Результат интеллектуальной деятельности: Бесплазмидный рекомбинантный штамм Escherichia coli, обладающий конститутивной аспартазной активностью и способ синтеза L-аспарагиновой кислоты с использованием этого штамма в качестве биокатализатора

Изобретение относится к биотехнологии и касается штамма Escherichia coli, обладающего аспартазной активностью, а также способа синтеза L-аспарагиновой кислоты из фумарата аммония с использованием клеток этого штамма в качестве биокатализатора.

L-аспарагиновая кислота представляет собой дикарбоновую аминокислоту, которая синтезируется в любой клетке живых организмов и используется для построения белков. Как химический реагент L-аспарагиновая кислота используется, прежде всего, для синтеза искусственного подсластителя - аспартама, а также для изготовления лекарственных препаратов и кормовых добавок.

В настоящее время основным способом получения L-аспарагиновой кислоты является биокаталитический способ, заключающийся в аминировании фумаровой кислоты с помощью фермента аспартазы (аспартат-аммоний-лиазы).

Известен химический синтез аспарагиновой кислоты из малеиновой кислоты и аммиака. Результатом такого синтеза является смесь D и L - изомеров аспарагиновой кислоты, разделение которых является дорогостоящим процессом.

Для синтеза L-аспарагиновой кислоты в качестве биокатализаторов используют бактериальные клетки микроорганизмов, обладающие аспартазной активностью, преимущественно бактерий E.coli, в свободном или иммобилизованном виде (1). Для получения таких клеток применяют различные подходы, в том числе мутагенез (2) и клонирование гена аспартазы (aspA) в составе плазмидных векторов (3).

Главным недостатком обладающих аспартазной активностью клеток, полученных с использованием селекционных подходов (мутагенез и отбор), является низкий уровень активности. В свою очередь клонирование в составе плазмидных векторов требует использования антибиотиков для стабильного поддержания плазмиды и сопровождается появлением в штаммах генов устойчивости к антибиотикам, что приводит к ограничениям при использовании штаммов.

Известен способ биокаталитического синтеза L-аспарагиновой кислоты, в котором в качестве биокатализатора используют штамм E.coli PUaspE2 (3), содержащий ген аспартазы в составе плазмидного вектора. Недостатком способа являются сложность культивирования штамма, связанная с необходимостью вносить в питательную среду антибиотик ампициллин для стабильного поддержания плазмиды и дорогостоящий индуктор синтеза аспартазы изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ).

Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения L-аспарагиновой кислоты, в котором в качестве биокатализатора используют клетки штамма E.coli В-11864 (RU 2546239), содержащего рекомбинантную плазмиду с геном aspA, находящимся под контролем конститутивного промотора. Такой штамм обладает конститутивной аспартазной активностью, однако требует использования антибиотиков для стабильного поддержания плазмиды в штамме.

Задачей заявляемого изобретения является создание штамма E.coli с конститутивной аспартазной активностью, для которого не требуется использования антибиотика для стабильного поддержания уровня продукции аспартазы, а также разработка биокаталитического способа синтеза L-аспарагиновой кислоты с использованием клеток этого штамма в качестве биокатализатора.

Задача решена путем:

- конструирования бесплазмидного штамма бактерий Е.coli В-12466, обладающего конститутивной аспартазной активностью, путем замены в хромосоме штамма Е.coli собственного промотора гена аспартазы (aspA), на промотор pG25 бактериофага Т5, специфичного в отношении штаммов Е.coli;

- разработки способа синтеза L-аспарагиновой кислоты, с использованием в качестве биокатализатора заявляемого штамма бактерий Е.coli В-12466.

Бесплазмидный штамм, содержащий в хромосоме ген aspA под контролем промотора pG25 бактериофага Т5, получен путем замещения фрагмента, содержащего собственный промотор гена аспартазы в штамме Е.coli MG1655, на фрагмент, содержащий промотор pG25 с помощью метода фаг лямбда-зависимой рекомбинации (4). Линейный фрагмент, содержащий промотор pG25, получен с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием в качестве матрицы ДНК бактериофага Т5 (получена из ВКПМ) и праймеров, содержащих области гомологии с хромосомной ДНК в области замещения. Фрагмент, введенный в клетки штамма Е.coli MG1655 путем электропорации, интегрируется в хромосому по участкам гомологии за счет фаговых систем рекомбинации, что приводит к замещению собственного промотора гена аспартазы на промотор pG25 бактериофага Т5. Штамм Е.coli В-12466, в хромосоме которого содержится ген aspA под контролем промотора pG25 из бактериофага Т5, приобретает высокий уровень конститутивной аспартазной активности и способность синтезировать L-аспарагиновую кислоту из фумарата аммония. При смешивании водного раствора фумарата аммония и используемых в качестве биокатализатора клеток Е.coli В-12466 (свободных или иммобилизованных) происходит синтез L-аспарагиновой кислоты.

Характеристика заявляемого штамма

Штамм Е.coli В-12466 является производным штамма Е.coli MG1655 (получен из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, ВКПМ) и обладает следующими морфологическими и физиологическими свойствами. Реакция Фогес-Проскауэра - отрицательная, реакция с метиловым красным - положительная. Культура отрицательна по признакам образования H₂S и гидролиза мочевины. Штамм оксидазоотрицательный, каталазоположительный. Культура представлена грамотрицательными, факультативно анаэробными палочковидными подвижными клетками, со слегка закругленными концами, размером 0,4-0,8×1-3 мкм. Клетки хорошо растут на простых богатых питательных средах, например МПА и LB (5). Оптимальная температура роста 37°C, оптимальный рН 7,2. Колонии на плотных питательных средах (МПА, LB) беловатые блестящие, размером 2-3мм, края ровные, спор не образует.

Получение биомассы заявляемого штамма

Для получения биомассы клеток заявляемого штамма с аспартазной активностью штамм выращивают при 28-30°C в течение 12-15 часов на обычных для E.coli средах: полноценных (LB) либо синтетических, содержащих в качестве источника углерода глюкозу или ацетат в концентрациях 0.1-1%, а в качестве источника азота аммонийные, нитратные соли или дрожжевой экстракт в концентрациях 0.4-2%. Полученные клетки отделяют от культуральной жидкости центрифугированием (3-4 тыс. об/мин), ресуспендируют в 10 мМ фосфатном буфере рН 7,0-8,0 до концентрации 20-40 г по сухой массе/л и хранят в таком виде (клеточная суспензия) при 4°C.

Аспартазную активность клеток штамма определяют по скорости синтеза L-аспарагиновой кислоты следующим образом: к 1 мл 1 М раствора фумарата аммония прибавляют 0,5 мл полученной клеточной суспензии, клетки которой предварительно активируют и смесь инкубируют 10 минут при 37°C. Активирование микробных клеток перед получением L-аспарагиновой кислоты проводят инкубированием суспензии клеток в 1М растворе фумарата аммония при 37°C в течение 16-18 ч. Цель активирования - увеличение проницаемости клеточной мембраны для фумарата и аспартата.

Количество L-аспарагиновой кислоты в образцах определяют спектрофотометрическим методом при длине волны 510 нм. Активность клеток выражают в мкМ L-аспарагиновой кислоты, образующейся за 1 мин при 37°C.

Способ синтеза L-аспарагиновой кислоты в общем виде

Заявляемый способ синтеза L-аспарагиновой кислоты осуществляют путем смешивания растворов фумарата аммония в концентрациях 1М-1,5М (рН 8,0-8,5), содержащего 0,001М MgCl₂ и суспензии биокатализатора в концентрациях 0,4 - 4 мг/мл в термостатируемом реакторе с системой перемешивания и последующей инкубации при температуре 30-37°C в течение 1-6 часов. В качестве биокатализатора в заявляемом способе используют клетки штамма Е.coli В-12466 или в нативном или в иммобилизованном виде. Содержание L-аспарагиновой кислоты определяют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Пример 1. Оценка аспартазной активности заявляемого штамма

Наработку биомассы Е.coli В-12466 осуществляют в 750-мл колбах, содержащих 100 мл среды LB в которые вносят по 1 мл культуры, предварительно выращенной в течение ночи при 37°C в пробирках объемом 40 мл, содержащих 5 мл среды LB, в условиях перемешивания (300 об/мин). Колбы культивируют 2 часа при 37°C, затем снижают температуру до 30°C и продолжают культивирование в течение 8 часов с постоянным перемешиванием (300 об/мин). Затем биомассу штамма Е.coli В-12466 отделяют центрифугированием (5 тыс. об/мин) и хранят при +4°C. Аспартазная активность клеток E.coli В-12466 составляет 140 мкм аспарагиновой кислоты/мин/ мг клеток по сухой массе.

Отличительная особенность заявляемого штамма, содержащего ген aspA под контролем промотора pG25 из фага Т5, состоит в его способности синтезировать фермент аспартазу конститутивно, при этом не требуя использования антибиотика для стабильного поддержания уровня продукции аспартазы. Кроме того, использование сильного конститутивного промотора из фага позволяет увеличить продукцию аспартазы в несколько раз по сравнению с ближайшим аналогом.

Как видно из результатов, приведенных в таблице, при одинаковых условиях культивирования (среда LB) заявляемый штамм, обладающий активностью 143 мкМ аспарагиновой кислоты/мин мг клеток, что в 5,7 раза выше уровня активности штамма E.coli В-11864 - ближайшего аналога (RU2546239).

Пример 2. Синтез L-аспарагиновой кислоты с использованием свободных клеток заявляемого штамма

Синтез L-аспарагиновой кислоты проводят в стеклянном реакторе объемом 100 мл путем смешивания субстрата - 1,5М раствора фумарата аммония (рН 8), содержащего 0,001М MgCl₂ и суспензии активированного биокатализатора в концентрации 0,4 мг/мл, полученного, как указано в примере 1. Процесс проводят при 37°C в течение 1 часа. Концентрацию L-аспарагиновой и яблочной кислот в реакционной смеси определяют с помощью ВЭЖХ. Концентрация L-аспарагиновой кислоты в полученном образце составляет 199,1 г/л, конверсия - 99%, содержание яблочной кислоты 0,06%.

Пример 3. Синтез L-аспарагиновой кислоты с использованием иммобилизованных клеток заявляемого штамма

Биомассу клеток штамма E.coli В-12466 в количестве 7 г, полученную как в примере 1, суспензируют в 27,3 г раствора аспарагината натрия с концентрацией 20%, рН 7,5. Смесь охлаждают до 5°C и к охлажденной смеси добавляют последовательно 6,15 г акриламида, 0,36 г N,N'-метилен-бис-акриламида, 1,0 г 5% водного раствора N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамина и 0,2 г 5% водного раствора персульфата аммония. Полученный гель измельчают, промывают деионизованной водой, затем 1,5М раствором фумарата аммония (рН 8). Синтез L-аспарагиновой кислоты проводят в стеклянном реакторе объемом 200 мл путем смешивания субстрата (смесь фумарата аммония и хлорида магния с конечными концентрациями компонентов смеси - 1,5М раствора фумарата аммония (рН 8) и 0,001М MgCl₂) и 12,5 г гранул иммобилизованного биокатализатора. Процесс проводят при 37°C в течение 1 часа. Конверсия субстрата в продукт составляет не менее 98%.

Выделение L-аспарагиновой кислоты проводят стандартным химическим методом с использованием серной кислоты (2). Из 100 мл элюата получают 18,4 г кристаллической L-аспарагиновой кислоты. Удельный угол вращения в 5 н HCl [α]²⁰_D=24,9.

Таким образом, заявляемый штамм E.coli В-12466, по сравнению с ближайшим аналогом (RU 2546239), обеспечивает более эффективное получение L-аспарагиновой кислоты за счет более высокой аспартазной активности биокатализатора и конститутивного синтеза аспартазы, что делает ненужным использование индуктора. Кроме того, заявляемый штамм не является плазмидосодержащим, не требует использования антибиотика для стабильного поддержания уровня продукции аспартазы и обладает высокой генетической стабильностью. Заявляемый штамм E.coli В-12466, по сравнению с ближайшим аналогом (RU 2546239), позволяет снизить расход биокатализатора для получения L-аспарагиновой кислоты в 3-4 раза.

Заявляемый способ синтеза L-аспарагиновой кислоты с использованием заявляемого штамма в качестве биокатализатора как в виде свободных клеток, так и в иммобилизованном виде обеспечивает сокращение времени синтеза L-аспарагиновой кислоты в 3-4 раза за счет более высокой аспартазной активности биокатализатора.

Список источников информации

1. TOMOHIRO MIZOBATA AND YASUSHI KAWATA (2007) ASPARTASES: MOLECULAR STRUCTURE, BIOCHEMICAL FUNCTION AND BIOTECHNOLOGICAL APPLICATIONS In Industrial Enzymes (eds. J. Polaina and A.P. MacCabe) Springer, 549-565.

2. M.K. Синолицкий и др. Способ получения L-аспарагиновой кислоты. Патент №RU 2174558 С1.

3. М. Mukouyama, S. Komatsuzaki. Method for producing L-aspartic acid, Patent №US 6,214,589 B1, 2001.

4. Kirill A. Datsenko, Barry L. Wanner. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 97 (12), 6640, 2000

5. J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis. Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pr., 1989.