровней белков на поверхностях клеток или в микроокружении опухоли. Более конкретно, также было обнаружено, что модуляторы EFNA, в том числе иммунореактивные антагонисты и антитела, которые соединяются или взаимодействуют с белками, эффективно снижают частоту появления опухоль-инициирующих клеток и, следовательно, полезны в устранении, подавлении активности, снижении, содействии дифференцировке или иным образом исключают или ограничивают способность этих опухоль-инициирующих клеток бездействовать и/или продолжать подпитывать рост опухоли, метастазирование или повторное появление у пациента. Как описано более подробно ниже, субпопуляция опухолевых клеток TIC состоит из клеток, поддерживающих опухоль (ТРС) и высокопролиферативных клеток-предшественников опухоли (TProg).

В свете этих открытий специалистам в данной области понятно, что в настоящем изобретении также предложены модуляторы EFNA и их применение в сокращении частоты появления опухоль-инициирующих клеток. Как будет подробно рассмотрено ниже, модуляторы EFNA по изобретению в широком смысле включают любое соединение, которое распознает, взаимодействует, конкурирует, проявляет антагонизм, взаимодействует, связывается, проявляет агонизм или соединяется с лигандом эфрином А или его геном. Посредством этих взаимодействий модуляторы EFNA снижают или уменьшают частоту появления опухоль-инициирующих клеток. Типичные модуляторы, описанные здесь, включают нуклеотиды, олигонуклеотиды, полинуклеотиды, пептиды или полипептиды. В некоторых предпочтительных воплощениях выбранные модуляторы включают антитела к EFNA или их иммунореактивные фрагменты или производные. Такие антитела могут быть антагонистическими или агонистическими по природе и возможно могут быть конъюгированы или соединены с цитотоксическим агентом. В других воплощениях модуляторы в рамках настоящего изобретения содержат EFNA-конструкцию, содержащую лиганд эфрин А или его реакционно-способный фрагмент. Следует понимать, что такие конструкции могут содержать слитые белки и могут включать реакционно-способные домены из других полипептидов, таких как иммуноглобулины или модификаторы биологического ответа. В других аспектах модулятор EFNA содержит совокупность нуклеиновых кислот, оказывающую нужные эффекты на уровне генома. Другие модуляторы, совместимые с данным руководством, будут подробно описаны ниже.

Независимо от выбранной, в конечном счете, формы модулятора, его предпочтительно выделяют и очищают перед введением субъекту. В связи с этим, термин "выделенный модулятор EFNA" следует понимать в широком смысле и в соответствии со стандартной фармацевтической практикой как обозначающий любой препарат или композицию, содержащую модулятор в состоянии, по существу, свободном от нежелательных примесей (биологических или иных). Как будет обсуждаться более подробно ниже, эти препараты могут быть очищены и приготовлены в нужной форме с использованием различных известных в данной области методов. Конечно, следует понимать, что такие "выделенные" препараты могут быть намеренно изготовлены или скомбинированы с инертными или активными ингредиентами, целесообразными для улучшения коммерческих, производственных или терапевтические аспектов готового продукта и получения фармацевтических композиций.

Физиология EFNA

Тирозинкиназы эфриновых рецепторов (ЕРН), трансмембранные белки 1 типа, составляют большое семейство рецепторных тирозинкиназ в геноме животных и взаимодействуют с эфриновыми лигандами (EFN), которые также соединены с клеточной поверхностью. Рецепторы ЕРН-подсемейства обычно имеют один киназный домен и внеклеточную область, содержащую Cys-богатый домен и 2 повтора фибронектина III типа. Условлено, что эфриновые рецепторы делятся на две группы на основании сходства последовательностей их внеклеточного домена и их аффинностей связывания с лигандами эфрином А и эфрином В. Предварительное исследование показало, что ЕРН-опосредованные сигналы контролируют многочисленные аспекты эмбрионального развития, в частности нервной системы, и являются важными медиаторами передачи информации между клетками, регулирующей прикрепление клеток, их форму и подвижность. Кроме того, многие члены семейства эфриновых рецепторов, в отличие от эфриновых лигандов, были идентифицированы в качестве важных маркеров и/или регуляторов развития и прогрессирования рака. В настоящее время известно девять рецепторов эфрина А и шесть рецепторов эфрина В.

В рамках настоящей заявки термины "эфриновый рецептор," "рецептор эфрина А", "рецептор эфрина В", "ЕРНА" или "ЕРНВ" (либо EphA, либо EphB) можно использовать взаимозаменяемо и они означают конкретное семейство, подсемейство или отдельный рецептор (то есть ЕРНА1, ЕРНА2, ЕРНА3, ЕРНА4, ЕРНА5, ЕРНА6, ЕРНА7, ЕРНА8, ЕРНА9, ЕРНВ1, ЕРНВ2, ЕРНВ3, ЕРНВ4, ЕРНВ5, ЕРНВ6), как диктует контекст.

На основании анализов последовательности, эфриновые лиганды можно разделить на две группы: шесть лигандов эфринов А (или EFNA), обычно прикрепленных к поверхности клетки посредством гликозилфосфатидилинозитольных связей (хотя в результате альтернативного сплайсинга мРНК эфрина образуются некоторые не-GPI-прикрепленные белки; например EFNA4) и три лиганда эфрина В (или EFNB), содержащие трансмембранный домен и короткую цитоплазматическую область с консервативными остатками тирозина и PDZ-связывающий мотив. Лиганды EFNA взаимодействуют предпочтительно с любым из девяти разных ЕРНА-рецепторов, в то время как лиганды EFNB взаимодействуют предпочтительно с любым из шести разных ЕРНВ-рецепторов, хотя сообщалось о некоторых конкретных перекрестных взаимодействиях EFNA-ЕРНВ и EFNB-EPHA.

В рамках настоящей заявки термины "эфриновый лиганд," "лиганд эфрин А4," "лиганд эфрин В" "EFNA" или "EFNB" можно использовать взаимозаменяемо и они означают конкретное семейство, подсемейство или отдельный лиганд (то есть EFNA1, EFNA2, EFNA3, EFNA4, EFNA5, EFNA6, EFNB1, EFNB2, EFNB3), как диктует контекст. Например, все термины "эфрин А4," лиганд эфрин А4" или "EFNA4" обозначают одно и то же семейство изоформ белка (например, как представлено на Фиг.1 В), в то время как термины "лиганд эфрин А4" и "ENFA" должны означать эфриновое подсемейство (то есть А в отличие от В), содержащее все шесть лигандов А типа и любые их изоформы. В связи с этим "модулятор эфрина А", модулятор лиганда эфрина А4" или "модулятор EFNA" означают любой модулятор (как определено здесь), который соединяется, связывается или взаимодействует с одним или более лигандами А типа или его изоформой, фрагментом или производным.

Более подробное обобщение наименований эфриновых рецепторов и лигандов можно найти в Таблице 1 ниже.

ТАБЛИЦА 1
Рецепторы Лиганды
новое название предыдущие названия новое название предыдущие названия
EphA1 Eph, Esk эфрин А1 В61; LERK-1, EFL-1
EphA2 Eck, Myk2, Sek2 эфрин А2 ELF-1; Cek7-L, LERK-6
EphA3 Cek4, Mek4, Hek, Tyro4; Hek4 эфрин A3 Ehk1-L, EFL-2, LERK-3
EphA4 Sek, Sek1, Cek8, Hek8, Tyrol эфрин А4 LERK-4; EFL-4
EphA5 Ehk1, Bsk, Cek7, Hek7; Rek7 эфрин А5 AL-1, RAGS; LERK-7, EFL-5
EphA6 Ehk2; Hek12 эфрин А6
EphA7 Mdk1, Hek11, Ehk3, Ebk, Cek11
EphA8 Eek; Hek3
EphA9
EphB1 Elk, Cek6, Net; Hek6 эфрин-В1 LERK-2, Elk-L, EFL-3, Cek5-L; STRA1
EphB2 Cek5, Nuk, Erk, Qek5, Tyro5, Sek3; Hek5, Drt эфрин-В2 Htk-L, ELF-2; LERK-5, NLERK-1
EphB3 Cek10, Hek2, Mdk5, Tyro6, Sek4 эфрин-В3 NLERK-2, Elk-L3, EFL-6, ELF-3; LERK-8
EphB4 Htk, Myk1, Tyro11; Mdk2
EphB5 Cek9; Hek9
EphB6 Мер

Eph Nomenclature Committee, Cell. 1997; 90 (3):403-4, включенный в данное описание изобретения во всей полноте посредством ссылки.

Как и в случаях со всеми взаимодействиями рецептора поверхности клетки с лигандом, вхождение эфринового рецептора в контакт с эфриновым лигандом в конечном счете приводит к активации внутриклеточных сигнальных каскадов. Хотя взаимодействия рецептор-лиганд могут происходить между молекулами на поверхности той же клетки (cis-взаимодействия), как правило, считается, что cis-взаимодействия не приводят к запуску сигнальных каскадов или что cis-взаимодействия могут фактически противодействовать сигнальным каскадам, инициированным trans-взаимодействиями (например, между рецепторами и лигандами на отдельных клетках). Один уникальный аспект EPH-EFN trans-взаимодействий заключается в способности запускать два сигнальных каскада при контакте рецептор-лиганд - прямой сигнальный каскад в клетке, экспрессирующей эфриновый рецептор, и обратный сигнальный каскад в клетке, экспрессирующей эфриновый лиганд. Активация двух отдельных сигнальных каскадов может отражать процессы сортировки клеток и клеточного позиционирования, в которые вовлечены EPH и EFN, чтобы совместно координировать эмбриональное развитие животных.

EPH-EFN сигнальные каскады часто активируют клеточные сигнальные пути, которые регулируют динамику цитоскелета и приводят к модулированию взаимодействий притяжения и отталкивания между разными типами клеток. В качестве обобщения, белки EPH и EFN находятся на гораздо более высоких уровнях во время эмбриогенеза по сравнению с уровнями, наблюдаемыми в тканях взрослого организма, хотя продолжительная низкоуровневая экспрессии у взрослых может отражать роль этих молекул в нормальной функции тканей, таких как кишечник взрослого субъекта, который имеет строго определенную архитектуру, возникающую в результате миграции дифференцированных клеток из их источника, тканевых стволовых клеток в криптах, в окончательное местоположение на поверхности ворсинок, направленных в просвет кишечника. Так как эфриновые рецепторы впервые были идентифицированы в гепатоцеллюлярных карциномах и экспрессия EPH и EFN, как правило, ограничена у взрослых, реактивация экспрессии эфриновых лигандов и/или эфриновых рецепторов в раковых образованиях у человека может быть связана с дедифференцировкой раковых клеток и/или способностью этих раковых клеток вторгаться в окружающую нормальную ткань и мигрировать от места первичной опухоли в отдаленные участки. Другие исследования показали, что взаимодействия EPH-EFN также играют определенную роль в неоангиогенезе.

В соответствии с обнаружением того, что взаимодействия EPH-EFN в нелимфоидных тканях регулируют клеточные взаимодействия путем образования сил притяжения или отталкивания между клетками посредством интегрина и перегруппировки цитоскелета, было показано, что молекулы ЕРН и EFN, обнаруженные на лимфоидных клетках, опосредуют клеточную адгезию к компонентам внеклеточного матрикса, хемотаксис и миграцию клеток. Например, было обнаружено, что вступление EFNA1 (который связывается с рецептором EpnA2 и содержит, например, аминокислотную последовательность под учетным номером в Genbank NM_004428) в контакт на первичных CD4 и CD8 Т-клетках стимулирует миграцию клеток и усиливает хемотаксис. Аналогично EFNA1, EFNA4 экспрессируется на первичных CD4 Т-клетках, но из-за неоднородного характера взаимодействий EPH-EFN, неясно оказывает ли контактирование с EFNA4 аналогичный эффект на эти клетки. Однако, было продемонстрировано, что зрелые человеческие В-лимфоциты экспрессируют EFNA4 и секретируют его при активации. Кроме того, EFNA4, в отличие от любой другой молекулы EFN или ЕРН, также стабильно экспрессируется на В-клетках или В-клетками пациентов с хроническим лимфолейкозом (CLL). Интересно, что экспрессия изоформ EFNA4, измеренная посредством Q-PCR (количественной PCR), может коррелировать с клиническим проявлением заболевания. Также показано, что В-клетки CLL-пациентов, имеющие повышенную экспрессию EFNA4, показывали ухудшение потенциала транс-эндотелиальной миграции по сравнению с В-клетками здоровых субъектов. Видимо, участие EFNA4 снижает способность CLL-клеток прикрепляться к молекулам внеклеточного матрикса и снижает их хемотаксический ответ на CCL1. Вместе эти сообщения свидетельствуют о роли EFNA4 в направленной миграции В- и Т-клеток и, при рассмотрении вместе с данными о внутриклеточной передаче сигналов, описанными выше, делают лиганды эфрины А и, в частности, EFNA4 очень интересными мишенями для разработки противораковых терапевтических средств.

В дополнение к вышеупомянутым характеристикам, настоящее описание изобретения показывает, что экспрессия EFNA4 повышена в различных популяциях раковых стволовых клеток. Наряду с сопутствующей активацией нескольких рецепторов ЕРНА в основном объеме опухоли, возникает возможность того, что ЕРМА4-опосредованные взаимодействия лиганда с рецептором могут инициировать клеточные сигнальные каскады, связанные с пролиферацией опухоли, неоангиогенезом и/или метастазированием опухоли. Не желая быть связанными с какой-либо конкретной теорией, полагают, что модуляторы EFNA4 по настоящему изобретению (в частности, антагонистические или нейтрализующие воплощения) действуют, по меньшей мере частично, путем или снижения частоты появления опухоль-инициирующих клеток или их элиминации, тем самым влияя на распространение или выживаемость опухоли иным образом, чем традиционные стандартные схемы лечения (например, иринотекан), или через иммунотерапевтическую передачу сигнала или доставку полезного груза, способного убить ЕРМА4-экспрессирующие клетки. Например, удаление ТРС посредством антагонизма к EFNA4 может включать просто стимуляцию клеточной пролиферации, несмотря на химиотерапевтическое лечение, устраняющее пролиферирующие клетки, или содействие дифференцировке ТРС таким образом, что их способность к самообновлению (то есть неограниченная пролиферация и поддержание мультипотентности) теряется. Альтернативно, в предпочтительных воплощениях можно избирательно убивать или иным образом выводить из строя ТРС посредством рекрутмента цитотоксических Т-клеток для атаки на ЕРМА4-экспрессирующие клетки или доставки эффективного токсина, конъюгированного с анти-ЕРМА4 антителом, способным к интернализации.

При использовании здесь термин EFNA4 (также известный как лиганд eph-родственной киназы 4, LERK4; или eph-родственный лиганд рецепторной тирозинкиназы 4, EFL-4) относится к природному человеческому EFNA4, если контекст не указывает на иное. Типичные ортологи белка EFNA4 включают, но не ограничиваются ими, человеческий (то есть DEFNA4, NP_005218, NP_872631 или NP_872632), мышиный (NPJ331936), шимпанзе (ХР_001153095, ХР_001152971, ХР_524893 и ХР_001152916) и крысиный (NP_001101162). Транскрибируемый ген EFNA4 человека содержит, как минимум 5817 п.о. из хромосомы 1. Были описаны три варианта транскрипта мРНК, каждый из которых возникает в результате альтернативного сплайсинга транскрибируемой РНК: (1) 1276 п.о. вариант (NM_005227; ЕРМА4-вариант транскрипта 1; SEQ ID NO:1), который кодирует 201-аминокислотный пропротеин (NP_005218; EFNA4 вариант a; SEQ ID NO:2); (2) 1110 п.о. вариант (NM_182689; ЕРМА4-вариант транскрипта 2), который кодирует 207-аминокислотный пропротеин (NM_872631; EFNA4 вариант b; SEQ ID NO:3); и (3) 1111 п.о. вариант (NM_182690; EFNA4 вариант транскрипта 3), который кодирует 193 аминокислотный пропротеин (NP_872632; EFNA4 вариант с; SEQ ID NO:4). Следует понимать, что каждый из человеческих белков EFNA4 включает предсказанную сигнальную или лидерную последовательность, содержащую аминокислоты 1-25 из SEQ ID NO:2, которая отсекается с получением зрелой формы этого белка (то есть 168-182 ак). Этот сигнальный пептид направляет полипептид к клеточной поверхности/секреторному пути. За счет альтернативного сплайсинга мРНК с последующим действием на последовательности, кодирующие белок, изоформы белка по-разному обрабатываются клеткой - изоформа а локализована на мембране и прикреплена к поверхности клетки посредством гликозилфосфатидилинозитольной (GPI) связи, в то время как изоформы b и с лишены GPI-прикрепляющей сигнальной последовательности и поэтому, как ожидается, секретируются клеткой. Выравнивание этих трех белковых изоформ человеческого EFNA4 показано на Фиг.1В. Как отмечено ранее, если иное не указано посредством непосредственной ссылки или контекстной необходимости, термин EFNA4 относится к изоформе а человеческого EFNA4 и иммунореактивным эквивалентам. Кроме того, следует понимать, что этот термин также может относиться к производному или фрагменту нативной или вариантной формы EFNA4, которая содержит эпитоп, с которым может специфически связываться антитело или иммунореактивный фрагмент.

II. Клетки, поддерживающие опухоль

В отличие от руководств в уровне техники, в настоящем изобретении предложены модуляторы EFNA, которые особенно полезны для нацеливания на опухоль-инициирующие клетки и особенно на клетки, поддерживающие опухоль, тем самым облегчая лечение, ведение или предупреждение опухолевых заболеваний. Более конкретно, как указано ранее, неожиданно было обнаружено, что специфические субпопуляции опухолевых клеток экспрессируют EFNA и, по-видимому, модифицируют локализованную координацию передачи сигналов посредством морфогена, важную для самообновления раковых стволовых клеток и выживаемости клеток. Таким образом, в предпочтительных воплощениях модуляторы EFNA можно использовать для снижения частоты появления опухоль-инициирующих клеток, в соответствии с настоящим руководством, и, тем самым, облегчения лечения и ведения гиперпролиферативных заболеваний.

При использовании здесь термин "опухоль-инициирующая клетка" (TIC) охватывает как клетки, поддерживающие опухоль (ТРС; то есть раковые стволовые клетки или CSC), так и высоко пролиферативные клетки-предшественники опухоли (называемые TProg), которые вместе, как правило, составляют уникальную субпопуляцию (то есть 0,1-40%) объема опухоли или массы. В данном описании термины "клетки, поддерживающих опухоль" и "раковые стволовые клетки" являются эквивалентными и могут быть использованы здесь взаимозаменяемо. Наоборот, ТРС отличаются от TProg тем, что они могут полностью повторять состав опухолевых клеток, существующий в опухоли, и обладают способностью к неограниченному самообновлению, как показано с помощью серийной трансплантации (два или более пассажей у мышей) небольших количеств выделенных клеток. Как будет обсуждаться более подробно ниже, сортировка флуоресцентно-активированных клеток (FACS) с использованием подходящих клеточных поверхностных маркеров представляет собой надежный способ выделения высоко обогащенных клеточных субпопуляций (чистота более 99,5%) благодаря, по меньшей мере частично, своей способности различать одиночные клетки и скопления клеток (то есть дублеты и т.д.). С помощью таких методов было показано, что при трансплантации мышам с ослабленным иммунитетом небольшого количества высокоочищенных клеток TProg, последние могут питать рост опухоли в первичном трансплантате. Однако в отличие от очищенных субпопуляций ТРС, TProg образовывали опухоли, которые не отражают полностью фенотипическую клеточную гетерогенность родительской опухоли и являются явно неэффективными в возобновлении серийного онкогенеза при последующих трансплантациях. Напротив, субпопуляции ТРС полностью восстанавливает клеточную гетерогенность родительских опухолей и могут эффективно инициировать опухоли при серийном выделении и трансплантации. Таким образом, специалистам в данной области понятно, что определяющей разницей между ТРС и TProg, хотя обе они могут индуцировать опухоли в первичных трансплантантах, является уникальная способность ТРС постоянно питать рост гетерогенной опухоли при серийных трансплантациях с небольшим числом клеток. Другие общие подходы для характеристики ТРС включают морфологию и определение клеточных поверхностных маркеров, транскрипционного профиля и реакцию на лекарственные средства, хотя экспрессия маркера может меняться в зависимости от условий культивирования и пассажа клеточной линии in vitro.

Соответственно, в контексте настоящего изобретения, клетки, поддерживающие опухоль, аналогично нормальным стволовым клеткам, которые поддерживают клеточную иерархию в нормальной ткани, предпочтительно, определяют по их способности к бесконечному самообновлению при сохранении способности к мультилинейной дифференцировке. Клетки, поддерживающие опухоль, таким образом, способны образовать как онкогенное потомство (то есть опухоль-инициирующие клетки: ТРС и TProg), так и неонкогенное (NTG) потомство. При использовании здесь, неонкогенные клетки (NTG) относятся к опухолевым клеткам, которые происходят из опухоль-инициирующих клеток, но сами по себе не обладают способностью к самообновлению или образованию гетерогенных линий опухолевых клеток, составляющих опухоль. В эксперименте NTG-клетки не способны воспроизводимо образовывать опухоли у мышей, даже при трансплантации избыточных количеств клеток.

Как указано, TProg также относятся к категории опухоль-инициирующих клеток (или TIC) благодаря их ограниченной способности генерировать опухоли у мышей. TProg являются потомством ТРС и обычно способны к конечному числу не-самообновляющихся клеточных делений. Кроме того, клетки TProg можно дополнительно разделить на ранние клетки-предшественники опухоли (ЕТР) и поздние клетки-предшественники опухоли (LTP), каждые из которых можно отличить по фенотипу (например, клеточным поверхностным маркерам) и разным способностям воссоздавать архитектуру опухолевой клетки. Несмотря на такие технические различия, и ЕТР, и LTP функционально отличаются от ТРС тем, что они, как правило, менее способны к серийному воссозданию опухолей при трансплантации небольших количеств клеток и, как правило, не отражают гетерогенность родительской опухоли. Несмотря на вышеуказанные различия, также было показано, что различные популяции TProg могут, в редких случаях, приобретать способность к самообновлению, обычно присущую стволовым клеткам, и сами становятся ТРС (или CSC). В любом случае оба типа опухоль-инициирующих клеток, по всей видимости, представлены в массе типичной опухоли одного пациента и подлежат лечению модуляторами, как описано здесь. То есть, описанные композиции, как правило, эффективны в снижении частоты появления или в изменении химиочувствительности таких EFNA-положительных опухоль-инициирующих клеток, независимо от конкретного воплощения или смеси, представленных в опухоли.

В контексте настоящего изобретения ТРС являются более онкогенными, относительно более неактивными и часто более химиорезистентными, чем TProg (как ЕТР, так и LTP), NTG-клетки и инфильтрующие опухоль клетки, происходящие не из ТРС, (например, фибробласты/строма, эндотелиальные и гемопоэтические клетки), которые составляют основной объем опухоли. Учитывая, что обычные способы лечения и схемы лечения, в значительной степени, были разработаны, чтобы уменьшать массу опухолей и атаковать быстро пролиферирующие клетки, ТРС, вероятно, являются более резистентными к обычным терапевтическим средствам и схемам лечения, чем быстро пролиферирующие TProg и другие клеточные популяции массивных опухолей. Кроме того, ТРС часто проявляют другие характеристики, которые делают их относительно химиорезистентными к обычным терапевтическим средствам, такие как повышенная экспрессия транспортеров множественной лекарственной резистентности, усиленные механизмы репарации ДНК и антиапоптотические белки. Эти свойства, каждое из которых вносит вклад в устойчивость ТРС к лекарственным средствам, является одной из причин неудач стандартных схем лечения онкологии в обеспечении длительной пользы для большинства пациентов с поздней стадией неоплазии; то есть не удается адекватно нацелиться и уничтожить те клетки, которые питают постоянный рост опухоли и ее повторное проявление (то есть ТРС или CSC).

В отличие от многих вышеупомянутых способов лечения из уровня техники, новые композиции по настоящему изобретению предпочтительно снижают частоту появления опухоль-инициирующих клеток при введении субъекту независимо от формы и конкретной мишени (например, генетический материал, EFNA-антитело или слитая лигандная конструкция) выбранного модулятора. Как отмечалось выше, снижение частоты появления опухоль-инициирующих клеток может происходить в результате а) удаления, истощения, сенсибилизации, подавления или ингибирования опухоль-инициирующих клеток; б) контролирования роста, распространения или повторного появления опухоль-инициирующих клеток; в) нарушения инициации, распространения, сохранения или пролиферации опухоль-инициирующих клеток; или г) препятствования иным способом выживаемости, регенерации и/или метастазированию онкогенных клеток. В некоторых воплощениях снижение частоты появления опухоль-инициирующих клеток происходит в результате изменения одного или более физиологических путей. Изменение пути посредством сокращения или удаления опухоль-инициирующих клеток или модификации их активности (например, индуцированная дифференцировка, нарушение ниши) или иное вмешательство в их способность оказывать воздействие на окружение опухоли или другие клетки, в свою очередь обеспечивает возможность более эффективного лечения EFNA-ассоциированных расстройств путем ингибирования онкогенеза, ингибирования поддержания опухоли и/или метастазирования и повторного появления.

В число методов, которые можно использовать для оценки такого сокращения частоты появления опухоль-инициирующих клеток, входит анализ методом серийных разведений либо in vitro, либо in vivo, предпочтительно с последующим подсчетом с использованием статистических параметров распределения Пуассона или оценкой частоты появления предварительно установленных определяющих событий, таких как наличие или отсутствие способности генерировать опухоли in vivo. В то время как такой анализ методом серийных разведений является предпочтительным методом подсчета снижения частоты появления опухоль-инициирующих клеток, другие менее требовательные методы также могут быть использованы для эффективного, хотя и немного менее точного, определения нужных значений, и являются полностью совместимые с данным руководством. Таким образом, как очевидно специалистам в данной области, также можно определить снижение значений частоты появления с помощью хорошо известных методов проточной цитометрии или иммуногистохимического анализа. В отношении всех указанных выше способов см., например, Dylla et al. 2008, PMCID: PMC2413402 и Hoey et al. 2009, PMID: 19664991; каждый из которых включен в данную заявку посредством ссылки во всей полноте.

Что касается анализа методом серийных разведений, in vitro подсчет частоты появления опухоль-инициирующих клеток может быть осуществлен путем помещения либо фракционированных, либо нефракционированных опухолевых клеток человека (например, из обработанных и необработанных опухолей соответственно) в ростовые условия in vitro, которые способствуют колониеобразованию. Таким образом, колониеобразующие клетки можно сосчитать с помощью простого подсчета и характеристики колоний, или посредством анализа, состоящего, например, из помещения человеческих опухолевых клеток в планшеты в серийных разведениях и оценки каждой лунки, либо как положительной, либо как отрицательной в отношении образования колоний по меньшей мере через 10 суток после посева. Эксперименты или анализы с серийным разведением in vivo, которые, как правило, являются более точными в их способности определить частоту появления опухоль-инициирующих клеток, включают трансплантацию человеческих опухолевых клеток, либо из необработанного контроля, либо из обработанных клеток, например мышам с ослабленным иммунитетом в серийных разведениях, и последующую оценку каждой мыши либо как положительную, либо как отрицательную в отношении образования опухоли через по меньшей мере 60 суток после трансплантации. Выведение значений частоты появления клеток посредством анализа методом серийных разведений in vitro или in vivo предпочтительно получали, используя статистические параметры распределения Пуассона к известной частоте появления положительных и отрицательных событий, тем самым получая частоту событий, соответствующих определению положительного события; в данном случае образования колонии или опухоли соответственно.

Что касается других методов, совместимых с настоящим изобретением, которые можно использовать для вычисления частоты появления опухоль-инициирующих клеток, наиболее распространенными являются методы количественной проточной цитометрии и метода иммуногистохимического окрашивания. Хотя эти методы не так точны, как анализ методом серийных разведений, описанный непосредственно выше, эти методики гораздо менее трудоемки и обеспечивают приемлемые значения за относительно короткий период времени. Таким образом, следует понимать, что специалист может применять определение профиля маркеров клеточной поверхности с помощью проточной цитометрии с использованием одного или более антител или реагентов, связывающих белки клеточной поверхности, которыми, как известно из уровня техники, богаты опухоль-инициирующие клетки (например, потенциально совместимые маркеры, как описано в Примере 1 ниже) и таким образом измерять уровень TIC в различных образцах. С помощью еще одного совместимого метода специалист в данной области может определить частоту появления TIC in situ (например, в срезе ткани) посредством иммуногистохимии с использованием одного или более антител или реагентов, которые способны связывать белки клеточной поверхности, которыми, как предполагается, отличаются эти клетки.

Используя любой из вышеупомянутых методов, можно затем количественно определить снижения частоты появления TIC (или ТРС в них), обеспечиваемую раскрытыми модуляторами EFNA (в том числе конъюгированными с цитотоксическими агентами) в соответствии с руководством в данной заявке. В некоторых случаях соединения по настоящему изобретению могут снижать частоту появления TIC (с помощью различных механизмов, указанных выше, включая удаление, индуцированную дифференцировку, разрушение ниши, подавление и т.д.) на 10%, 15%, 20%, 25%, 30% или даже на 35%. В других воплощениях снижение частоты появления TIC может составлять около 40%, 45%, 50%, 55%, 60% или 65%. В некоторых воплощениях раскрытые соединения могут снижать частоту появления TIC на 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или даже 95%. Конечно, следует понимать, что любое снижение частоты появления TIC вероятно приведет к соответствующему снижению онкогенности, устойчивости, повторного проявления и агрессивности неоплазии.

III. Модуляторы EFNA

В любом случае настоящее изобретение направлено на применение модуляторов EFNA, в том числе антагонистов EFNA, для диагностики, лечения и/или профилактики любой из большого количества EFNA-ассоциированных злокачественных опухолей. Раскрытые модуляторы можно использовать отдельно или в сочетании с широким спектром противораковых соединений, таких как химиотерапевтические или иммунотерапевтические агенты или модификаторы биологического ответа. В других выбранных воплощениях два или более отдельных модуляторов EFNA можно использовать в комбинации, чтобы обеспечить усиленные противоопухолевые эффекты или можно использовать для изготовления полиспецифических конструкций.

В некоторых воплощениях модуляторы EFNA по настоящему изобретению содержат нуклеотиды, олигонуклеотиды, полинуклеотиды, пептиды или полипептиды. Еще более предпочтительно модуляторы содержат растворимый EFNA (sEFNA) или его форму, вариант, производное или фрагмент, в том числе, например, слитые EFNA-конструкции (например, EFNA-Fc, EFNA-нацеленная группировка и т.д.) или конъюгаты EFNA (например, ЕРМА-РЕС(полиэтиленгликоль), EFNA-цитотоксический агент, EFNA-BRM(модификатор биологического ответа) и т.д.). Следует также иметь в виду, что в других воплощениях модуляторы EFNA включают антитела (например, анти-EFNA1 или aHTH-EFNA4 mAb (моноклональные антитела)), или их иммунореактивные фрагменты или производные. В особенно предпочтительных воплощениях модуляторы по настоящему изобретению содержат нейтрализующие антитела или их производные или фрагменты. В других воплощениях модуляторы EFNA могут содержать интернализованные антитела или их фрагменты. В других воплощениях модуляторы EFNA могут содержать истощающие антитела или их фрагменты. Кроме того, как и вышеупомянутые слитые конструкции, эти антительные модуляторы могут быть конъюгированы, связаны или иным образом соединены с выбранными цитотоксическими агентами, полимерами, модификаторами биологического ответа (BRM) и т.п. для обеспечения направленной иммунотерапии с различными (и, возможно, многочисленными) механизмами действия. Как упоминалось выше, такие антитела могут быть пан-EFNA антителами и соединяться с двумя или более лигандами эфринами А или иммуноспецифическими антителами, которые селективно взаимодействуют с одним из шести лигандов эфринов А. В других воплощениях модуляторы могут работать на генетическом уровне и могут содержать такие компоненты, как антисмысловые конструкции, миРНК (малые интерферирующие РНК), микроРНК и т.п.

На основании руководства данной заявки специалистам в данной области понятно, что особенно предпочтительные воплощения изобретения могут включать SEFNA4 или sEFNA1 или антитела-модуляторы, которые ассоциированы с одним или с обоими из EFNA4 или EFNA1.

Кроме того, следует понимать, что раскрытые модуляторы EFNA могут истощать, подавлять активность, нейтрализовать, устранять или ингибировать рост, размножение или выживаемость опухолевых клеток, в частности ТРС и/или ассоциированную неоплазию посредством различных механизмов, включая агонизм и антагонизм выбранных путей или устранение специфических клеток в зависимости, например, от формы модулятора EFNA, любой присоединенной полезной нагрузки или дозы и способа доставки. Соответственно, в то время как предпочтительные воплощения, раскрытые в данной заявке, направлены на истощение, ингибирование или подавление субпопуляций специфических опухолевых клеток, таких как клетки, поддерживающие опухоль, следует подчеркнуть, что такие воплощения являются только иллюстративными, и ни в каком смысле не ограничивающими. Скорее, как изложено в прилагаемой формуле изобретения, настоящее изобретение в широком смысле направлено на модуляторы EFNA и их применение в лечении, терапии или профилактике различных EFNA-ассоциированных гиперпролиферативных расстройств независимо от любого конкретного механизма или целевой популяции опухолевых клеток.

В том же смысле раскрытые воплощения настоящего изобретения могут включать один или более антагонистов EFNA. В связи с этим следует понимать, что антагонисты EFNA по настоящему изобретению могут включать любой лиганд, полипептид, пептид, слитый белок, антитело или его иммунологически активный фрагмент или производное, который распознает, вступает во взаимодействие, связывается, объединяется, конкурирует, соединяется или иным образом взаимодействует с белком EFNA или его фрагментом и устраняет, подавляет активность, уменьшает, ингибирует, препятствует, сдерживает или контролирует рост опухоль-инициирующих клеток или других опухолевых клеток, включая клетки опухолевой массы или NTG. В выбранных воплощениях модулятор EFNA включает антагонист EFNA.

При использовании здесь "антагонист" относится к молекуле, способной нейтрализовать, блокировать, ингибировать, отменять, уменьшать или служить препятствием активностям конкретного или специфического белка, включая связывание рецепторов с лигандами или взаимодействие ферментов с субстратами. В более общем смысле антагонисты по изобретению могут включать антитела и их антиген-связывающие фрагменты или производные, белки, пептиды, гликопротеины, гликопептиды, гликолипиды, полисахариды, олигосахариды, нуклеиновые кислоты, антисмысловые конструкции, миРНК, микроРНК, биоорганические молекулы, пептидомиметики, фармакологические агенты и их метаболиты, последовательности, контролирующие транскрипцию и трансляцию, и тому подобное. Антагонисты также могут включать низкомолекулярные ингибиторы, слитые белки, рецепторные молекулы и производные, которые специфически связываются с белком, тем самым блокируя его связывание с целевым субстратом, антагонистические варианты белка, антисмысловые молекулы, направленные на белок, РНК-аптамеры и рибозимы против белка.

При использовании здесь и применении к двум или более молекулам или соединениям, термины "узнает" или "соединяется" означают реакцию, связывание, специфическое связывание, комбинацию, взаимодействие, соединение, связь, объединение, слияние, поглощение или присоединение, ковалентное или нековалентное, молекул, где одна молекула оказывает эффект на другую молекулу.

Кроме того, как показано в примерах в данной заявке, некоторые модуляторы EFNA человека могут, в некоторых случаях, перекрестно реагировать с EFNA видов, не являющихся человеком (например, мыши). В других случаях типичные модуляторы могут быть специфичными к одной или более изоформам EFNA человека и не демонстрировать перекрестную реакцию с ортологами EFNA других видов. Конечно, в сочетании с идеями данной заявки такие воплощения могут включать пан-EFNA антитела, которые связываются с двумя или более лигандами эфринами А одного вида, или антитела, которые исключительно соединяются с одним лигандом эфрином А.

В любом случае, как будет обсуждаться более подробно ниже, специалистам в данной области очевидно, что раскрытые модуляторы можно использовать в конъюгированной или неконъюгированной форме. Таким образом, модулятор может быть соединен или конъюгирован (например, ковалентно или нековалентно) с фармацевтически активными компонентами, модификаторами биологического ответа, противораковыми агентами, цитотоксическими или цитостатическими агентами, диагностическими группировками или биосовместимыми модификаторами. В этом отношении следует иметь в виду, что такие конъюгаты могут включать пептиды, полипептиды, белки, слитые белки, молекулы нуклеиновой кислоты, малые молекулы, миметики, синтетические лекарственные препараты, неорганические молекулы, органические молекулы и радиоизотопы. Кроме того, как указано в данном описании, выбранный конъюгат может быть ковалентно или нековалентно связан с модулятором EFNA в различных молярных соотношениях в зависимости, по меньшей мере частично, от метода, используемого для осуществления конъюгации.

Антитела

а. Обзор

Как уже упоминалось, особенно предпочтительные воплощения настоящего изобретения включают модуляторы EFNA в форме антител. Термин антитело используется в наиболее широком смысле и конкретно включает синтетические антитела, моноклональные антитела, олигоклональные или поликлональные антитела, мультиклональные антитела, рекомбинантные антитела, интратела, полиспецифические антитела, биспецифические антитела, моновалентные антитела, поливалентные антитела, человеческие антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела, CDR-привитые антитела, приматизированные антитела, Fab-фрагменты, F(ab′)-фрагменты, одноцепочечные FvFcs (scFvFc), одноцепочечные Fvs (scFv), антиидиотипические (анти-Id) антитела и любые другие иммунологически активные фрагменты антител, при условии, что они проявляют нужную биологическую активность (то есть соединение или связывание с EFNA). В более широком смысле, антитела по настоящему изобретению включают иммуноглобулиновые молекулы и иммунологически активные фрагменты иммуноглобулиновых молекул, то есть молекулы, которые содержат антиген-связывающий сайт, причем эти фрагменты могут быть или могут не быть слитыми с другим иммуноглобулиновым доменом, включая, но не ограничиваясь ими, с Fc-участком или его фрагментом. Кроме того, как описано более подробно в данной заявке, термины "антитело" и "антитела" в частности включают Fc-варианты, как описано ниже, в том числе полноразмерные антитела и варианты Fc-слияний, содержащие Fc-участки или их фрагменты, возможно содержащие по меньшей мере одну модификацию аминокислотного остатка и слитые с иммунологически активным фрагментом иммуноглобулина.

Как описано более подробно ниже, общие термины "антитело" или "иммуноглобулин" содержат пять различных классов антител, которые можно различить биохимически и, в зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей, можно легко отнести к соответствующему классу. В силу исторических причин основные классы интактных антител называются IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. У человека классы IgG и IgA можно дополнительно разделить на признанные подклассы (изотипы), то есть IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2 в зависимости от структуры и некоторых биохимических свойств. Следует понимать, что изотипы IgG у человека названы в порядке их распространенности в сыворотке, причем наиболее распространенным является IgG1.

Хотя все пять классов антител (то есть IgA, IgD, IgE, IgG и IgM) и все изотипы (то есть IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2), а также их варианты входят в объем настоящего изобретения, предпочтительные воплощения, включающие класс иммуноглобулина IgG обсуждаются более подробно исключительно для иллюстрации. Однако следует понимать, что такое описание просто демонстрирует типичные композиции и способы осуществления настоящего изобретения на практике и никоим образом не ограничивают объем изобретения или прилагаемую формулу изобретения.

В этом отношении человеческие иммуноглобулины IgG содержат две идентичные легкие полипептидные цепи с молекулярной массой приблизительно 23000 дальтон и две идентичные тяжелые цепи с молекулярной массой 53000-70000 в зависимости от изотипа. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам антител, обозначаются соответствующей строчной греческой буквой α, δ, ε, γ и µ соответственно. Легкие цепи антител из любого вида позвоночных могут быть отнесены к одному из двух четко отличающихся типов, называемых каппа (κ) и лямбда (λ), на основании аминокислотных последовательностей их константных доменов. Специалистам в данной области понятно, что структуры субъединиц и трехмерные конфигурации разных классов иммуноглобулинов хорошо известны.

Четыре цепи соединены дисульфидными связями в Y-конфигурацию, где легкие цепи захватывают в вилку тяжелые цепи, начиная с устья Y и далее через вариабельную область до двух концов Y. Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, в то время как две дисульфидные связи в шарнирной области соединяют тяжелые цепи. Соответствующие тяжелые и легкие цепи также имеют расположенные на регулярном расстоянии друг от друга внутрицепочечные дисульфидные мостики, число которых может меняться в зависимости от изотипа IgG.

Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (VH), за которым следует ряд константных доменов. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен на одном конце (VL) и константный домен на другом конце; константный домен легкой цепи выровнен с первым константным доменом тяжелой цепи, и вариабельный домен легкой цепи выровнен с вариабельным доменом тяжелой цепи. В связи с этим следует понимать, что вариабельные домены участков как легкой (VL), так и тяжелой (VH) цепи определяют антигенное распознавание и специфичность к антигену. Напротив, константные домены легкой цепи (CL) и тяжелой цепи (CH1, CH2 или CH3) придают и регулируют важные биологические свойства, такие как секреция, трансплацентарная подвижность, время полужизни в кровотоке, связывание комплемента и тому подобное. Принято, что нумерация доменов константной области увеличивается по мере удаления от сайта связывания антигена или амино-конца антитела. Таким образом, амино- или N-конец антитела содержит вариабельную область, а карбокси- или С-конец содержит константную область. Таким образом, CH3 и CL домены фактически включают карбокси-конец тяжелой и легкой цепи соответственно.

Термин "вариабельный" связан с тем, что некоторые участки вариабельных доменов значительно различаются своими последовательностями у иммуноглобулинов и эти горячие точки в значительной степени определяют связывание и специфические характеристик конкретного антитела. Эти гипервариабельные сайты проявляются в трех сегментах, известных как области, определяющие комплементарность (CDR), в вариабельных доменах как легкой цепи, так и тяжелой цепи соответственно. Наиболее консервативные участки вариабельных доменов, фланкирующие CDR, называются каркасными участками (FR). Более конкретно, в природных мономерных IgG-антителах шесть CDR, присутствующих на каждом плече, представляют собой короткие, несоприкасающиеся аминокислотные последовательности, которые специфически расположены с образованием антиген-связывающего сайта, когда антитело приобретает свою трехмерную конфигурацию в водной среде.

Каркасные участки, содержащие остатки вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи, демонстрируют меньшую межмолекулярную вариабельность аминокислотной последовательности. Скорее, каркасные участки большей частью принимали β-складчатую конформацию, а CDR образовывали петли, которые соединялись и в некоторых случаях образовывали часть β-складчатой структуры. Таким образом, эти каркасные участки действуют, чтобы сформировать остов, который обеспечивает размещение шести CDR в правильной ориентации посредством межцепочечных нековалентных взаимодействий. Антиген-связывающий сайт, образованный таким образом расположенными CDR, определяет поверхность, комплементарную эпитопу на иммунореактивном антигене (то есть EFNA4). Эта комплементарная поверхность способствует нековалентному связыванию антитела с эпитопом иммунореактивного антигена. Понятно, что положения CDR могут быть легко определены специалистом в данной области техники.

Как описано более подробно ниже и показано в прилагаемых Примерах, все или часть вариабельных областей тяжелой и легкой цепи могут быть рекомбинированы или сконструированы с использованием стандартных методов рекомбинации и экспрессии с получением эффективных антител. То есть вариабельная область тяжелой или легкой цепи из первого антитела (или любой ее участок) может быть смешана и подобрана к любому выбранному участку вариабельной области тяжелой или легкой цепи из второго антитела. Например, в одном воплощении, целая вариабельная область легкой цепи, содержащая три CDR легкой цепи первого антитела, может быть спарена с целой вариабельной областью тяжелой цепи, содержащей три CDR тяжелой цепи второго антитела с получением функционального антитела. Кроме того, в других воплощениях отдельные CDR тяжелой и легкой цепи, полученные из различных антител, могут быть смешаны или подобраны с получением нужного антитела, имеющего оптимизированные характеристики. Таким образом, типичное антитело может содержать три CDR легкой цепи из первого антитела, два CDR тяжелой цепи, полученной из второго антитела, и третий CDR тяжелой цепи из третьего антитела.

Более конкретно, в контексте настоящего изобретения следует понимать, что любая из раскрытых CDR тяжелой и легкой цепи на Фиг.7А может быть перегруппирована таким образом, чтобы получить оптимизированные анти-EFNA (например, анти-пЕРМА4) антитела согласно настоящему руководству. То есть одна или более CDR, раскрытых в Фиг.7А, могут быть включены в модулятор EFNA и, в особенно предпочтительных воплощениях, в CDR-привитое или гуманизированное антитело, которое иммуноспецифически связывается с одним или более лигандами эфринами А.

В любом случае, номера остатков области, определяющей комплементарность, можно определить по Kabat et al. (1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va.), в частности остатки 24-34 (CDR1), 50-56 (CDR2) и 89-97 (CDR3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (CDR1), 50-65 (CDR2) и 95-102 (CDR3) в вариабельном домене тяжелой цепи. Следует обратить внимание, что CDR значительно варьируются от антитела к антителу (и в сущности не проявляют гомологии с консенсусными последовательностями Kabat). Максимальное выравнивание остатков каркаса часто требует вставки спейсерных остатков в системе нумерации, используемой для области Fv. Кроме того, идентичность некоторых отдельных остатков для любого взятого номера положения по Kabat может варьироваться от одной цепи антитела к другой цепи антитела из-за межвидовой или аллельной дивергенции. См. также Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342, pp.877-883 (1989) и MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), где определения включают перекрывание или подмножества аминокислотных остатков при сравнении друг с другом. Каждая из вышеупомянутых работ включена в данную заявку посредством ссылки во всей полноте, и аминокислотные остатки, которые охватывают CDR, как определено в каждой из вышеупомянутых ссылок, приведены для сравнения.

Определения CDR

Kabat1 Chothia2 MacCallum3
VH CDR1 31-35 26-32 30-35
VH CDR2 50-65 53-55 47-58
VH CDR3 95-102 96-101 93-101
VL CDR1 24-34 26-32 30-36
VL CDR2 50-56 50-52 46-55
VL CDR3 89-97 91-96 89-96

1Нумерация остатков согласно номенклатуре Kabat et al., выше

2Нумерация остатков согласно номенклатуре Chothia et al., выше

3Нумерация остатков согласно номенклатуре MacCallum et al., выше

Для удобства CDR, представленные на Фиг.7А (SEQ ID NO:8-59 и 70-95), определены с использованием номенклатуры Chothia et al., хотя, с учетом содержания данной заявки, специалист в данной области может легко идентифицировать и пронумеровать CDR по Kabat et al. или по MacCallum et al. для каждой соответствующей последовательности тяжелой и легкой цепи. В связи с этим, CDR, определенные по Kabat et al., использовали для анализа гуманизации, изложенного в Примере 7(b), и подчеркнуты на Фиг.7П-7Т (SEQ ID NO:148-163), где изображены последовательности гуманизированных антител в соответствии с настоящим изобретением. Соответственно, антитела, содержащие CDR, определенные согласно всем таким системам нумерации, включены в объем настоящего изобретения. В более широком смысле термин "аминокислотный остаток вариабельной области CDR" включает аминокислоты в CDR, определенные при использовании любого основанного на последовательности или структуре метода, как изложено выше.

При использовании здесь термин "аминокислотные остатки каркасного участка(РР) вариабельной области" относится к аминокислотам каркасного участка цепи Ig. Термин "каркасный участок" или "FR-участок", при использовании здесь, включает аминокислотные остатки, которые являются частью вариабельной области, но не частью CDR (например, с использованием определения CDR по Kabat). Следовательно, каркасный участок вариабельной области является прерывистой последовательностью длиной примерно 100-120 аминокислот, но включает только аминокислоты, расположенные за пределами CDR.

В качестве конкретного примера вариабельной области тяжелой цепи и CDR, определенных по Kabat et al., каркасный участок 1 соответствует домену вариабельной области, содержащему аминокислоты 1-30; каркасный участок 2 соответствует домену вариабельной области, содержащему аминокислоты 36-49; каркасный участок 3 соответствует домену вариабельной области, содержащему аминокислоты 66-94, и каркасный участок 4 соответствует домену вариабельной области от аминокислоты 103 до конца вариабельной области. Каркасные участки легкой цепи аналогично разделены каждой из вариабельных областей CDR легкой цепи. Аналогично, используя определения CDR по Chothia et al. или по McCallum et al. границы каркасные участки разделены соответствующими окончаниями CDR, как описано выше.

Учитывая вышеупомянутые структурные соображения, специалистам в данной области понятно, что антитела по настоящему изобретению могут включать любое из ряда функциональных воплощений. В этом отношении, совместимые антитела могут включать любое иммунореактивное антитело (как этот термин определен в данном описании), которое обеспечивает нужный физиологический ответа у субъекта. В то время как любые раскрытые антитела можно использовать в сочетании с идеями настоящего изобретения, определенные воплощения изобретения включают химерные, гуманизированные или человеческие моноклональные антитела или их иммунореактивные фрагменты. Тем не менее, другие воплощения могут, например, включать гомогенные или гетерогенные мультимерные конструкции, Fc-варианты и конъюгированные или измененные посредством гликозилирования антитела. Кроме того, следует понимать, что такие конфигурации не являются взаимоисключающими и, что совместимые отдельные антитела могут включать один или более функциональных аспектов, раскрытых в данной заявке. Например, совместимое антитело может включать одноцепочечное диатело с гуманизированными вариабельными областями или полноразмерное полностью человеческое антитело IgG3 с модификациями Fc, которые меняют профиль гликозилирования для изменения времени полужизни в сыворотке. Другие типичные воплощения очевидны специалистам в данной области и могут быть легко узнаны как входящие в объем изобретения.

б. Получение антител

Хорошо известно, что различные животные-хозяева, в том числе кролики, мыши, крысы и т.д. могут быть привиты и использованы для получения антител в соответствии с идеями данной заявки. Известные в данной области адъюванты, которые можно использовать для усиления иммунного ответа, в зависимости от вида привитого животного, включают, но не ограничиваются ими, адъювант Фрейнда (полный и неполный), минеральные гели, такие как гидроксид алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, плюроновые полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианины фиссурелии, динитрофенол, и потенциально полезные адъюванты человека, такие как BCG (бацилла Кальметта-Герена), а также Corynebacterium parvum. Такие адъюванты могут защитить антиген от быстрого рассредоточения путем ограничения его в локальном отложении, или они могут содержать вещества, которые стимулируют организмы-хозяева секретировать факторы хемотаксические для макрофагов и других компонентов иммунной системы. Предпочтительно, при введении полипептида схема иммунизации будет включать два или более введений полипептида, произведенных в течение несколько недель.

После иммунизации животного иммуногеном EFNA (например, растворимым EFNA4 или EFNA1), который может содержать выбранные изоформы и/или пептиды, или живыми клетками или клеточными препаратами, экспрессирующими нужный белок, антитела и/или антитело-продуцирующие клетки можно получить из этого животного, используя известные в данной области методы. В некоторых воплощениях поликлональную анти-EFNA антитело-содержащую сыворотку получают посредством обескровливания или умерщвления животного. Сыворотку можно использовать в исследовательских целях в форме, полученной из животного, или, альтернативно, анти-EFNA антитела могут быть частично или полностью очищены с получением иммуноглобулиновых фракций или гомогенных препаратов антител.

в. Моноклональные антитела

В то время как поликлональные антитела могут быть использованы в некоторых аспектах настоящего изобретения, предпочтительные воплощения включают использование EFNA-реакционно-способных моноклональных антител. При использовании здесь, термин "моноклональное антитело" или "mAb" относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, то есть отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных мутаций, например естественных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Таким образом, модификатор моноклональное указывает, что антитела по природе не является смесью отдельных антител и может быть использовано вместе с любым типом антитела. В некоторых воплощениях такое моноклональное антитело включает антитело, содержащее полипептидную последовательность, которая связывается или соединяется с EFNA, где EFNA-связывающую полипептидную последовательность получали посредством процесса, включающего селекцию одной связывающей мишень полипептидной последовательности из множества полипептидных последовательностей.

В предпочтительных воплощениях антитело-продуцирующие клеточные линии получают из клеток, выделенных из иммунизированного животного. После иммунизации животное умерщвляют и лимфатические узлы и/или В-клетки селезенки иммортализуют хорошо известными в данной области способами, как показано в прилагаемых Примерах. Методы иммортализации клеток включают, без ограничения ими, трансфекцию их онкогенами, инфицирование их онкогенным вирусом и культивирование их в условиях, селетирующих иммортализованные клетки, воздействие на них карценогенных или мутагенных соединений, слияние их с иммортализованной клеткой, например клеткой миеломы, и инактивацию генов-супрессоров опухолей. При слиянии с клетками миеломы, клетки миеломы предпочтительно не секретируют полипептиды иммуноглобулинов (несекреторная клеточная линия). Иммортализованные клетки подвергали скринингу с использованием лиганда эфрина А (включая выбранные изоформы) или его иммунореактивного участка. В предпочтительном воплощении первичный скрининг выполняли с использованием иммуноферментного анализа (ELISA) или радиоиммуноанализа.

В общем случае, отдельные моноклональные антитела в соответствии с настоящим изобретением могут быть приготовлены с использованием разнообразных методов, известных в данной области техники, включая гибридомы, рекомбинантные методы, технологии фагового дисплея, дрожжевые библиотеки, трансгенных животных (например, XenoMouse® или HuMAb Mouse®) или их комбинации. Например, моноклональные антитела могут быть получены с использованием метода гибридомы, как в общих чертах описано выше и более подробно в Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling, et al., в: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981), каждый из которых включен в данную заявку. Используя описанные протоколы, антител предпочтительно генерируют у млекопитающих посредством множества подкожных или внутрибрюшинных инъекций соответствующего антигена и адъюванта. Как обсуждалось ранее, эта иммунизация обычно вызывает иммунный ответ, который включает продукцию антиген-реактивных антител (которые могут быть полностью человеческими, если иммунизированное животное является трансгенным) из активированных спленоцитов или лимфоцитов. В то время как полученные антитела могут быть собраны из сыворотки животного для получения поликлональных препаратов, обычно более желательно выделить отдельные лимфоциты из селезенки, лимфатических узлов или периферической крови, чтобы получить гомогенные препараты моноклональных антител. Как правило, лимфоциты получают из селезенки и иммортализуют для получения гибридом.

Например, как описано выше, процесс селекции может заключаться в селекции уникального клона из множества клонов, таких как пул гибридомных клонов, фаговых клонов и рекомбинантных ДНК-клонов. Следует понимать, что выбранная EFNA-связывающаяся последовательность может быть дополнительно изменена, например, с целью улучшения аффинности к мишени, гуманизации указанной мишень-связывающей последовательности, улучшения его продуцирования в клеточной культуре, снижения ее иммуногенности in vivo, создания полиспецифического антитела и т.д., и что антитело, содержащее измененную мишень-связывающую последовательность, также представляет собой моноклональное антитело по данному изобретению. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно включают отдельные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело препарата моноклонального антитела направлено против одной детерминанты на антигене. В дополнение к их специфичности, преимуществом препаратов моноклональных является то, что они, как правило, не загрязнены другими иммуноглобулинами, которые могут обладать перекрестной реакционной способностью.

г. Химерные антитела

В другом воплощении антитело по изобретению может содержать химерные антитела, полученные из ковалентно связанных сегментов белка из по меньшей мере двух разных видов или типов антител. Следует понимать, что при использовании здесь термин "химерные антитела" относится к конструкциям, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, происходящих из определенных видов или принадлежащих конкретному классу или подклассу антител, тогда как остальная часть цепи(ей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, происходящих из других видов или принадлежащих другому классу или подклассу антител, а также к фрагментам таких антител, при условии, что они проявляют нужную биологическую активность (патент США 4816567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). В одном типичном воплощении химерное антитело согласно данному изобретению может содержать мышиные аминокислотные последовательности VH и VL. и константные области, происходящие из человека. В других совместимых воплощениях химерное антитело по настоящему изобретению может содержать CDR-привитое или гуманизированное антитело, как описано ниже.

Как правило, целью создания химерного антитела является создание химеры, в которой количество аминокислот от предполагаемого вида является максимальным. Одним примером является CDR-привитое антитело, в котором антитело содержит одну или более областей, определяющих комплементарность (CDR), из конкретных видов или принадлежащих конкретному классу или подклассу антител, в то время как остальная часть цепи(ей) антител(а) является/являются идентичными или гомологичными соответствующей последовательности антител, происходящих из других видов или принадлежащих другому классу или подклассу антител. Для применения у людей, вариабельную область или выбранные CDR из антитела грызуна часто прививают в антитело человека, заменяя природные вариабельные области или области CDR человеческого антитела. Преимуществами этих конструкций, как правило, является обеспечения полной силы модулятора функций (например, CDC, ADCC и т.д.) при одновременном снижении нежелательных иммунных ответов на антитело у субъекта.

д. Гуманизированные антитела

Гуманизированное антитело аналогично CDR-привитому антителу. Как правило, гуманизированное антитело получают из моноклонального антитела, изначально образованного у животного, не являющегося человеком. При использовании здесь, гуманизированные формы нечеловеческих (например, мышиных) антител представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, происходящую из нечеловеческого иммуноглобулина. В одном воплощении гуманизированное антитело представляет собой человеческий иммуноглобулин (реципиентное или акцепторное антитело), в котором остатки из CDR реципиентного антитела замещены остатками из CDR нечеловеческих видов (донорное антитело), таких как мышь, крыса, кролик или примат, не являющийся человеком, имеющий нужную специфичность, аффинность и/или активность.

Как правило, гуманизация антитела включает анализ гомологии последовательностей и канонических структур как донорного, так и реципиентного антитела. В выбранных воплощениях реципиентное антитело может содержать консенсусные последовательности. Чтобы создать консенсусные человеческие каркасы, каркасы из нескольких аминокислотных последовательностей человеческой тяжелой цепи или легкой цепи можно выровнять, чтобы идентифицировать консенсусную аминокислотную последовательность. Более того, во многих случаях один или более каркасных остатков в вариабельном домене человеческого иммуноглобулина замещают соответствующими нечеловеческими остатками из донорного антитела. Эти каркасные замещения определяют методами, хорошо известными в данной области техники, например путем моделирования взаимодействий CDR и каркасных остатков для идентификации каркасных остатков, важных для связывания антигена, и сравнения последовательности для идентификации необычных каркасных остатков в конкретных положениях. Такие замещения помогают поддерживать подходящую трехмерную конфигурацию привитого(ых) CDR и часто улучшают бесконечность по сравнению с аналогичными конструкциями без замещений в каркасе. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не встречаются в реципиентном антителе или в донорном антителе. Эти модификации могут быть сделаны, чтобы дополнительно улучшить эффективность антител с использованием хорошо известных методов.

CDR-привитые и гуманизированные антитела описаны, например, в патентах США 6180370, 5693762, 5693761, 5585089 и 5530101. В общем случае, гуманизированное антитело содержит по существу все из по меньшей мере одного и обычно двух вариабельных доменов, где все или по существу все CDR, соответствуют CDR нечеловеческого иммуноглобулина, и все или по существу все каркасные участки являются каркасными участками последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело, возможно, также содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), обычно человеческого иммуноглобулина. Более подробно см., например, в Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op.Struct. Biol. 2:593-596 (1992). См. также, например, Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994); и патенты США 6982321 и 7087409. Еще один способ называется гуманиринг (humaneering) и описан, например, в патенте США 2005/0008625. В контексте настоящей заявки термин "гуманизированные антитела" включает CDR-привитые антитела (то есть человеческие антитела, содержащие один или более привитых нечеловеческих CDR) без или с минимальными замещениями в каркасе.

Дополнительно, нечеловеческое анти-EFNA антитело также может быть модифицировано посредством специфической делеции эпитопов человеческих Т-клеток или деиммунизации способами, раскрытыми в WO 98/52976 и WO 00/34317. В кратком изложении, вариабельные области тяжелой и легкой цепи антитела можно проанализировать в отношении пептидов, которые связываются с МНС (главный комплекс гистосовместимости) класса II; эти пептиды представляют собой потенциальные эпитопы Т-клеток (как определено в WO 98/52976 и WO 00/34317). Для обнаружения потенциальных эпитопов Т-клеток можно применить подход с использованием компьютерного моделирования, называемый «методом протягивания пептида", а также в базе данных пептидов, связывающих человеческий МНС класса II, можно искать мотивы, присутствующие в последовательностях VH и VL, как описано в WO 98/52976 и WO 00/34317. Эти мотивы связываются с любым из 18 основных DR-аллотипов МНС класса II и, таким образом, образуют потенциальные эпитопы Т-клеток. Обнаруженные потенциальные эпитопы Т-клеток могут быть удалены путем замещения небольших количеств аминокислотных остатков в вариабельных областях или посредством единичных аминокислотных замен. Если возможно, осуществляют консервативные замены. Часто, но не исключительно, можно использовать аминокислоты, свойственные для положения в последовательностях антитела зародышевой линии человека. После идентификации деиммунизирующих изменений можно сконструировать нуклеиновые кислоты, кодирующие VH и VL, посредством мутагенеза или других синтетических методов (например, синтеза de novo, замещения кассет и так далее). Мутагенизированные вариабельные последовательности возможно могут быть слиты с человеческой константной областью.

В выбранных воплощениях по меньшей мере 60%, 65%, 70%, 75% или 80% остатков вариабельной области гуманизированного антитела соответствуют остаткам родительских последовательностей каркасного участка (FR) и CDR. В других воплощениях по меньшей мере 85% или 90% остатков гуманизированного антитела соответствуют остаткам родительских последовательностей каркасного участка (FR) и CDR. В еще одном предпочтительном воплощении более чем 95% остатков гуманизированного антитела соответствуют остаткам родительских последовательностей каркасного участка (FR) и CDR.

Гуманизированные антитела могут быть изготовлены с использованием обычных методов молекулярной биологии и биомолекулярной инженерии, как описано здесь. Эти методы включают выделение, обработку и экспрессию нуклеиновокислотных последовательностей, которые кодируют все или часть вариабельных областей Fv иммуноглобулина по меньшей мере из одной тяжелой или легкой цепи. Источники таких нуклеиновых кислот хорошо известны специалистам в данной области и могут быть получены, например, из гибридомы, эукариотической клетки или фага, продуцирующих антитело или иммунореактивный фрагмент против определенной мишени, как описано выше, из генов иммуноглобулина зародышевой линии или из синтетических конструкций. Рекомбинантная ДНК, кодирующая гуманизированное антитело, затем может быть клонирована в подходящий экспрессирующий вектор.

Последовательности зародышевой линии человека, например, раскрыты в Tomlinson, I. A. et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798; Cook, G. P. et al. (1995) Immunol. Today 16: 237-242; Chothia, D. et al. (1992) J. Mol. Bio. 227:799-817; и Tomlinson et al. (1995) EMBO J 14:4628-4638. Каталог V BASE предоставляет собой полный каталог последовательностей вариабельной области человеческого иммуноглобулина (см. Retter et al., (2005) NucAcid Res 33: 671-674). Эти последовательности можно использовать в качестве источника человеческих последовательностей, например каркасных участков и CDR. Как указано здесь, также можно использовать консенсусные человеческие каркасные участки, например, как описано в патенте США 6300064.

е. Человеческие антитела

Специалистам в данной области понятно, что, в дополнение к вышеупомянутым антителам, антитела по настоящему изобретению могут включать полностью человеческие антитела. В контексте настоящей заявки термин "человеческое антитело" включает антитело, которое имеет аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности антитела, продуцируемого человеком, и/или было изготовлено с использованием любого из методов изготовления человеческих антител, как описано здесь. Данное определение человеческого антитела, в частности, исключает гуманизированное антитело, содержащее нечеловеческие антиген-связывающие остатки.

Человеческие антитела можно получить с использованием различных методов, известных в данной области. Как упоминалось выше, можно использовать методы фагового дисплея для обеспечения иммуноактивных связывающих областей в соответствии с настоящим изобретением. Таким образом, в некоторых воплощениях изобретения предложены способы получения анти-EFNA антител или их антиген-связывающих частей, включающие стадии синтеза библиотеки антител (предпочтительно человеческих) на фаге, скрининга этой библиотеки с помощью выбранного EFNA или его антитело-связывающего участка, выделения фага, связывающего EFNA, и получения иммунореактивных фрагментов из фага. В качестве примера один способ получения библиотеки антител для применения в методах фагового дисплея включает стадии иммунизации животных, не являющихся человеком, содержащих локус человеческого или нечеловеческого иммуноглобулина, выбранным EFNA или его антигенным участком для получения иммунного ответа, выделение антитело-продуцирующих клеток из иммунизированного животного; выделение РНК, кодирующей тяжелые и легкие цепи антитела по изобретению из выделенных клеток, обратное транскрибирование РНК с получением кДНК, амплификация кДНК с использованием праймеров, и вставка кДНК в вектор для фагового дисплея таким образом, чтобы антитела экспрессировались на фаге. Более конкретно, ДНК, кодирующую домены VH и VL рекомбинируют с линкером scFv посредством PCR и клонируют в фагмидный вектор (например, pCANTAB 6 или pComb 3 HSS). Затем этот вектор может быть подвергнут электропорации в Е. coli, после чего Е. coli инфицируют хелперным фагом. Используемый в данных способах фаг, как правило, представляет собой нитчатый фаг, включающий fd и М13, а домены VH и VL обычно рекомбинантно слиты либо с фаговым геном III, либо с геном VIII.

Рекомбинантные человеческие анти-антитела EFNA по изобретению могут быть выделены посредством скрининга библиотеки рекомбинантных комбинаторных антител, полученной как описано выше. В предпочтительном воплощении библиотека представляет собой библиотеку scFv-фагового дисплея, полученную с использованием человеческих VL и VH кДНК, полученных из мРНК, выделенных из В-клеток. Методы получения и скрининга таких библиотек хорошо известны в данной области и наборы для создания библиотек фагового дисплея имеются в продаже (например, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, номер по каталогу 27-9400-01; и Stratagene SurfZAP™ phage display kit, номер по каталогу 240612). Имеются также другие методы и реагенты, которые можно использовать в создании и скрининге библиотек дисплея антител (см., например, патент США 5223409; публикации РСТ WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; Fuchs et al., Bio/Technology 9:1370-1372 (1991); Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85 (1992); Низе et al., Science 246:1275-1281 (1989); McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734 (1993); Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992); Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991); Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580 (1992); Garrad et al., Bio/Technology 9:1373-1377 (1991); Hoogenboom et al., Nuc. Acid Res. 19:4133-4137 (1991); и Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982 (1991).

Антитела, продуцируемые интактными библиотеками (природными или синтетическими), могут обладать умеренной аффинностью (Ka примерно от 106 до 107 М-1), но созревание аффинности также можно имитировать in vitro путем конструирования и повторной селекции из вторичных библиотек, как описано в данной области техники. Например, мутация может быть введена случайным образом in vitro посредством применения допускающей ошибки полимеразы (сообщается в Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989)) в способе Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226; 889-896 (1992) или в способе Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3576-3580 (1992). Дополнительно, созревание аффинности может быть выполнено посредством случайных мутаций одного или более CDR, например используя PCR с праймерами, имеющими произвольные последовательности, охватывающие представляющий интерес CDR, в выбранных отдельных Fv клонах, и скрининга клонов с высокой аффинностью. В WO 9607754 описан способ индукции мутагенеза в области, определяющей комплементарность, легкой цепи иммуноглобулина для создания библиотеки генов легкой цепи. Другой эффективный подход состоит в рекомбинации доменов VH или VL, выбранных посредством фагового дисплея с репертуарами природных вариантов домена V, полученных из неиммунизированных доноров, и скрининге на более высокую аффинность в нескольких раундах реорганизации цепи, как описано в Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992). Этот метод позволяет получать антитела и фрагменты антител с константой диссоциации Kd (koff/kon) примерно 10-9 М или менее.

Кроме того, следует понимать, что можно использовать аналогичные методики с применением библиотек, содержащих эукариотические клетки (например, дрожжи), которые экспрессируют связывающие пары на своей поверхности. Как и в методе фагового дисплея, эукариотические библиотеки подвергают скринингу в отношении интересующего антигена (то есть EFNA) и выделяют и клонируют клетки, экспрессирующие кандидат-связывающие пары. Могут быть выполнены стадии оптимизации содержания библиотеки и созревания аффинности реактивных связывающих пар. См., например, патент США 7700302 и заявку 12/404059. В одном воплощении человеческое антитело выбирают из фаговой библиотеки, где фаговая библиотека экспрессирует человеческие антитела (Vaughan et al. Nature Biotechnology 14:309-314 (1996): Sheets et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 95:6157-6162 (1998)); Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581 (1991)). В других воплощениях человеческие связывающие пары могут быть выделены из библиотек комбинаторных антител, образованных в эукариотических клетках, таких как дрожжи. См. например, патент США 7700302. Такие методы, предпочтительно, позволяют осуществить скрининг большого числа кандидатов-модуляторов и обеспечивают относительно легкую обработку последовательностей кандидатов (например, посредством созревания аффинности или рекомбинантных перегруппировок).

Человеческие антитела также могут быть получены путем введения локуса человеческого иммуноглобулина трансгенным животным, например мышам, у которых эндогенные гены иммуноглобулина частично или полностью инактивированы. При введении наблюдается продуцирование человеческого антитела, которое во всех отношениях очень близко напоминает наблюдаемое у людей, в том числе перегруппировку и сборку генов, и репертуар антител. Такой подход описан, например, в патентах США 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5661016, а также 6075181 и 6150584, рассматривающих Xenomouse® технологию, наряду со следующими научными публикациями: Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995). Альтернативно, человеческое антитело может быть получено посредством иммунизации человеческих В-лимфоцитов, продуцирующих антитела, направленные против целевого антигена (такие В-лимфоциты могут быть извлечены из субъекта, страдающего опухолевым заболеванием или могут быть иммунизированы in vitro). См., например, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985); Boerner et al., J. Immunol, 147 (I):86-95 (1991); и патент США 5750373.

VI. Характеристики антител

Независимо от того, как он получены, и какую из вышеупомянутых форм принимает антительный модулятор (например, гуманизированный, человеческий и т.д.), предпочтительные воплощения раскрытых модуляторов могут обладать различными характеристиками. В связи с этим, анти-EFNA антитело-продуцирующие клетки (например, гибридомы или дрожжевые колонии) могут быть отобраны, клонированы и дополнительно подвергнуты скринингу в отношении нужных характеристик, включая, например, устойчивый рост, высокий уровень продуцирования антител и, как описано более подробно ниже, желательные свойства антител. Гибридомы могут быть размножены in vivo в сингенных животных, в животных, лишенных иммунной системы, например бестимусных мышах или в культуре клеток in vitro. Методы селекции, клонирования и размножения гибридом и/или колоний, каждая из которых продуцирует отдельный вид антител, хорошо известны специалистам в данной области техники.

а. Нейтрализующие антитела

В особенно предпочтительных воплощениях модуляторы по настоящему изобретению включают нейтрализующие антитела или их производные или фрагменты. Термин "нейтрализующее антитело" или "нейтрализующий антагонист" относится к антителу или антагонисту, который связывается или взаимодействует с лигандом эфрином А и препятствует связыванию или ассоциации этого лиганда с его партнером по связыванию (например, рецептором ЕРНА), прерывая таким образом биологический ответ, который в противном случае будет иметь место при взаимодействии молекул. При оценке связывания и специфичности антитела или иммунологически функционального фрагмента или его производного, антитело или фрагмент будет по существу ингибировать связывание лиганда с его связывающим партнером или субстратом, когда избыток антитела снижает количество связывающего партнера, соединенного с целевой молекулой, по меньшей мере примерно на 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% или более при измерении, например, в in vitro конкурентном связывающем анализе (см., например, Примеры 9-12 в данной заявке). В случае антител к EFNA4, например, нейтрализующее антитело или антагонист предпочтительно ослабляет способность EFNA4 связываться с ЕрПА4 по меньшей мере примерно на 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% или более. Следует иметь в виду, что эту уменьшенную активность можно измерить непосредственно с помощью известных в данной области техники методов или можно измерить по влиянию, которое такое уменьшение оказывает на активность рецептора ЕРН (например, ЕРНА4),

б. Интернализованные антитела

Хотя данные показывают, что выбранные лиганды эфрины А или их изоформы могут присутствовать в растворимой форме, по меньшей мере некоторые EFNA (например, EFNA1 и EFNA4) вероятно остаются в ассоциации с клеточной поверхностью, тем самым обеспечивая возможность интернализации раскрытых модуляторов. Соответственно, анти-EFNA антитела по настоящему изобретению могут быть интернализованы, по меньшей мере до некоторой степени, клетками, которые экспрессируют лиганд эфрин А. Например, анти-EFNA4 антитело, которое связывается с EFNA4 на поверхности опухоль-инициирующей клетки, может быть интернализовано опухоль-инициирующей клеткой. В особенно предпочтительных воплощениях такие анти-EFNA антитела могут быть соединены или конъюгированы с противораковыми агентами, такими как цитотоксические группировки, которые убивают клетки при интернализации.

При использовании здесь, интернализованное анти-EFNA антитело представляет собой антитело, захваченное клеткой при связывании с EFNA, соединенным с клеткой млекопитающего. Интернализованное антитело включает фрагменты антитела, человеческое или гуманизированное антитело и конъюгаты антител. Интернализация может происходить in vitro или in vivo. Для терапевтического применения интернализация может происходить in vivo. Количество интернализованных молекул антител может быть достаточным или эффективным для гибели EFNA-экспрессирующей клетки, особенно EFNA-экспрессирующей опухоль-инициирующей клетки. В зависимости от активности антитела или конъюгата антитела, в некоторых случаях захват одной молекулы антитела клеткой является достаточным для гибели целевой клетки, с которой связывается антитело. Например, некоторые токсины являются высокоактивными в умерщвлении, так что интернализация одной молекулы токсина, конъюгированной с антителом, является достаточной для гибели опухолевой клетки. Интернализируется ли анти-EFNA антитело при связывании EFNA с клеткой млекопитающего, можно определить с помощью различных анализов, в том числе описанных в Примерах ниже (например, Примеры 15 и 16). Методы обнаружения интернализации антитела клеткой также описаны в патенте США 7619068, который включен в данную заявку посредством ссылки во всей своей полноте.

в. Истощающие антитела

В других предпочтительных воплощениях модуляторы по настоящему изобретению включают истощающие антитела или их производные или фрагменты. Термин "истощенное антитело" относится к антителу или фрагменту, который связывается или находится в ассоциации с EFNA на или около поверхности клетки и индуцирует, стимулирует или вызывает смерть или ликвидацию клетки (например, посредством комплемент-зависимой цитотоксичности или антитело-зависимой клеточной цитотоксичности). В некоторых воплощениях, обсуждаемых более подробно ниже, выбранные истощающие антитела соединены или конъюгированы с цитотоксическим агентом. Предпочтительно, истощающее антитело способно удалить, ликвидировать или убить по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% или 99% клеток, поддерживающих опухоль, в определенной клеточной популяции. В некоторых воплощениях клеточная популяция может содержать обогащенные, разделенные, очищенные или выделенные клетки, поддерживающие опухоль. В других воплощениях клеточная популяция может содержать образцы целой опухоли или экстракты гетерогенной опухоли, которые содержат клетки, поддерживающие опухоль. Специалистам в данной области понятно, что стандартные биохимические методы, как описано в Примерах ниже (например, в Примере 16) можно использовать для мониторинга и количественной оценки истощения онкогенных клеток или клеток, поддерживающих опухоль, согласно данному руководству.

г. Связывание с эпитопом

Кроме того, следует иметь в виду, что раскрытые анти-EFNA антитела будут вступать в ассоциацию или связываться с отдельными эпитопами или детерминантами, представленными выбранной(ыми) мишенью(ями). При использовании здесь, термин "эпитоп" относится к той части антигена-мишени, который может распознаваться и специфически связываться конкретным антителом. Когда антиген представляет собой полипептид, такой как EFNA, эпитопы могут быть сформированы как соседними аминокислотами, так и не соседними аминокислотами, которые стали соседними посредством третичного складывания белка. Эпитопы, образованные соседними аминокислотами, как правило, сохраняются при денатурации белка, в то время как эпитопы, образованные в результате третичного складывания, обычно теряются при денатурации белка. Эпитоп, как правило, включает по меньшей мере 3, а еще чаще по меньшей мере 5 или 8-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Более конкретно, специалисту понятно, что термин "эпитоп" включает любую белковую детерминанту, способную к специфическому связыванию с иммуноглобулином или Т-клеточным рецептором, или к иному взаимодействию с молекулой. Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты или углеводы или боковые цепи сахаров, и обычно имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические зарядные характеристики. Кроме того, эпитоп может быть линейным или конформационным. В линейном эпитопе все точки взаимодействия между белком и взаимодействующей молекулой (например, антителом) расположены линейно вдоль первичной аминокислотной последовательности белка. В конформационном эпитопе точки взаимодействие расположены на аминокислотных остатках в белке, которые линейно отделены друг от друга.

Если нужный эпитоп на антигене определен, можно создать антитела к этому эпитопу, например путем иммунизации пептидом, содержащим этот эпитоп, с использованием методов, описанных в настоящем изобретении. Альтернативно, в процессе поиска, создание и характеристика антител можно дать информацию о нужных эпитопах. На основании этой информации затем можно конкурентно отбирать антитела на связывание с этим же эпитопом. Подход к достижению этого заключается в проведении конкурентных исследований для обнаружения антител, которые конкурентно связываются друг с другом, то есть антител, конкурирующих за связывание с антигеном. Высокопроизводительный процесс сортировки антител, основанный на их перекрестной конкуренции, описан в WO 03/48731.

При использовании здесь термин "сортировка" относится к способу группировки антител на основании их антиген-связывающих характеристик. Оценка групп является в некоторой степени произвольной, зависящей от того, насколько различаются наблюдаемые связывающие партнеры тестируемых антител. Таким образом, в то время как данный метод является полезным инструментом классификации антител по настоящему изобретению, группы не всегда прямо коррелируют с эпитопами и такие первоначальные результаты определения следует дополнительно подтвердить другими известными в данной области методами.

С такой оговоркой можно определить, связывается ли выбранное первичное антитело (или его фрагмент) с тем же эпитопом или перекрестно конкурирует за связывание со вторым антителом, посредством использования методов, известных в данной области и изложенных здесь в Примерах. В одном воплощении первичному антителу по изобретению позволяют связываться с EFNA в насыщающих условиях и затем измеряют способность вторичных антител связываться с EFNA. Если тестируемое антитело способно связываться с EFNA одновременно с первичным анти-EFNA антителом, тогда вторичное антитело связывается с другим эпитопом, чем первичное антитело. Однако если вторичное антитело не способно связываться одновременно с EFNA, тогда вторичное антитело связывается с тем же самым эпитопом, перекрывающимся эпитопом или эпитопом, находящимся в непосредственной близости к эпитопу, связанному первичным антителом. Как известно в данной области техники и подробно описано в Примерах ниже, необходимые данные могут быть получены с использованием твердофазного прямого или косвенного радиоиммунологического анализа (RIA), твердофазного прямого или непрямого иммуноферментного анализа (EIA), конкурентного сэндвич-анализа, системы Biacore™ (то есть поверхностного плазменного резонанса - GE Healthcare), анализатора ForteBio® (то есть двухполосной интерферометрии - ForteBio, Inc.) или метода проточной цитометрии. Термин "поверхностный плазменный резонанс", при использовании здесь, относится к оптическому явлению, которое позволяет проводить анализ биоспецифических взаимодействий в режиме реального времени путем обнаружения изменений концентраций белка на биосенсоре матрицы. В особенно предпочтительном воплощении анализ выполняют с использованием аппаратов Biacore или ForteBio, как показано в Примерах ниже.

Термин "конкурировать" при использовании в контексте антител, которые конкурируют за тот же самый эпитоп, означает, что конкуренция между антителами определена посредством анализа, в котором тестируемое антитело или иммунологически функциональный фрагмент предупреждает или ингибирует специфическое связывание контрольного антитела с общим антигеном. Как правило, такой анализ включает использование очищенного антигена, связанного с твердой поверхностью, или клеток, несущих либо немеченый тестируемый иммуноглобулин, либо меченый контрольный иммуноглобулин. Конкурентное ингибирование измеряют путем определения количества метки, связанной с твердой поверхностью или клетками в присутствии тестируемого иммуноглобулина. Обычно тестируемый иммуноглобулин присутствует в избытке. Антитела, идентифицированные посредством конкурентного анализа (конкурирующие антитела), включают антитела, связывающиеся с тем же эпитопом, что и контрольное антитело, и антитела, связывающиеся с соседним эпитопом, расположенным достаточно близко к эпитопу, связанному с контрольным антителом, для того, чтобы имело место пространственное затруднение. Дополнительные подробности методов определения конкурентного связывания приведены здесь в Примерах. Обычно, когда конкурирующее антитело присутствует в избытке, оно ингибирует специфическое связывание контрольного антитела с общим антигеном по меньшей мере на 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% или 75%. В некоторых случаях связывание ингибируется по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95% или 97% или более.

Кроме эпитопной специфичности раскрытые антитела могут быть охарактеризованы с использованием ряда разных физических характеристик, включающих, например, аффинности связывания, температуру плавления (Tm) и изоэлектрические точки.

д. Аффинность связывания

В связи с этим настоящее изобретение, кроме того, охватывает применение антител, которые имеют высокую аффинность связывания с выбранным EFNA, или, в случае пан-антител, более чем с одним типом лиганда эфрина А. Считается, что антитело по изобретению специфически связывается со своим целевым антигеном, когда константа диссоциации Kd (koff/kon) составляет ≤10-8 М. Антитело специфически связывается с антигеном с высокой аффинностью, когда Kd≤5×10-9 М, и с очень высокой аффинностью, когда Kd≤5×10-10 M. В одном воплощении изобретения антитело имеет Kd≤10-9 M и скорость диссоциации составляет примерно 1×10-4/сек. В одном воплощении изобретения скорость диссоциации составляет <1×10-5/сек. В других воплощениях изобретения антитела связываются с EFNA с Kd от примерно 10-8 М до 10-10 М, и в еще одном воплощении они связываются с Kd≤2×10-10 М. Другие выбранные воплощения настоящего изобретения включают антитела, которые имеют константу диссоциации или Kd (koff/kon) менее 10-2 М, менее 5×10-2 М, менее 10-3 М, менее 5×10-3 М, менее 10-4 М, менее 5×10-4 М, менее 10-5 М, менее 5×10-5 М, менее 10-6 М, менее 5×10-6 М, менее 10-7 М, менее 5×10-7 М, менее 10-8 М, менее 5×10-8 М, менее 10-9 М, менее 5×10-9 М, менее 10-10 М, менее 5×10-10 М, менее 10-11 М, менее 5×10-11 М, менее 10-12 М, менее 5×10-12M, менее 10-13 M, менее 5×10-13 M, менее 10-14 M, менее 5×10-14 M, менее 10-15 M или менее 5×10-15 M.

В конкретных воплощениях антитело по изобретению, которое иммуноспецифически связывается с EFNA, имеет константу скорости ассоциации или скорость kon (EFNA (Ab)+антиген (Ag)kon≥Ab-Ag), равную по меньшей мере 105 M-1c-1, по меньшей мере 2×105 M-1c-1, по меньшей мере 5×105 М-1с-1, по меньшей мере 106 M-1c-1, по меньшей мере 5×106 M-1c-1, по меньшей мере 107 M-1c-1, по меньшей мере 5×107 M-1c-1 или по меньшей мере 108 M-1c-1.

В другом воплощении антитело по изобретению, которое иммуноспецифически связывается с EFNA, имеет скорость koff (EFNA (Ab)+антиген (Ag)koff←Ab-Ag) менее 10-1 c-1, менее 5×10-1 c-1, менее 10-2 c-1, менее 5×10-2 с-1, менее 10-3 c-1, менее 5×10-3 s-1, менее 10-4 с-1, менее 5×10-4 с-1, менее 10-5 с-1, менее 5×10-5 с-1, менее 10-6 с-1, менее 5×10-6 с-1, менее 10-7 c-1, менее 5×10-7 c-1, менее 10-8 c-1, менее 5×10-8 с-1, менее 10-9 c-1, менее 5×10-9 c-1 или менее 10-10 c-1.

В других выбранных воплощениях настоящего изобретения анти-EFNA антитела имеют константу аффинности или Ka (kon/koff), равную по меньшей мере 102 М-1, по меньшей мере 5×102 М-1, по меньшей мере 103 М-1, по меньшей мере 5×103 М-1, по меньшей мере 10-4 M-1, по меньшей мере 5×104 М-1, по меньшей мере 105 M-1, по меньшей мере 5×105 М-1, по меньшей мере 106 M-1, по меньшей мере 5×106 М-1, по меньшей мере 107 М-1, по меньшей мере 5×107 М-1, по меньшей мере 108 М-1, по меньшей мере 5×108 М-1, по меньшей мере 109 М-1, по меньшей мере 5×109 М-1, по меньшей мере 1010 М-1, по меньшей мере 5×1010 М-1, по меньшей мере 1011 М-1, по меньшей мере 5×1011 М-1, по меньшей мере 1012 М-1, по меньшей мере 5×1012 М-1, по меньшей мере 1013 М-1, по меньшей мере 5×1013 М-1, по меньшей мере 1014 М-1, по меньшей мере 5×1014 М-1, по меньшей мере 10-15 М-1 или по меньшей мере 5×1015 М-1.

е. Изоэлектрические точки

В дополнение к вышеупомянутым связывающим свойствам, анти-EFNA антитела и их фрагменты, подобно всем полипептидам, имеют изоэлектрическую точку (pI), которую обычно определяют как рН, при котором полипептид не несет суммарного заряда. В данной области техники известно, что растворимость белка обычно является самой низкой при рН раствора, равном изоэлектрической точке (pI) этого белка. Таким образом, можно оптимизировать растворимость путем изменения количества и локализации ионизируемых остатков в антителе для корректировки pI. Например, на рI полипептида можно влиять посредством осуществления подходящих аминокислотных замен (например, путем замены заряженной аминокислоты, такой как лизин, на незаряженный остаток, такой как аланин). Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, аминокислотные замены в антителе, которые приводят к изменению pI указанного антитела, могут улучшить растворимость и/или стабильность этого антитела. Специалисту в данной области понятно, какие аминокислотные замещения будут наиболее подходящими для конкретного антитела для достижения нужной pI.

pI белка может быть определена различными способами, включая, но не ограничиваясь ими, изоэлектрическую фокусировку и различные компьютерные алгоритмы (см., например Bjellqvist et al., 1993, Electrophoresis 14:1023). В одном воплощении pI анти-EFNA антител по изобретению находится между или является выше чем примерно 6,5, примерно 7,0, примерно 7,5, примерно 8,0, примерно 8,5 или примерно 9,0. В другом воплощении pI анти-EFNA антител по изобретению находится между или является выше, чем 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5 или 9,0. В еще одном воплощении, замены, приводящие к изменениям pI антител по изобретению, не уменьшают значительно их аффинность связывания с EFNA. Как описано более подробно ниже, конкретно предусмотрено, что замещение(я) Fc-области, которое приводит к изменению связывания с FcγR, также может привести к изменению pI. В предпочтительном воплощении замещение(я) Fc-области специально выбрано(з) так, чтобы влиять и на желательное изменение FcγR-связывания, и на желательное изменение pI. При использовании здесь, значение pI определяют как pI преобладающей заряженной формы.

ж. Термическая стабильность

Также следует понимать, что Tm домена Fab антитела может служить хорошим индикатором термической стабильности антитела и может дополнительно служить показателем срока годности. Tm представляет собой температуру 50%-ного разворачивания для данного домена или последовательности. Низкая Tm указывает на большее агрегирование/меньшую стабильность, в то время как высокая Tm указывает на меньшее агрегирование/большую стабильность. Таким образом, антитела или фрагменты или производные, имеющие высокую Tm, являются предпочтительными. Кроме того, используя признанные в данной области методы, можно изменить композицию анти-EFNA антител или их доменов так, чтобы увеличить или оптимизировать молекулярную стабильность. См., например, патент США 7960142. Таким образом, в одном воплощении, домен Fab выбранного антитела имеет значение Tm выше, чем по меньшей мере 50°С, 55°С, 60°С, 65°С, 70°С, 75°С, 80°С, 85°С, 90°С, 95°С, 100°С, 105°С, 110°С, 115°С или 120°С. В другом воплощении, домен Fab антитела имеет значение Tm выше, чем по меньшей мере примерно 50°С, примерно 55°С, примерно 60°С, примерно 65°С, примерно 70°С, примерно 75°С, примерно 80°С, примерно 85°С, примерно 90°С, примерно 95°С, примерно 100°С, примерно 105°С, примерно 110°С, примерно 115°С или примерно 120°С. Температуры термического плавления (Tm) белкового домена (например, домена Fab) могут быть измерены с использованием любого стандартного метода, известного в данной области техники, например посредством дифференциальной сканирующей калориметрии (см., например, Vermeer et al., 2000, Biophys. J. 78:394-404; Vermeer et al., 2000, Biophys. J. 79: 2150-2154, обе включены в данное описание изобретения посредством ссылки).

VII. Фрагменты и производные модулятора EFNA

Независимо от того включают ли агенты по настоящему изобретению интактные слитые конструкции, антитела, фрагменты или производные, выбранные модуляторы будут вступать в реакцию, связываться, объединяться, образовывать комплекс, присоединяться, прикрепляться, смыкаться, взаимодействовать или иным образом вступать в ассоциацию с EFNA и тем самым обеспечивать нужные противоопухолевые эффекты. Специалистам в данной области понятно, что модуляторы, содержащие анти-EFNA антитела, взаимодействуют или вступают в ассоциацию с EFNA посредством одного или более связывающих сайтов, экспрессируемых на антителе. Более конкретно, при использовании здесь, термин "связывающий сайт" включает участок полипептида, которая отвечает за селективное связывание с целевой молекулой, представляющей интерес (например, ферментом, антигеном, лигандом, рецептором, субстратом или ингибитором). Связывающие домены содержат по меньшей мере один связывающий сайт (например, интактное антитело IgG имеет два связывающих домена и два связывающих сайта). Типичные связывающие домены включают вариабельный домен антитела, рецептор-связывающий домен лиганда, лиганд-связывающий домен рецептора или ферментативный домен. В контексте настоящего изобретения типичный активный участок EFNA (например, часть слитой конструкции Fc-EFNA) может содержать сайт связывания субстрата (например, Eph-рецептор).

а. Фрагменты

Независимо от того, какая форма модулятора (например, химерная, гуманизированная и т.д.) выбрана для осуществления изобретения на практике, следует понимать, что его иммунореактивные фрагменты можно использовать в соответствии с данным руководством. В самом широком смысле термин "фрагмент антитела" включает по меньшей мере часть интактного антитела (например, природного иммуноглобулина). Более конкретно, термин "фрагмент" относится к части или участку антитела или цепи антитела (или молекулы EFNA в случае слитых Fc), содержащим меньшее количество аминокислотных остатков, чем интактное или полное антитело или цепь антитела. Термин "антиген-связывающий фрагмент" относится к полипептидному фрагменту иммуноглобулина или антитела, который связывается с антигеном или конкурирует с интактным антителом (то есть с интактным антителом, из которого они были получены) за связывание с антигеном (то есть специфическое связывание). При использовании здесь термин "фрагмент молекулы антитела" включает антиген-связывающие фрагменты антитела, например легкую цепь антитела (VL), тяжелую цепь антитела (VH), одноцепочечное антитело (scFv), фрагмент F(ab′)2, фрагмент Fab, фрагмент Fd, фрагмент Fv, фрагменты однодоменного антитела, диатела, линейные антитела, молекулы одноцепочечного антитела и полиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. Кроме того, активный фрагмент EFNA содержит часть молекулы EFNA, которая сохраняет свою способность взаимодействовать с субстратами или рецепторами EFNA и модифицировать их таким же образом, что и интактный EFNA (хотя возможно с меньшей эффективностью).

Специалистам в данной области понятно, что фрагменты можно получить посредством химической или ферментативной обработки интактного или полного модулятора (например, антитела или цепи антитела) или рекомбинантными способами. В связи с этим, в то время как различные фрагменты антител определены в терминах расщепления интактного антитела, специалисту понятно, что такие фрагменты можно синтезировать de novo либо химически, либо используя методы рекомбинантной ДНК. Таким образом, при использовании здесь, термин "антитело" явным образом включает антитела или их фрагменты или производные, получаемые посредством модификации целых антител или синтезируемые de novo с использованием методов рекомбинантных ДНК.

Более конкретно, в результате расщепления антител папаином получаются два идентичных антиген-связывающих фрагмента, называемых Fab-фрагменты, каждый из которых имеет один антиген-связывающий сайт, и остаточный фрагмент Fc, название которого отражает его способность легко кристаллизоваться. В результате обработки пепсином получают фрагмент F(ab′)2, который имеет два антиген-связывающих сайта и все еще способен к перекрестному связыванию антигена. Fab-фрагмент также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (Сн1) тяжелой цепи. Fab′-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов добавлением нескольких остатков на карбоксильном конце CH1-домена тяжелой цепи, включая один или более цистеина из шарнирной области антитела. Fab′-SH является здесь обозначением Fab′, в котором цистеиновый(е) остаток(ки) константных доменов несет(ут) по меньшей мере одну свободную тиольную группу. Фрагменты F(ab′)2-антитела первоначально были получены, как пара фрагментов Fab′ с шарнирными цистеинами между ними. Известны также другие химические сочетания фрагментов антител. Более подробное описание других фрагментов антител см., например, в Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1999).

Также следует понимать, что фрагмент Fv представляет собой фрагмент антитела, который содержит полный сайт узнавания и связывания антигена. Эта область состоит из димера вариабельного домена одной тяжелой и одной легкой цепи в близкой ассоциации, которая может быть ковалентной по природе, например в scFv. Именно в этой конфигурации три CDR каждого вариабельного домена взаимодействуют с образованием антиген-связывающего сайта на поверхности димера VH-VL. Вместе шесть CDR или их подмножество придают антителу антиген-связывающую специфичность. Однако даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три CDR, специфичных к антигену) обладает способностью узнавать и связывать антиген, хотя обычно с более низкой аффинностью, чем полный связывающий сайт.

В других воплощениях фрагмент антитела, например, содержащий Fc-участок, сохраняет по меньшей мере одну из биологических функций, обычно ассоциированных с Fc-участком в случае присутствия в интактном антителе, такую как связывание FcRn, модуляция времени полужизни антитела, функция ADCC (антителозависимая клеточная цитотоксичность) и связывание комплемента. В одном воплощении фрагмент антитела является моновалентным антителом, которое имеет время полужизни in vivo по существу аналогичное интактному антителу. Например, такой фрагмент антитела может содержать антиген-связывающее плечо, соединенное с последовательностью Fc, способной придать фрагменту стабильность in vivo.

б. Производные

В другом воплощении также понятно, что модуляторы по изобретению могут быть моновалентными или поливалентными (например, бивалентными, тривалентными и т.д.). При использовании здесь, термин "валентность" относится к числу возможных сайтов связывания мишени (то есть EFNA), ассоциированных с антителом. Каждый сайт связывания мишени специфически связывает одну целевую молекулу или конкретное положение или локус на целевой молекуле. Когда антитело по настоящему изобретению содержит более одного сайта связывания мишени (поливалентное антитело), каждый сайт связывания мишени может специфически связывать одинаковые или разные молекулы (например, может связываться с разными лигандами, или разными антигенами, или разными эпитопами или положениями на одном и том же антигене). В контексте настоящего изобретения рассматриваемые антитела предпочтительно имеют по меньшей мере один сайт связывания, специфичный к человеческому EFNA. В одном воплощении антитела по настоящему изобретению являются моновалентными, так что каждый связывающий сайт молекулы специфически связывается с одним положением или эпитопом EFNA. В других воплощениях антитела являются поливалентными, так что они содержат больше одного связывающего сайта, и разные связывающие сайты специфически ассоциируют более чем с одним положением или эпитопом. В таких случаях множественные эпитопы могут присутствовать на выбранном EFNA-полипептиде или spice варианте, или один эпитоп может присутствовать на EFNA в то время как второй, другой эпитоп может присутствовать на другой молекуле или поверхности. См., например, патент США 2009/0130105.

Как упоминалось выше, поливалентные антитела могут иммуноспецифически связываться с разными эпитопами нужной целевой молекулы или могут иммуноспецифически связываться как с целевой молекулой, так и гетерологичным эпитопом, таким как гетерологичный полипептид или твердый материал носителя. Хотя предпочтительные воплощения анти-EFNA антител связывают только два антигена (то есть биспецифические антитела), антитела с дополнительными специфичностями, такие как триспецифические антитела, также охватываются настоящим изобретением. Примеры биспецифических антител включают, без ограничения ими, антитела с одним плечом, направленным против EFNA, и другим плечом, направленным против любого другого антигена (например, модуляторного клеточного маркера). Методы получения биспецифических антител известны в данной области. Традиционное получение полноразмерных биспецифических антител основано на со-экспрессии двух пар тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулина, где две цепи обладают разной специфичностью (Millstein et al., 1983, Nature, 305:537-539). Другие, более сложные, совместимые, полиспецифические конструкции и способы их получения описаны в патенте США 2009/0155255.

В других воплощениях вариабельные домены антитела с нужными специфичностями связывания (сайты объединения антитело-антиген) слиты с последовательностями константного домена иммуноглобулина. Слияние предпочтительно осуществляют с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащим по меньшей мере часть шарнирной области, CH2- и/или CH3-области. В одном примере первая константная область тяжелой цепи (CH1), содержащая сайт, необходимый для связывания с легкой цепью, присутствует по меньшей мере в одном из слияний. ДНК, кодирующие слияния тяжелой цепи иммуноглобулина и, если необходимо, легкой цепи иммуноглобулина, встроены в отдельные экспрессирующие векторы и котрансфецированы в подходящий организм-хозяин. Это обеспечивает большую гибкость в корректировке взаимных соотношений трех полипептидных фрагментов в воплощениях, где неравные соотношения трех полипептидных цепей, используемых в конструкции, обеспечивают оптимальные результаты. Однако можно встраивать кодирующие последовательности для двух или всех трех полипептидных цепей в один экспрессирующий вектор, когда экспрессия по меньшей мере двух полипептидных цепей в равных соотношениях приводит к высоким выходам или когда соотношения не имеют особого значения.

В одном воплощении такого подхода биспецифические антитела состоят из гибридной тяжелой цепи иммуноглобулина с первой специфичностью связывания в одном плече (например, EFNA4) и гибридной пары тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулина (представляющей вторую специфичность связывания) в другом плече. Было обнаружено, что ассиметричная структура облегчает отделение нужного биспецифического соединения от нежелательных комбинаций цепей иммуноглобулина, так как присутствие легкой цепи иммуноглобулина только в одной половине биспецифической молекулы обеспечивает легкий способ отделения. Такой подход раскрыт в WO 94/04690. Дополнительные подробности получения биспецифических антител см., например, в Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology, 121:210. Согласно другому подходу, описанному в WO 96/27011, можно сконструировать пару молекул антител для максимизации процента гетеродимеров, выделяемых из рекомбинантной клеточной культуры. Предпочтительная поверхность раздела включает по меньшей мере часть домена CH3 константного домена антитела. В данном способе одну или более небольших боковых цепей аминокислот с поверхности раздела первой молекулы антитела заменяют более крупными боковыми цепями (например, тирозином или триптофаном). Компенсационные полости размера, идентичного или аналогичного большой(им) боковой(ым) цепи(ям) создаются на поверхности раздела второй молекулы антитела путем замены больших аминокислотных боковых цепей меньшими (например, аланин или треонин). Это обеспечивает механизм увеличения выхода гетеродимера по сравнению с другими нежелательными конечными продуктами, такими как гомодимеры.

Биспецифические антитела также включают сшитые или гетероконъюгированные антитела. Например, одно из антител в гетероконъюгате может быть связано с авидином, а другое с биотином. Такие антитела, например, предложены для нацеливания клеток иммунной системы на нежелательные клетки (патент США 4676980) и для лечения ВИЧ-инфекции (WO 91/00360, WO 92/200373 и ЕР 03089). Гетероконъюгированные антитела могут быть получены с использованием любого удобного метода сшивания. Пригодные сшивающие агенты хорошо известны в данной области и раскрыты в патент США 4676980, наряду с рядом сшивающих методик.

VIII. Модуляторы EFNA - Модификации константной области

а. Fc-область и Fc-рецепторы

В дополнение к различным модификациям, заменам, вставкам или делециям в вариабельной или связывающей области раскрытых модуляторов (например, Fc-EFNA или анти-EFNA антител), представленных выше, специалистам в данной области понятно, что выбранные воплощения настоящего изобретения также могут содержать замещения или модификации константной области (то есть Fc-области). В частности, предполагается, что модуляторы EFNA по изобретению могут содержать, помимо прочего, одну или более дополнительных замен, мутаций и/или модификаций аминокислотных остатков, что приводит к соединению с предпочтительными характеристиками, включая, без ограничения ими: измененную фармакокинетику, увеличенное времени полужизни в сыворотке, повышенную аффинность связывания, пониженную иммуногенность, повышенное продуцирование, измененное связывание Fc-лиганда, повышенная или пониженная активность ADCC или CDC (комплементзависимая цитотоксичность), измененное гликозилирование и/или дисульфидные связи и измененная специфичность связывания. В связи с этим следует иметь в виду, что эти Fc-варианты преимущественно могут быть использованы для усиления эффективных противоопухолевых свойств раскрытых модуляторов.

Термин "Fc-область" используется в данной заявке для обозначения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, включая Fc-области с нативной последовательностью и вариантные Fc-области. Хотя границы Fc-области тяжелой цепи иммуноглобулина могут варьироваться, Fc-область тяжелой цепи IgG человека обычно простирается от аминокислотного остатка в положении Cys226 или Pro230, до его карбоксильного конца. С-концевой лизин (остаток 447 согласно европейской системе нумерации) Fc-области может быть удален, например, в процессе изготовления или очистки антитела или при рекомбинантном конструировании нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь антитела. Соответственно, композиция интактных антител может содержать популяции антител, где все остатки K447 удалены, популяции антител, где остатки К447 не удалены, и популяции антител, имеющие смесь антител с остатком или без остатка K447. Функциональная Fc-область обладает эффекторной функцией Fc-области с нативной последовательностью. Типичные эффекторные функции включают связывание C1q; CDC; связывание Fc-рецептора; ADCC; фагоцитоз; уменьшение числа клеточных поверхностных рецепторов (например, В-клеточного рецептора; BCR) и т.д. Для таких эффекторных функций, как правило, требуется, чтобы Fc-область была объединена со связывающим доменом (например, вариабельным доменом антитела), и они могут быть оценены с помощью различных анализов, как раскрыто, например, в определениях в данном описании.

Fc-рецептор или FcR обозначает рецептор, который связывается с Fc-областью антитела. В некоторых воплощениях FcR представляет собой нативный человеческий FcR. В некоторых воплощениях FcR связывается с IgG антителом (гамма-рецептор) и включает рецепторы подклассов FcγRI, Fc.RII и FcγRIII, в том числе аллельные варианты и альтернативно сплайсированные формы этих рецепторов. Рецепторы FcγII включают FcγRIIA (активирующий рецептор) и FcγRIIB (ингибирующий рецептор), которые имеют аналогичные аминокислотные последовательности, отличающиеся главным образом своими цитоплазматическими доменами. Активирующий рецептор Fcγ RIIA содержит иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив (1ТАМ) в своем цитоплазматическом домене. Ингибирующий рецептор FγRIIB содержит иммунорецепторный тирозиновый ингибирующий мотив (1Т1М) в своем цитоплазматическом домене (см., например, Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcR рассматриваются, например, в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Другие FcR, в том числе те, которые будут определены в будущем, охвачены здесь термином FcR. Термин Fc-рецептор или FcR также включает неонатальный рецептор, FcRn, который, в некоторых случаях, отвечает за перенос материнских IgG плоду (Guyeret al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) и регуляцию гомеостаза иммуноглобулинов. Известны методы измерения связывания с FcRn (см., например, Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004); WO 2004/92219 (Hinton et al.).

б. Функции Fc

При использовании здесь "комплемент-зависимая цитотоксичность" и "CDC" относится к лизису целевой клетки в присутствии комплемента. Путь активации комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с молекулой, например антитела, образующей комплекс с когнатным антигеном. Для оценки активации комплемента можно выполнить анализ CDC, например, как описано в Gazzano-Santoro et al., 1996, J. Immunol. Methods, 202:163.

Кроме того, антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность или ADCC относится к форме цитотоксичности, при которой секретируемый Ig, связанный с Fc-рецепторами (FcRs), присутствующими на некоторых цитотоксических клетках (например, естественных киллерах (NK), нейтрофилах и макрофагах) позволяет этим цитотоксическим эффекторным клеткам специфически связываться с целевой клеткой, несущей антиген, и затем убивать эту целевую клетку цитотоксинами. Специфические высокоаффинные IgG антитела направлены на целевое плечо цитотоксических клеток и абсолютно необходимы для такой гибели. Лизис целевой клетки является внеклеточным, требует непосредственного контакта между клетками и не требует участия комплемента.

Варианты EFNA-модулятора с измененной аффинностью связывания FcR или активностью ADCC обладают либо повышенной, либо ослабленной активностью связывания FcR и/или активностью ADCC по сравнению родительским или немодифицированным антителом или с модулятором, содержащим Fc-область с нативной последовательностью. Вариант модулятора, который демонстрирует повышенное связывание с FcR, связывается по меньшей мере с одним FcR с лучшей аффинностью, чем родительское или немодифицированное антитело или модулятор, содержащий Fc-область с нативной последовательностью. Вариант, который демонстрирует уменьшенное связывание с FcR, связывается по меньшей мере с одним FcR с меньшей аффинностью, чем родительское или немодифицированное антитело или модулятор, содержащий Fc-область с нативной последовательностью. Такие варианты, которые демонстрируют уменьшенное связывание с FcR, могут обладать незначительным связыванием или не иметь существенного связывания с FcR, например 0-20% связывания с FcR по сравнению с нативной последовательностью Fc-области IgG, например, как определено с помощью хорошо известных в данной области методов.

Что касается FcRn, антитела по настоящему изобретению также содержат или охватывают варианты Fc с модификациями в константной области, которые обеспечивают время полужизни (например, время полужизни в сыворотке) у млекопитающего, предпочтительно человека, более 5 суток, более 10 суток, более 15 суток, предпочтительно, более 20 суток, более 25 суток, более 30 суток, более 35 суток, более 40 суток, более 45 суток, более 2 месяца, более 3 месяца, более 4 месяца или более 5 месяцев. Увеличение времени полужизни антител (или Fc-содержащих молекул) по настоящему изобретению у млекопитающего, предпочтительно человека, приводит к более высокому титру сыворотки указанных антител или фрагментов антител у млекопитающего и, таким образом, снижает частоту введения указанных антител или фрагментов антитела, и/или снижает вводимую концентрацию указанных антител или фрагментов антител. Антитела с увеличенным временем полужизни in vivo можно получить с помощью методов, хорошо известных специалистам в данной области. Например, антитела с увеличенным временем полужизни in vivo можно получить путем модификации (например, замены, делеции или добавления) аминокислотных остатков, которые определены как участвующие во взаимодействие между доменом Fc и рецептором FcRn (см., например, международную публикацию WO 97/34631; WO 04/029207; патент США 6737056 и патент США 2003/0190311. Связывание с человеческим FcRn in vivo и время полужизни в сыворотке человеческих высокоаффинных FcRn-связывающих полипептидов можно оценить, например, на трансгенных мышах или в трансфицированных клеточных линиях человека, экспрессирующих человеческий FcRn, или на приматах, которым вводят полипептиды с вариантной Fc-областью. В WO 2000/42072 описаны варианты антител с улучшенным или ослабленным связыванием с FcRns. См. также, например, Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001).

в. Модификации гликозилирования

В других воплощениях профили гликозилирования или композиции антител по изобретению являются модифицированными. Более конкретно, предпочтительные воплощения настоящего изобретения могут содержать одну или более сконструированных гликоформ, то есть измененный профиль гликозилирования или измененную композицию углеводов, ковалентно присоединенных к молекуле, содержащей Fc-область. Сконструированные гликоформы могут быть полезны для различных целей, включая, но не ограничиваясь ими, повышение или снижение эффекторной функции, увеличение аффинности антитела к целевому антигену или облегчение получения антитела. В случаях, когда желательной является пониженная эффекторная функция, следует понимать, что молекула может быть сконструирована для экспрессии в агликозилированной форме. Такие углеводные модификации могут быть выполнены, например, путем изменения одного или более сайтов гликозилирования в последовательности антитела. Это означает, что можно сделать одну или более аминокислотных замен, что приводит к удалению одного или более сайтов гликозилирования вариабельной области каркасного участка, тем самым устраняя гликозилирование в этом сайте (см., например, патенты США 5714350 и 6350861). С другой стороны, повышенные эффекторные функции или улучшенное связывание может быть придано Fc-содержащей молекуле посредством конструирования одного или более дополнительных сайтов гликозилирования.

Дополнительно или альтернативно можно получить вариант Fc, который имеет измененную гликозилирующую композицию, например гипофукозилированное антитело, имеющее пониженное количество фукозильных остатков, или антитело, имеющее увеличенные гемисекционные GlcNAc структуры. Было показано, что эти и подобные профили гликозилирования увеличивают ADCC-способность антител. Сконструированные гликоформы можно получить любым способом, известным специалисту в данной области, например используя сконструированные штаммы или штаммы, экспрессирующие варианты, посредством коэкспрессии с одним или более ферментами (например, N-ацетилглюкозаминилтрансферазой III (GnTI11)), посредством экспрессии молекулы, содержащей Fc-область в различных организмах или клеточных линиях из различных организмов или посредством модификации углевода(ов) после экспрессии молекулы, содержащей Fc-область. См., например, Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, а также европейский патент ЕР 1176195; PCT публикации WO 03/035835; WO 99/54342, Umana et al, 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473) патент США 6602684; заявки США 10/277370; 10/113929; PCT WO 00/61739 A1; PCT WO 01/292246 A1; PCT WO 02/311140 A1; PCT WO 02/30954 A1; Potillegent™ технологию (Biowa, Inc.); технологию конструирования гликозилирования GlycoMAb™ (GLYCART biotechnology AG); WO 00061739; EA 01229125; патент США 2003/0115614; Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49.

IX. Экспрессия модулятора

а. Обзор

ДНК, кодирующая нужные модуляторы EFNA, может быть легко выделена и секвенирована с использованием обычных процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антител). Выделенные и субклонированные гибридомные клетки (или колонии, полученные из фагов и дрожжей) могут являться предпочтительным источником такой ДНК, если модулятор представляет собой антитело. Если необходимо, нуклеиновую кислоту можно дополнительно обработать, как описано здесь, для создания агентов, включающих слитые белки или химерные, гуманизированные или полностью человеческие антитела. Более конкретно, выделенную ДНК (которую можно модифицировать) можно использовать для клонирования последовательностей константной и вариабельной области для получения антител, как описано в патенте США 7709611.

Этот типичный способ предусматривает экстракцию РНК из выбранных клеток, превращение в кДНК, и амплификацию посредством PCR с использованием антитело-специфических праймеров. Подходящие праймеры хорошо известны в данной области и, как приведено в качестве примера в данном описании, легкодоступны из различных коммерческих источников. Следует понимать, что для экспрессии рекомбинантного человеческого или нечеловеческого антитела, выделенного путем скрининга комбинаторной библиотеки, ДНК, кодирующую антитело, клонируют в рекомбинантный экспрессирующий вектор и вводят в клетки-хозяева, включая клетки млекопитающих, клетки насекомых, клетки растений, дрожжей и бактерий. В других воплощениях модуляторы вводят и экспрессируют при помощи обезьяньих клеток COS (африканской зеленой мартышки), клеток NSO, клеток яичника китайского хомячка (СНО) или клеток миеломы, которые иначе не продуцируют нужную конструкцию. Как обсуждается более подробно ниже, трансформированные клетки, экспрессирующие нужный модулятор, могут быть выращены в относительно больших количествах, чтобы обеспечить клинические и коммерческие поставки слитой конструкции или иммуноглобулина.

Независимо от того, получали или выделяли нуклеиновую кислоту, кодирующую необходимую часть модулятора EFNA, с помощью метода фагового дисплея, из дрожжевых библиотек, с помощью метода, основанного на гибридоме, синтетически или из коммерческих источников, следует понимать, что настоящее изобретение явным образом охватывает молекулы нуклеиновой кислоты и последовательности, кодирующие модуляторы EFNA, включая слитые белки и анти-EFNA антитела или их антиген-связывающие фрагменты или производные. Данное изобретение также охватывает нуклеиновые кислоты или молекулы нуклеиновых кислот (например, полинуклеотиды), которые гибридизуются в условиях гибридизации высокой жесткости или, альтернативно, в условиях гибридизации средней или низкой жесткости (например, как определено ниже), с полинуклеотидами, комплементарными нуклеиновым кислотам, имеющим полинуклеотидную последовательность, которая кодирует модулятор по изобретению или его фрагмент или вариант. Термин "молекула нуклеиновой кислоты" или "выделенная молекула нуклеиновой кислоты", используемый здесь, как предполагается, включает по меньшей мере молекулы ДНК и молекулы РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно является двухцепочечной ДНК. Кроме того, настоящее изобретение включает любой наполнитель или конструкцию, включающую такой полинуклеотид, кодирующий модулятор, включая, без ограничения ими, векторы, плазмиды, клетки-хозяева, космиды или вирусные конструкции.

Термин "выделенная нуклеиновая кислота" означает, что нуклеиновую кислоту (1) амплифицировали in vitro, например посредством полимеразной цепной реакции (PCR), (2) рекомбинантно получали посредством клонирования, (3) очищали, например путем расщепления и гель-электрофоретического фракционирования, или (4) синтезировали, например посредством химического синтеза. Выделенная нуклеиновая кислота представляет собой нуклеиновую кислоту, которая подходит для обработки методами рекомбинантной ДНК.

Более конкретно также предложены нуклеиновые кислоты, которые кодируют модулятор, в том числе одну или обе цепи антитела по изобретению, или его фрагмент, производное, мутеин или вариант, полинуклеотиды, достаточные для использования в качестве гибридизационных зондов, PCR-праймеры или праймеры для секвенирования для идентификации, анализа, мутации или амплификации полинуклеотида, кодирующего полипептид, антисмысловые нуклеиновые кислоты для ингибирования экспрессии полинуклеотида и комплементарные последовательности вышеизложенного. Нуклеиновые кислоты могут быть любой длины. Они могут быть длиной, например, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1,000, 1,500, 3,000, 5,000 или больше нуклеотидов, и/или могут содержать одну или более дополнительных последовательностей, например регуляторных последовательностей, и/или являться частью более крупной нуклеиновой кислоты, например вектора. Эти нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или двухцепочечными и могут включать РНК- и/или ДНК-нуклеотиды и их искусственные варианты (например, пептидные нуклеиновые кислоты). Нуклеиновые кислоты, кодирующие модуляторы по изобретению, в том числе антитела или их иммунореактивные фрагменты или производные, предпочтительно выделены, как описано выше.

б. Гибридизация и идентичность

Как указано, в изобретении также предлагаются нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются с другими нуклеиновыми кислотами в определенных условиях гибридизации. Методы гибридизации нуклеиновых кислот хорошо известны в данной области техники. См., например, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. В контексте настоящей заявки в качестве умеренно жестких условий гибридизации используют раствор для предварительного промывания, содержащий 5х хлорид натрия/цитрат натрия (SSC), 0,5% SDS (додецилсульфат натрия), 1,0 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) (рН 8,0), буфер для гибридизации, состоящий из примерно 50% формамида, 6xSSC и температуру гибридизации 55°С (или другие аналогичные растворы для гибридизации, например, раствор, содержащий примерно 50% формамида, с температурой гибридизации 42°С), и следующие условия для промывания - 60°С, в 0,5×SSC, 0,1% SDS. В жестких условиях гибридизация происходит в 6xSSC при 45°С, с последующими одним или более промываниями в 0,1×SSC, 0,2% SDS при 68°С. Кроме того, специалист в данной области техники может управлять условиями гибридизации и/или промывания с целью увеличения или уменьшения жесткости гибридизации, таким образом, чтобы нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, которые по меньшей мере на 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичны друг другу, обычно остаются гибридизованными друг с другом. В целом, в контексте настоящего описания изобретения термин "по существу идентичная" в отношении последовательности нуклеиновой кислоты следует понимать, как последовательность нуклеотидов, демонстрирующую по меньшей мере примерно 85%, или 90%, или 95%, или 97%-ную идентичность последовательности со стандартной нуклеиновокислотной последовательностью.

Основные параметры, влияющие на выбор условий гибридизации и руководство для разработки подходящих условий, изложены, например, в Sambrook, Fritsch, and Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., chapters 9 и 11; и Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 and 6.3-6.4) и могут быть легко определены специалистами в данной области на основании, например, длины и/или композиции оснований нуклеиновой кислоты.

Следует понимать, что нуклеиновые кислоты могут, согласно изобретению, присутствовать отдельно или в комбинации с другими нуклеиновыми кислотами, которые могут быть гомологичными или гетерологичными. В предпочтительных воплощениях нуклеиновая кислота функционально связана с последовательностями, контролирующими экспрессию, которые могут быть гомологичными или гетерологичными в отношении указанной нуклеиновой кислоты. В этом контексте термин "гомологичный" означает, что нуклеиновая кислота в природных условиях также функционально связана с последовательностью, контролирующей экспрессию, и термин "гетерологичный" означает, что нуклеиновая кислота в природных условиях функционально не связана с последовательностью, контролирующей экспрессию.

в. Экспрессия

Нуклеиновая кислота, такая как нуклеиновая кислота, экспрессирующая РНК и/или белок или пептид, и последовательность, контролирующая экспрессию, функционально связаны друг с другом, если они ковалентно соединены друг с другом таким образом, что экспрессия или транскрипция указанной нуклеиновой кислоты находится под контролем или под влиянием указанной последовательности, контролирующей экспрессию. Если нуклеиновую кислоту следует транслировать в функциональный белок, тогда, при последовательности, контролирующей экспрессию, функционально связанной с кодирующей последовательностью, индукция указанной последовательности, контролирующей экспрессию, приводит к транскрипции указанной нуклеиновой кислоты, не вызывая сдвига рамки считывания кодирующей последовательности или же указанная кодирующая последовательность не способна транслироваться в нужный белок или пептид.

Термин "последовательность, контролирующая экспрессию", содержит, согласно изобретению, промоторы, сайты связывания рибосомы, энхансеры и другие контролирующие элементы, которые регулируют транскрипцию гена или трансляцию мРНК. В конкретных воплощениях изобретения последовательности, контролирующие экспрессию, можно регулировать. Точная структура последовательностей, контролирующих экспрессию, может варьироваться в зависимости от вида или типа клетки, но, как правило, содержит 5′-нетранскрибируемые и 5′- и 3′-нетранслируемые последовательности, которые вовлечены в инициацию транскрипции и трансляции, соответственно, такие как ТАТА-бокс, кэпирующая последовательность, последовательность СААТ и тому подобное. Более конкретно, 5′-нетранскрибируемые последовательности, контролирующие экспрессию, содержат промоторную область, которая включает промоторную последовательность для контроля транскрипции функционально связанной нуклеиновой кислоты. Последовательности, контролирующие экспрессию, также могут содержать энхансерные последовательности или выше расположенные активаторные последовательности.

Согласно изобретению, термин "промотор" или "промоторная область" относится к нуклеиновокислотной последовательности, которая расположена выше (5′) экспрессируемой последовательности нуклеиновой кислоты и контролирует экспрессию последовательности, обеспечивая узнавание и сайт связывания РНК-полимеразы. Промоторная область может включать дополнительные сайты узнавания и связывания дополнительных факторов, вовлеченных в регуляцию транскрипции гена. Промотор может контролировать транскрипцию прокариотического или эукариотического гена. Кроме того, промотор может быть индуцибельным и может инициировать транскрипцию в ответ на индуцирующий агент, или может быть конститутивным, если транскрипция не контролируется индуцирующим агентом. Ген, находящийся под контролем индуцибельного промотора, не экспрессируется или лишь незнач