Результат интеллектуальной деятельности: Способ определения относительной устойчивости сортов мягкой яровой пшеницы к возбудителю обыкновенной корневой гнили злаков

Предлагаемое изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к биофизическим способам оценки устойчивости растений, и может быть использовано для массовой оценки селекционного материала мягкой яровой пшеницы на устойчивость к возбудителю корневой гнили злаков Bipolaris sorokiniana Shoem. (далее В. sorokiniana) в лабораторных условиях.

Известен ряд способов определения относительной устойчивости сортов ячменя и пшеницы к обыкновенной корневой гнили злаков: по регистрации фотоиндуцированной люминесценции высечек листьев проростков, обработанных культуральным фильтратом возбудителя (см. А.с. СССР №1488976, МПК A01G 7/00, A01H 1/0, 1989), по регистрации замедленной флуоресценции зеленеющих этиолированных проростков, здоровых и инфицированных спорами возбудителя (см. Патент РФ №2188538, МПК A01G 7/00, A01H 1/0, 2002), по регистрации собственного и индуцированного свечения корневых экссудатов здоровых проростков и инфицированных возбудителем корневой гнили злаков (см. Патент РФ №2166245, МПК A01G 7/00, A01H 1/0, 2001). Практическая реализация данных способов предполагает наличие дорогостоящей аппаратуры для анализа, что делает сложным и ограниченным возможность их применения при массовых анализах.

Известны лабораторные способы определения устойчивости растений к обыкновенной корневой гнили при выращивании предварительно инфицированных проростков в рулонной культуре с дальнейшей балловой оценкой интенсивности развития и распространенности болезни (см. Бенкен А.А., Хрустовская В.H. Лабораторная оценка болезнеустойчивости растений и паразитических свойств возбудителей обыкновенной корневой гнили злаков / Труды ВНИИЗР. - Л., 1977. - Вып. 56. С. 9-13).

Известен метод оценки токсиноустойчивости сортов, когда, используя эмпирически подобранные концентрации культурального фильтрата возбудителя корневой гнили злаков, отбирают более выносливые к действию токсинов образцы. Критерием устойчивости сортов служит степень ингибирования ростовых процессов (см. Гешеле Э.Э. Методическое руководство по фитопатологической оценке зерновых культур - Одесса, 1971 - 180 с). Недостатком известных способов является их значительная трудоемкость, длительность и субъективность оценки.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу (прототипом) является способ оценки устойчивости сортов яровой пшеницы по ингибированию ростовых процессов и биомассы (см. Рогинская В.А. Влияние условий культивирования на токсинообразование у возбудителя корневой гнили пшеницы гриба Helmintosporium sativum Pam, King et Bakke // Микробные ассоциации и их функционирование в почвах Западной Сибири. - Новосибирск, изд-во «Наука», 1979, - с. 243-250.)

Предварительно отобранные и простерилизованные этиловым спиртом семена испытуемых сортов раскладывают в чашки Петри по 25 штук на фильтровальную бумагу, увлажненную 5 мл дистиллированной воды (контроль) и 5 мл культурального фильтрата гриба, полученного в процессе выращивания его на жидкой питательной среде Чапека, в соответствующем разведении. Культивируют в термостате при температуре 20-22°С в течение 7 суток. Через 7 суток у проростков отделяют корни от ростков и сушат при температуре 105°С до постоянного веса. Критерием устойчивости сорта служит показатель корнеобеспеченности, численно равный сухой биомассе корней, деленной на сухую биомассу ростков. Основным недостатком способа является его высокая трудоемкость и существенные временные затраты. Он включает такие трудоемкие и длительные операции, как подготовка лабораторной посуды, раскладывание семян по чашкам Петри, проращивание их в течение недели, разборка проростков, отделение ростков от корней, высушивание и взвешивание каждого образца. Поэтому данный способ недостаточно эффективен при массовых оценках сортов на токсиноустойчивость.

Целью предполагаемого изобретения является сокращение временных затрат, снижение трудоемкости оценки устойчивости сортов пшеницы на стадии проростков и дифференциальная диагностика устойчивости сортов мягкой яровой пшеницы к токсическому действию метаболитов возбудителя обыкновенной корневой гнили злаков.

Поставленная цель достигается тем, что в известный способ оценки устойчивости сортов яровой пшеницы к токсинам возбудителя корневой гнили злаков В. sorokiniana путем обработки растительных образцов культуральным фильтратом, содержащим токсины гриба, выращенного на жидкой питательной среде Чапека, вводят следующие операции: выращивание проростков в рулонной культуре на водопроводной воде в условиях постоянной освещенности до фазы 2-3 листьев, помещение растений в дистиллированную воду (контроль) и культуральный фильтрат (опыт) на 24 ч, приготовление путем нарезки из второго листа контрольных и опытных растений образцов, помещение образцов в дистиллированную воду в соотношении 1:4 на 1,5 ч в условия освещения, фильтрацию вытяжек, определение их электропроводности при частоте 1 КГц и дифференцирование сортов по устойчивости - чем меньше относительное изменение электропроводности, тем устойчивее сорт.

Предлагаемый способ определения устойчивости сортов мягкой яровой пшеницы к возбудителю обыкновенной корневой гнили злаков осуществляется следующим образом.

Отбирают хорошо выполненное без видимых признаков поражения болезнями, вредителями и без механических повреждений зерно пшеницы и для устранения поверхностной сапрофитной и патогенной микрофлоры стерилизуют его этанолом в течение 1 минуты, после чего трижды ополаскивают стерильной дистиллированной водой (см. Wood L.S. Relation of variation in Helminthosporium sativum to seedling blight of small grains // Phytopathology. - 1962, v. 52. - P. 493-498). Простерилизованное зерно проращивают в термостате в чашках Петри на фильтровальной бумаге, смоченной водой. Затем проросшие семена раскладывают на лентах фильтровальной бумаги, ленты скручивают в рулоны и помещают в кюветы с дистиллированной водой в условия постоянной температуры и освещенности (t=22°С, влажность 60%, Е=5000 лк). Проростки выращивают до фазы 2-3 листьев.

Гриб выращивают на жидкой питательной среде Чапека в течение 6-8 суток, затем отделяют от образовавшегося мицелия культуральный фильтрат, который в это время имеет максимальную фитотоксичность (см. Березина В.Ю., Гурова Т.А., Беребердин Н.А., Лангольф Э.И. Оценка биологической активности возбудителя обыкновенной корневой гнили злаков: методические рекомендации. СО РАСХН. Новосибирск, 1994. - 24 с). Культуральный фильтрат содержит продукты метаболизма гриба, в том числе и токсины, которые вызывают структурно-функциональные нарушения у растений при инфицировании. Степень и характер патологического процесса поражения растений при обработке их культуральным фильтратом гриба, показывают, что токсические вещества вырабатываемые грибом в культуре, являются аналогичными при патогенезе в организме растения-хозяина. Поэтому, используя в качестве повреждающего фактора культуральный фильтрат (разведения токсинов возбудителя) мы тем самым моделируем систему растение-хозяин - патоген.

В фазе 2-3 листьев часть растений оставляют в дистиллированной воде (контроль), а часть помещают в раствор культурального фильтрата возбудителя обыкновенной корневой гнили злаков в разведении 1:1 дистиллированной водой на 24 ч (опыт).

Концентрация действующего раствора культурального фильтрата была подобрана опытным путем. Экспериментально нами было установлено, что при меньших концентрациях токсинов возбудителя межсортовые различия по электрофизическим параметрам водных вытяжек из тканей могут быть менее выражены (Таблица 1).

Затем из контрольных и опытных растений готовят образцы.

Подготовка образцов. У проростков отделяют вторые листья, промывают их водопроводной водой, обсушивают фильтровальной бумагой. Для получения экспериментального материала одного физиологического возраста при подготовке образцов берутся листья только одного яруса. Листья контрольных и опытных растений промывают водопроводной водой и обсушивают фильтровальной бумагой. В каждом варианте готовят средний образец. Для этого из средней части листьев лезвием нарезают растительный материал на кусочки длиной 1,5 мм. Такой способ подготовки образцов позволяет получить однородный экспериментальный материал и уменьшить вариацию измеряемых параметров (Таблица 2). Нарезанный растительный материал помещают в капроновый мешочек и промывают под струей водопроводной воды, затем ополаскивают дистиллированной водой. Нарезанную ткань осторожно промокают фильтровальной бумагой и готовят навески, помещают их в стеклянный стаканчик с дистиллированной водой. Экспериментально установлено, что соотношение массы листовой ткани и дистиллированной воды, которая добавляется для получения вытяжек, должно составлять не менее 1:4. При меньших соотношениях получаемые вытяжки представляют собой сильно разбавленные растворы электролитов (особенно в контрольных вариантах), вследствие чего значительно возрастает вариабельность показателей (таблица 3).

В виду ограниченного количества экспериментального материала, особенно при испытании новых сортов или селекционных образцов, более высокая массовая доля листовой ткани не всегда достижима. Указанное массовое соотношение, как было нами установлено, является вполне достаточным для выявления межсортовых различий по электрофизическим параметрам.

Подготовленные образцы листовой ткани проростков двух сортов мягкой яровой пшеницы помещают в условия освещения Е=5000 лк.

Время световой экспозиции образцов, как установлено нами экспериментально, должно составлять не менее 1,5 часа. При меньших временах экспозиции различия между контрольными и опытными вариантами были статистически не достоверны. Увеличение времени экспозиции приводит к неоправданному возрастанию продолжительности процедуры оценки образцов и снижению производительности (таблица 4).

Затем подготовленные вытяжки фильтруют через капроновую ткань, полученный фильтрат помещают в измерительную ячейку (электрохимический преобразователь) и измеряют электропроводность при переменном напряжении на частоте 1 КГц (для предотвращения поляризации электродов).

Об устойчивости сорта судят по относительному изменению электропроводности (К) водных вытяжек листовой ткани проростков после экспозиции растений в растворе культурального фильтрата:

где G_к - электропроводность водных вытяжек листьев контрольных образцов;

G_o - электропроводность водных вытяжек листьев опытных образцов.

Пример реализации способа

Процесс оценки устойчивости сортов мягкой яровой пшеницы к токсинам возбудителя обыкновенной корневой гнили злаков по электропроводности водных вытяжек из листовой ткани проростков продемонстрируем на примере двух сортов сибирской селекции Александрина и Светланка.

Предварительно отобранное хорошо выполненное без видимых признаков поражения болезнями, вредителями и без механических повреждений зерно пшеницы для устранения поверхностной сапрофитной и патогенной микрофлоры стерилизовали этанолом в течение 1 минуты, после чего трижды ополаскивали стерильной дистиллированной водой. Подготовленное зерно раскладывали в чашки Петри на фильтровальную бумагу, смоченную водой, и помещали в термостат для проращивания. Проросшие семена раскладывали на лентах фильтровальной бумаги, после чего ленты скручивали в рулоны, рулоны ставили в кюветы с дистиллированной водой и переносили в шкаф роста растений (см. патент РФ №2446673, МПК A01G 9/24, 2012) в условия постоянной температуры и освещенности (t=22°С, влажность 60%, Е=5000 лк). Проростки выращивали до фазы 2-3 листьев.

Споровую суспензию смеси трех среднепатогенных изолятов возбудителя корневой гнили злаков засевали в конические колбы емкостью 50 мл с 10 мл питательной среды Чапека. Колбы с засеянными изолятами гриба инкубировали в термостате при t=23°С в течение 6-8 суток. Культуральный фильтрат отделяли от образовавшегося мицелия фильтрованием и готовили разведение культурального фильтрата дистиллированной водой 1:1.

В фазе 2-3 листьев часть растений оставляли в дистиллированной воде (контроль), а часть растений помещали в растворы токсинов возбудителя обыкновенной корневой гнили злаков в разведении 1:1 дистиллированной водой на 24 ч (опыт). Затем из средней части вторых листьев контрольных и опытных растений в соответствии с вышеописанной методикой готовили образцы листовой ткани, укладывали их в стаканчики с дистиллированной водой и помещали в условия освещения на 1,5 ч. После фильтрования водные вытяжки помещали в электрохимическую ячейку и измеряли электропроводность при переменном напряжении на частоте 1 КГц на цифровых измерителей L, С, R, Ε 7-8 и Е7-12, а также кондуктометре лабораторном КЛ-С-1. Оценку устойчивости сортов проводили по формуле (1).

Устойчивость сортов Александрина и Светланка к возбудителю обыкновенной корневой гнили злаков была предварительно оценена в лабораторных условиях методом проростков - по всхожести, развитию болезни, ростовым реакциям, накоплению сырой и сухой биомассы. Результаты представлены в таблице 5, относительные изменения параметров роста и электропроводности - в таблице 6. Как следует из приведенных данных, у сорта Светланка подавление ростовых процессов и накопления биомассы выражено значительнее, чем у сорта Александрина. Это означает, что Светланка является менее устойчивым к возбудителю обыкновенной корневой гнили злаков сортом, чем сорт Александрина.

Как следует из таблицы 6 выборочные средние относительных изменений показателей длины и биомассы ростков и корней у данных сортов различаются в 1,5…3,9 раза, тогда как выборочные средние для относительных изменений показателя электропроводность водных вытяжек листовой ткани различаются в 6,9 раза.

Представленные данные убедительно показывают, что результаты оценки устойчивости к возбудителю обыкновенной корневой гнили злаков сортов Александрина и Светланка по ростовым процессам и по электропроводности водных вытяжек листовой ткани совпали.

Проведены испытания предлагаемого способа на ряде сортов мягкой яровой пшеницы. Результаты представлены в таблице 7.

Коэффициент корреляции рангов Спирмена между показателями устойчивости по ростовым процессам и по электропроводности водных настоев листовой ткани проростков составляет r_s=0.89 на уровне значимости по критерию Стьюдента р≤0,01.

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. А.с. СССР №1488976. Способ определения относительной устойчивости зерновых культур к токсинам Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoemaker. / Березина В.Ю., Гурова Т.А., Павлов Е.И., Рябцев А.Ф., Бухтияров И.Д. - Заявл. 22.06.85, зарег. 22.02.89.

2. Патент РФ №2188538. Способ определения относительной устойчивости сортов пшеницы к обыкновенной корневой гнили злаков. / Гурова Т.А., Березина В.Ю. - Заявл. 27.05.1999, опубл. 10.09.2002. Бюл. №25.

3. Патент РФ №216624. Способ определения относительной устойчивости сортов ячменя и пшеницы к обыкновенной корневой гнили злаков. / Гурова Т.А., Березина В.Ю. - Заявл. 20.07.1999, опубл. 10.05.2001. Бюл. №13.

4. Бенкен Α.Α., Хрустовская В.Н. Лабораторная оценка болезнеустойчивости растений и паразитических свойств возбудителей обыкновенной корневой гнили злаков / Труды ВНИИЗР. - Л., 1977 - Вып. 56. С. 9-13.

5. Гешеле Э.Э. Методическое руководство по фитопатологической оценке зерновых культур - Одесса, 1971. - 180 с.

6. Рогинская В.А. Влияние условий культивирования на токсинообразование у возбудителя корневой гнили пшеницы гриба Helmintosporium sativum Pam, King et Bakke // Микробные ассоциации и их функционирование в почвах Западной Сибири. - Новосибирск, изд-во «Наука», 1979, - с. 243-250.

7. Wood L.S. Relation of variation in Helminthosporium sativum to seedling blight of small grains // Phytopathology. - 1962, v. 52. - P. 493-498.

8. Березина В.Ю., Гурова T.A., Беребердин H.A., Лангольф Э.И. Оценка биологической активности возбудителя обыкновенной корневой гнили злаков: методические рекомендации. СО РАСХН. Новосибирск, 1994. - 24 с.

9. Патент РФ №2446673. Шкаф роста растений. / Альт В.В., Золотарев В.А., Минеев В.В., Даукшис Л.А. - Заявл. 21.06.2010, опубл. 10.04.2012.