НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЧАСТЫХ МУТАЦИЙ В ГЕНЕ CAPN3, ОТВЕТСТВЕННОМ ЗА ПОЯСНО-КОНЕЧНОСТНУЮ МЫШЕЧНУЮ ДИСТРОФИЮ 2А ТИПА

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии, конкретно к молекулярной биологии и генетике.

Поясно-конечностные прогрессирующие мышечные дистрофии (ПКМД) - группа клинически полиморфных и генетически гетерогенных заболеваний, характеризующихся преимущественным поражением мышц тазового и плечевого поясов. Частота всех ПКМД колеблется в различных популяциях от 5 до 70 больных на 1 млн населения. Вследствие того, что белковые продукты генов, мутации в которых приводят к развитию аутосомно-рецессивных ПКМД, участвуют в одном патогенетическом процессе, клинические проявления всех генетических вариантов этой группы заболеваний характеризуются значительным сходством, что затрудняет их дифференциальную диагностику и снижает эффективность медико-генетического консультирования. Показано, что в большинстве европейских популяций наиболее распространенным генетическим вариантом ПКМД с аутосомно-рецессивным типом наследования является 2А тип (OMIM: 253600), обусловленный мутациями в гене кальпаина 3 (CAPN3), на долю которого приходится от 30% до 40% всех случаев этой группы заболеваний (Canki-Klain N. et al (2004). Prevalence of the 550delA mutation in calpainopathy (LGMD 2A) in Croatia // Am J Med Genet - 2004 - 125A: 152-6; Duno M. et al cDNA analyses of CAPN3 enhance mutation detection and reveal a low prevalence of LGMD2A patients in Denmark // Eur J Hum Genet - 2008 - 16: 935-40).

Показано, что у жителей РФ с ПКМД 2А наиболее часто встречаются мутации c.598_612del и c.550delA - обе или одна из которых встречается хотя бы на одной из хромосом в 81% случаев среди всех больных ПКМД2А (56% хромосом с мутациями) (Рыжкова О.П. и др. Клинико-генетические характеристики поясно-конечностной прогрессирующей мышечной дистрофии 2А типа // Медицинская генетика. - 2011. - Т. 10, №1: 15-21).

На сегодняшний день для детекции мутаций гена CAPN3 у больных ПКМД 2А применяются следующие методики.

Метод анализа конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК (SSCP) (Fanin М. et al How to tackle the diagnosis of limb-girdle muscular dystrophy 2A. // Eur J Hum Genet. - 2009 - 17(5):598-603). Недостатки: низкая точность, высокая трудоемкость исследования, необходимость подтверждения выявленных изменений прямым автоматическим секвенированием по Сенгеру.

Секвенирование по Сенгеру (Saenz A. et al. LGMD2A: genotype-phenotype correlations based on a large mutation al survey on the calpain 3 gene. // Brain. - 2005 - 128(Pt 4):732-742.; K. et al Autosomal recessive limb-girdle muscular dystrophies in the Czech Republic. // BMC Neurol. - 2014 - Aug 19; 14:154). Недостатки: высокая стоимость исследования, трудоемкость проведения анализа, необходимость специальной высокотехнологичной аппаратуры.

Полногеномное/экзомное секвенирование нового поколения (NGS) (Nigro V, Savarese М. Genetic basis of limb-girdle muscular dystrophies: the 2014 update. // Acta Myol. - 2014 - May; 33(1):1-12). Недостатки: высокая стоимость исследования, трудоемкость проведения анализа, необходимость специальной высокотехнологичной аппаратуры, необходимость биоинформационной платформы для обработки результатов, необходимость проверки выявленных изменений прямым автоматическим секвенированием по Сенгеру.

Задачей заявляемого изобретения является создание оптимального набора последовательностей олигонуклеотидов для анализа мутаций гена CAPN3, ответственного за ПКМД 2А исходя из частот мутаций среди пациентов в Российской Федерации.

Задача решается путем создания оптимального набора последовательностей олигонуклеотидов для детекции мутаций c.598_612del и c.550delA гена CAPN3.

Техническим результатом заявленного изобретения является создание оптимального набора последовательностей олигонуклеотидов для детекции мутаций c.598_612del и c.550delA гена CAPN3 с использованием мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с визуализацией результата методом электрофореза в полиакриамидном геле.

Технический результат достигается подбором оптимального набора последовательностей олигонуклеотидов для мультиплексной ПЦР мутаций c.598_612del и c.550delA гена CAPN3, имеющих следующий нуклеотидный состав:

SEQ ID NO 1 5'-GGTGAAAACCAGTTGATTGTTGTAC-3'

SEQ ID NO 2 5'-GAACTCATTGCGGTGGTTGGAC-3'

SEQ ID NO 3 5'-CGTGGTTATAGATGACTGCCTGC-3'.

На первом этапе на основе нуклеотидной последовательности гена CAPN3 (NCBI Reference Sequence: NM_000070.2) были подобраны три праймера SEQ ID NO 1-3. Так как мутации c.598_612del и c.550delA находятся друг от друга на расстоянии 48 н.п. для их детекции в одной реакции была подобрана одна последовательность прямого и две последовательности обратных праймеров, фланкирующих области интересующих мутаций, таким образом, чтобы продукты амплификации с нормальных и мутантных аллелей имели разницу длин, достаточную для детекции в ПААГ.

Изобретение поясняется фигурой. На фигуре представлены результаты электрофоретического разделения продуктов мультиплексной ПЦР. При отсутствии в образце ДНК мутаций c.598_612del и c.550delA в ПААГ визуализируются два фрагмента с длинами 51 и 179 пар нуклеотидов (п.н.), в случае присутствия в образце мутации c.598_612del в гетерозиготном состоянии и отсутствия мутации c.550delA - три фрагмента длиной 51, 164 и 179 п.н., при наличии мутации c.598_612del в гомозиготном состоянии и отсутствии мутации c.550delA - два фрагмента 51 и 164 п.н., при мутации c. 550delA в гетерозиготном состоянии и отсутствии c.598_612del - три фрагмента длиной 50, 51 и 179 н.п., при мутации c.550delA в гомозиготном состоянии и отсутствии c.598_612del - два фрагмента длиной 50 и 179 н.п, при наличии в образце мутаций c.598_612del и c.550delA в компаунд-гетерозиготном состоянии визуализируются 4 фрамента длинами 50, 51, 164 и 179 н.п.

Для проведения молекулярно-генетического исследования ДНК выделяется из лимфоцитов периферической крови человека с использованием набора реактивов выделения DNA Prep 100 (DIAtom™) по протоколу производителя. Для приготовления растворов, необходимых для проведения ПЦР, использовались импортные реагенты высокой степени очистки. Последовательности олигонуклеотидных праймеров были синтезированы ЗАО «Евроген», г. Москва. Амплификацию всех исследуемых фрагментов ДНК проводили методом ПЦР на программируемом термоциклере МС2 фирмы «ДНК-технология» (Россия) в объеме 25 μl реакционной смеси следующего состава: 20-100 нг геномной ДНК; по 0.25 μМ каждого оригинального олигопраймера (SEQ ID NO: 1-3); по 200 μМ каждого нуклеозидтрифосфата; 1,0 единица активности ДНК-полимеразы Biotaq («БиоМастер»); буфер для ПЦР (67 mM Tris-HCl; 16.6 mM (NH₄)₂SO₄; 0.01% Twin-20; рН 8.8); 6,0 mM MgCl₂; 20-30 μl минерального масла.

Параметры ПЦР были следующие: денатурация двухцепочечной ДНК при t=94°C в течение 5 минут, далее 30 циклов полимеразной цепной реакции t=94°C - 30 секунд, t=65°C - 30 секунд, t=72°C - 30 секунд, окончательная элонгация при t=72°C в течение 5 минут.

Визуализацию результатов ПЦР производили в 10% геле с соотношением акриламида (АА) и бисакриламида (БА) 19:1. Для заливки 10% ПААГ готовили раствор следующего состава: 16,7 мл 30%-ного раствора АА и БА; 5 мл 10xTBE; 28,3 мл дистиллированной воды. Непосредственно перед заливкой геля в раствор добавляли 400 мкл 10%-ного персульфата амония и 48 мкл ТЕМЕД. В качестве электрофорезного буфера использовали 1xTBE. Проводили префорез в течение 20 мин. Пробы для нанесения на гель готовились следующим образом: 10 мкл смеси после ПЦР-реакции смешивали с 2 мкл буфера для нанесения. Состав буфера для нанесения проб: 25% бромфенолового синего; 25% ксилолцианола; 30% глицерина; 20% дистиллированной воды. Проводили электрофорез при 15-18 В/см в течение 3 часов. В качестве маркера молекулярного веса использовали ДНК фага λ, рестрицированную PstI.

После разделения фрагментов гель окрашивали в растворе бромистого этидия (0,1 мкг/мл в 1xTBE) в течение 20 минут, промывали водой. Результаты исследования регистрировались на гель-документирующей системе GelDoc® 2000.

Таким образом, представленный материал показывает, что предлагаемый способ позволяет эффективно детектировать две наиболее частые мутации c.598_612del и c.550delA гена CAPN3, обе или одна из которых встречается хотя бы на одной из хромосом в 81% случаев среди всех больных ПКМД2А. Применение данного изобретения позволяет оптимизировать молекулярно-генетическую диагностику поясно-конечностных мышечных дистрофий. Низкая себестоимость и простота исследования позволяют применять данный способ детекции практически в любой ПЦР-лаборатории с минимальным набором оборудования и реактивов.

ПЕРЕЧЕНЬ НУКЛЕОТИДОВ