НАБОР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ НУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ МЕДИЦИНСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ ДЕТЕКЦИИ НАИБОЛЕЕ ЧАСТЫХ В РОССИИ ДЕЛЕЦИЙ ГЕНА DMD МЕТОДОМ МУЛЬТИПЛЕКСНОГО ПЦР/ПДАФ АНАЛИЗА

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии, конкретно к молекулярной биологии и генетике.

Миодистрофия Дюшенна (МДД) - наследственное заболевание, которое начинается в возрасте 2-5 лет и характеризуется прогрессирующей мышечной слабостью, атрофией и псевдогипертрофией проксимальных мышц, нередко сопровождается кардиомиопатиями и нарушением интеллекта. На ранних этапах заболевания наблюдается повышенная утомляемость при ходьбе, изменение походки («утиная походка»). При этом происходит постепенная деградация мышечных тканей. 95% больных перестают ходить в возрасте 8-12 лет. В возрасте 18-20 лет больные, как правило, умирают, часто от дыхательной недостаточности. Выделяют аллельную МДД форму - мышечную дистрофию Беккера (МДБ), которая характеризуется сходными клиническими проявлениями, более поздним началом (примерно в 10-16 лет) и более мягким течением. Такие больные часто сохраняют способность ходить до 20 лет, а некоторые - до 50-60 лет, хотя в патологический процесс вовлечены те же мышцы, что и при МДД. Продолжительность жизни таких больных сокращена незначительно (Boland BJ, Silbert PL, Groover RV et al. Skeletal, cardiac, and smooth muscle failure in Duchenne muscular dystrophy. Pediatr Neurol. 1996 Jan; 14(1): 7-12. PubMed PMID: 8652023.).

Мышечная дистрофия Дюшена (МДД) встречается приблизительно у одного из 2500-4000 новорожденных мальчиков. Точная частота мышечной дистрофии Беккера до сих пор не определена ( S, Kavaslar GN, E, et al. Deletion pattern in the dystrophin gene in Turks and a comparison with Europeans and Indians. Ann Hum Genet. 2000 Jan; 64 (Pt 1): 33-40. PubMed PMID: 11388892; Shomrat R, Gluck E, Legum C, Shiloh Y. Relatively low proportion of dystrophin gene deletions in Israeli Duchenne and Becker muscular dystrophy patients. Am J Med Genet. 1994 Feb 15; 49(4): 369-73. PubMed PMID: 8160727.)

Биохимическим маркером заболевания является повышенный (в 50-200) раз уровень креатинфосфокиназы (КФК) в крови. У носительниц поврежденного гена уровень КФК в среднем также несколько повышен.

Тип наследования мышечной дистрофии Дюшена - Х-сцепленный рецессивный, т.е. им страдают почти исключительно мальчики, женщины же с поврежденным геном в одной из Х-хромосом являются носительницами МДД. Приблизительно в 2/3 случаев сын получает хромосому с повреждением от матери-носительницы, в остальных случаях заболевание возникает в результате мутации de novo в половых клетках матери либо в предшественниках этих клеток (Caskey СТ, Nussbaum RL, Cohan LC, Pollack L. Sporadic occurrence of Duchenne muscular dystrophy: evidence for new mutation. Clin Genet. 1980 Nov; 18(5): 329-41. PubMed PMID: 7460369.) Ген DMD, ответственный за прогрессирующую мышечную дистрофию Дюшена/Беккера (МДД/МДБ), находится в локусе Хр21.2, имеет размер 2,6 млн п.н. и состоит из 79 экзонов. В 70% случаев мутации, приводящие к МДД/МДБ, представляют собой протяженные делеции (от одного до нескольких десятков экзонов), в 20% случаев - точковые мутации и в 10% случаев - дупликации. Из-за наличия так называемых «горячих участков» делеций амплификация 19 экзонов и промоторной области гена DMD позволяет выявлять примерно 90% всех крупных делеций. Поиск точковых мутаций затруднен из-за большого размера гена и отсутствия мажорных мутаций (Tuffery-Giraud S, С, Leturcq F, et al. Genotype-phenotype analysis in 2,405 patients with a dystrophinopathy using the UMD-DMD database: a model of nationwide knowledgebase. Hum Mutat. 2009 Jun; 30(6): 934-45. doi: 10.1002/humu.20976. PubMed PMID: 19367636).

Наличие любого типа мутаций (делеции/дупликации в одном или нескольких экзонах, «точковые» мутации) является молекулярно-генетическим подтверждением клинического диагноза миодистрофии Дюшена/Беккера и позволяет проводить дородовую диагностику в данной семье.

На сегодняшний день для детекции делеций гена DMD у больных мышечными дистрофиями Дюшена/Беккера применяются следующие методики. Метод мультиплексной проба-зависимой лигазной реакции (Janssen В, Hartmann С, Scholz V et al. MLPA analysis for the detection of deletions, duplications and complex rearrangements in the dystrophin gene: potential and pitfalls. Neurogenetics. 2005 Feb; 6(1): 29-35. Epub 2005 Jan 18. PubMed PMID: 15655674) Достоинствами данного метода является его высокая точность, возможность детектировать не только делеций, но и дупликации гена дистрофина, возможность определения мутации в гетерозиготном состоянии. Основными недостатками данного метода являются трудоемкость анализа, высокая стоимость исследования, необходимость наличия дорогостоящего оборудования (генетического анализатора - секвенатора) для проведения исследования, высокие требования к качеству биологического материала для анализа.

ПЦР в реальном времени (Zhang Т, Liu S, Wei Т. et al. Development of a comprehensive real-time PCR assay for dystrophin gene analysis and prenatal diagnosis of Chinese families. Clin Chim Acta. 2013 Sep 3; 424: 33-8. doi: 10.1016/j.cca.2013.05.006. Epub 2013 May 13. PubMed PMID: 23680072.)

Достоинством данного метода является теоретическая возможность детектировать не только делеций, но и дупликации гена DMD, а также возможность выявления делеций в гетерозиготном состоянии. К недостаткам относится низкая точность исследования, относительно высокая стоимость и трудоемкость анализа, необходимость наличия дорогостоящей аппаратуры.

Задачей заявляемого изобретения является создание оптимального набора последовательностей олигонуклеотидов для анализа гемизиготных делеций гена DMD, ответственного за мышечные дистрофии Дюшена/Беккера исходя из частот делеций различных участков гена среди пациентов в Российской Федерации.

Задача решается путем создания оптимального набора последовательностей олигонуклеотидов для детекции делеций любого из следующих фрагментов гена DMD либо их совокупности: промоторной области; 3, 4, 6, 8, 13, 17, 19, 32, 42, 43, 44, 45, 47, 48, 50, 51, 52, 53, 60 экзонов.

Техническим результатом заявленного изобретения является создание оптимального набора последовательностей олигонуклеотидов для детекции делеций любог, из следующих фрагментов гена DMD либо их совокупности: промоторной области; 3, 4, 6, 8, 13, 17, 19, 32 42, 43, 44, 45, 47, 48, 50, 51, 52, 53, 60 экзонов с использованием мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с визуализацией результата методом электрофореза в полиакриамидном геле.

Технический результат достигается подбором оптимального набора последовательностей олигонуклеотидов для мультиплексной ПЦР промоторной области; 3, 4, 6, 8, 13, 17, 19, 32 42, 43, 44, 45, 47, 48, 50, 51, 52, 53, 60 экзонов гена DMD, имеющих следующий нуклеотидный состав:

SEQ ID NO 1 5'-TTGAATACATTGGTTAAATCCCAACATG-3'

SEQ ID NO 2 5'-CCTGAATAAAGTCTTCCTTACCACAC-3'

SEQ ID NO 3 5'-TCATCCATCATCTTCGGCAGATTAA-3'

SEQ ID NO 4 5'-CAGGCGGTAGAGTATGCCAAATGAAAATCA-3'

SEQ ID NO 5 5'-GAAATTGGCTCTTTAGCTTGTGTTTC-3'

SEQ ID NO 6 5'-GGAGAGTAAAGTGATTGGTGGAAAATC-3'

SEQ ID NO 7 5'-GAACATGTCAAAGTCACTGGACTTCATGG-3'

SEQ ID NO 8 5'-ATATATGTGTTACCTACCCTTGTCGGTCC-3'

SEQ ID NO 9 5'-CTTTCTTTGCCAGTACAACTGCATGTG-3'

SEQ ID NO 10 5'-CATTCCTATTAGATCTGTCGCCCTAC-3'

SEQ ID NO 11 5'-CTTGATCCATATGCTTTTACCTGCA-3'

SEQ ID NO 12 5'-TCCATCACCCTTCAGAACCTGATCT-3'

SEQ ID NO 13 5'-TTGAAAGAATTCAGAATCAGTGGGATG-3'

SEQ ID NO 14 5'-CTTGGTTTCTGTGATTTTCTTTTGGATTG-3'

SEQ ID NO 15 5'-TTGTCGGTCTCCTGCTGGTCAGTG-3'

SEQ ID NO 16 5'-CAAAGCCCTCACTCAAACATGAAGC-3'

SEQ ID NO 17 5'-AGGAGAAATTGCGCCTCTGAAAGAGAACG-3'

SEQ ID NO 18 5'-CTGCAGAAGCTTCCATCTGGTGTTCAGG-3'

SEQ ID NO 19 5'-AATGCAGGATTTGGAACAGAGGCGTCC-3'

SEQ ID NO 20 5'-TTCGATCCGTAATGATTGTTCTAGCCTC-3'

SEQ ID NO 21 5'-TTCTACCACATCCCATTTTCTTCCA-3'

SEQ ID NO 22 5'-GATGGCAAAAGTGTTGAGAAAAAGTC-3'

SEQ ID NO 23 5'-GACTTTCGATGTTGAGATTACTTTCCC-3'

SEQ ID NO 24 5'-AAGCTTGAGATGCTCTCACCTTTTCC-3'

SEQ ID NO 25 5'-GTCCTTTACACACTTTACCTGTTGAG-3'

SEQ ID NO 26 5'-GGCCTCATTCTCATGTTCTAATTA-3'

SEQ ID NO 27 5'-CACCAAATGGATTAAGATGTTCATGAAT-3'

SEQ ID NO 28 5'-TCTCTCTCACCCAGTCATCACTTCATAG-3'

SEQ ID NO 29 5'-AATAGGAGTACCTGAGATGTAGCAGAAAT-3'

SEQ ID NO 30 5'-CTGACCTTAAGTTGTTCTTCCAAAGCAG-3'

SEQ ID NO 31 5'-CCACATGTAGGTCAAAAATGTAATGAA-3'

SEQ ID NO 32 5'-GTCTCAGTAATCTTCTTACCTATGACTATGG-3'

SEQ ID NO 33 5'- CGTTGTTGCATTTGTCTGTTTCAGTTAC-3'

SEQ ID NO 34 5'-GTCTAACCTTTATCCACTGGAGATTTG-3'

SEQ ID NO 35 5'-GGAAACCAACTTGAGAGAGAAGGCGGGT-3'

SEQ ID NO 36 5'-GTAATTGCCTCCCAGATCTGAGTCCTGTAG-3'

SEQ ID NO 37 5'-CACACTGTCCGTGAAGAAACGATGATG-3'

SEQ ID NO 38 5'-TTAGCACAGAGGTCAGGAGCATTGAG-3'

SEQ ID NO 39 5'-ATGTCTCCATGAAGTTTCGATTATTCC-3'

SEQ ID NO 40 5'-CACACTCTTTGTTTCCAATGCAGGC-3'.

На первом этапе на основе нуклеотидной последовательности гена DMD (NCBI NM_004006.2) таким образом, чтобы продукты амплификации имели разницу длин, достаточную для детекции в ПААГ.

Изобретение поясняется фигурой. На фигуре представлены результаты электрофоретического разделения продуктов двух мультиплексных ПЦР. В случае отсутствия в образцах ДНК делеций промоторной области; 3, 4, 6, 8, 13, 17, 19, 32 42, 43, 44, 45, 47, 48, 50, 51, 52, 53, 60 экзонов гена DMD в гемизиготном состоянии на электрофорезе наблюдаются по 10 полос в каждом из мультиплексов. В мультиплексе 1 наблюдаются полосы длинами 506-410-388-357-307-268-212-196-139-113 пар нуклеотидов, соответствующие продуктам амплификации последовательности экзонов 48-3-51-43-45-44-53-4-60-52 гена DMD. В мультиплексе 2 наблюдаются полосы длинами 459-416-360-271-238-202-181-168-155-122 пар нуклеотидов, соответствующие продуктам амплификации последовательности экзонов 19-17-8-50-13-6-47-промотерной области-42-32 гена DMD. При наличии делеций полосы, соответствующие делетированным фрагментам гена, отсутствуют.

Для проведения молекулярно-генетического исследования ДНК выделяется из лимфоцитов периферической крови человека с использованием набора реактивов выделения DNA Prep100 (DIAtom™) по протоколу производителя. Для приготовления растворов, необходимых для проведения ПЦР, использовались импортные реагенты высокой степени очистки. Последовательности олигонуклеотидных праймеров были синтезированы ЗАО «Евроген», г. Москва. Амплификацию всех исследуемых фрагментов ДНК проводили методом ПЦР на программируемом термоциклере МС2 фирмы «ДНК-технология» (Россия) в двух пробирках по десять соответствующих фрагментов в каждой из пробирок в объеме 25 мкл реакционной смеси следующего состава: 20-100 нг геномной ДНК; по 0.25 мкМ каждого оригинального олигопраймера (SEQ ID NO: 1-3); по 200 мкМ каждого нуклеозидтрифосфата; 1,0 единица активности ДНК-полимеразы Biotaq («БиоМастер»); буфер для ПЦР (67 мM Tris-HCl; 16.6 мM (NH₄)₂SO₄; 0.01% Twin-20; pH 8.8); 6,0 мM MgCl₂; 20-30 мкл минерального масла.

Параметры ПЦР были следующие: денатурация двухцепочечной ДНК при t=95°C в течении 5 минут, далее 30 циклов полимеразной цепной реакции t=94°C -45 секунд, t=60°C - 45 секунд, t=72°C - 45 секунд, окончательная элонгация при t=72°C в течение 7 минут.

Визуализацию результатов ПЦР производили в 8% геле с соотношением акриламида (АА) и бисакриламида (БА) 29:1. Для заливки 8% ПААГ готовили раствор следующего состава: 13,3 мл 30%-ного раствора АА и БА; 5 мл 10×ТВЕ; 31,7 мл дистиллированной воды. Непосредственно перед заливкой геля в раствор добавляли 400 мкл 10%-ного персульфата амония и 48 мкл ТЕМЕД. В качестве электрофорезного буфера использовали 1×TBE. Проводили префорез в течение 20 мин. Пробы для нанесения на гель готовились следующим образом: 10 мкл смеси после ПЦР-реакции смешивали с 2 мкл буфера для нанесения. Состав буфера для нанесения проб: 25% бромфенолового синего; 25% ксилолцианола; 30% глицерина; 20% дистилированной воды. Проводили электрофорез при 15-18 В/см в течение 2 часов. В качестве маркера молекулярного веса использовали ДНК фага λ, рестрицированную PstI.

После разделения фрагментов гель окрашивали в растворе бромистого этидия (0,1 мкг/мл в 1×TBE) в течение 20 минут, промывали водой. Результаты исследования регистрировались на гель-документирующей системе GelDoc® 2000.

Таким образом, представленный материал показывает, что предлагаемый способ позволяет эффективно детектировать делеций любого, из следующих фрагментов гена DMD либо их совокупности: промоторной области; 3, 4, 6, 8, 13, 17, 19, 32 42, 43, 44, 45, 47, 48, 50, 51, 52, 53, 60 экзонов в гемизиготном состоянии которые встречаются у 60% российских больных мышечной дистрофией Дюшена/Беккера. Применение данного изобретения позволяет оптимизировать молекулярно-генетическую диагностику мышечной дистрофии Дюшена/Беккера, позволяет проводить высокоинформативную диагностику на биологическом материале низкого качества, например пятнах крови. Низкая себестоимость и простота исследования позволяют применять данный способ детекции практически в любой ПЦР-лаборатории с минимальным набором оборудования и реактивов.

ПЕРЕЧЕНЬ НУКЛЕОТИДОВ

SEQ ID NO 1 5'-TTGAATACATTGGTTAAATCCCAACATG-3'

SEQ ID NO 2 5'-CCTGAATAAAGTCTTCCTTACCACAC-3'

SEQ ID NO 3 5'-TCATCCATCATCTTCGGCAGATTAA-3'

SEQ ID NO 4 5'-CAGGCGGTAGAGTATGCCAAATGAAAATCA-3'

SEQ ID NO 5 5'-GAAATTGGCTCTTTAGCTTGTGTTTC-3'

SEQ ID NO 6 5'-GGAGAGTAAAGTGATTGGTGGAAAATC-3'

SEQ ID NO 7 5'-GAACATGTCAAAGTCACTGGACTTCATGG-3'

SEQ ID NO 8 5'-ATATATGTGTTACCTACCCTTGTCGGTCC-3'

SEQ ID NO 9 5'-CTTTCTTTGCCAGTACAACTGCATGTG-3'

SEQ ID NO 10 5'-CATTCCTATTAGATCTGTCGCCCTAC-3'

SEQ ID NO 11 5'-CTTGATCCATATGCTTTTACCTGCA-3'

SEQ ID NO 12 5'-TCCATCACCCTTCAGAACCTGATCT-3'

SEQ ID NO 13 5'-TTGAAAGAATTCAGAATCAGTGGGATG-3'

SEQ ID NO 14 5'-CTTGGTTTCTGTGATTTTCTTTTGGATTG-3'

SEQ ID NO 15 5'-TTGTCGGTCTCCTGCTGGTCAGTG-3'

SEQ ID NO 16 5'-CAAAGCCCTCACTCAAACATGAAGC-3'

SEQ ID NO 17 5'-AGGAGAAATTGCGCCTCTGAAAGAGAACG-3'

SEQ ID NO 18 5'-CTGCAGAAGCTTCCATCTGGTGTTCAGG-3'

SEQ ID NO 19 5'-AATGCAGGATTTGGAACAGAGGCGTCC-3'

SEQ ID NO 20 5'-TTCGATCCGTAATGATTGTTCTAGCCTC-3'

SEQ ID NO 21 5'-TTCTACCACATCCCATTTTCTTCCA-3'

SEQ ID NO 22 5'-GATGGCAAAAGTGTTGAGAAAAAGTC-3'

SEQ ID NO 23 5'-GACTTTCGATGTTGAGATTACTTTCCC-3'

SEQ ID NO 24 5'-AAGCTTGAGATGCTCTCACCTTTTCC-3'

SEQ ID NO 25 5'- GTCCTTTACACACTTTACCTGTTGAG-3'

SEQ ID NO 26 5'-GGCCTCATTCTCATGTTCTAATTA-3'

SEQ ID NO 27 5'-CACCAAATGGATTAAGATGTTCATGAAT-3'

SEQ ID NO 28 5'-TCTCTCTCACCCAGTCATCACTTCATAG-3'

SEQ ID NO 29 5'-AATAGGAGTACCTGAGATGTAGCAGAAAT-3'

SEQ ID NO 30 5'-CTGACCTTAAGTTGTTCTTCCAAAGCAG-3'

SEQ ID NO 31 5'-CCACATGTAGGTCAAAAATGTAATGAA-3'

SEQ ID NO 32 5'-GTCTCAGTAATCTTCTTACCTATGACTATGG-3'

SEQ ID NO 33 5'-CGTTGTTGCATTTGTCTGTTTCAGTTAC-3'

SEQ ID NO 34 5'-GTCTAACCTTTATCCACTGGAGATTTG-3'

SEQ ID NO 35 5'-GGAAACCAACTTGAGAGAGAAGGCGGGT-3'

SEQ ID NO 36 5'-GTAATTGCCTCCCAGATCTGAGTCCTGTAG-3'

SEQ ID NO 37 5'-CACACTGTCCGTGAAGAAACGATGATG-3'

SEQ ID NO 38 5'-TTAGCACAGAGGTCAGGAGCATTGAG-3'

SEQ ID NO 39 5'-ATGTCTCCATGAAGTTTCGATTATTCC-3'

SEQ ID NO 40 5'-CACACTCTTTGTTTCCAATGCAGGC-3'