Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИФУНКЦИОНАЛЬНОГО АФФИННОГО СОРБЕНТА ДЛЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ ОЧИСТКИ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в производстве иммуноглобулинов флуоресцирующих для индикации возбудителей инфекционных болезней в реакции иммунофлуоресценции (РИФ).

Для получения высокоактивных, специфичных иммуноглобулинов флуоресцирующих, применяемых в РИФ, необходимо провести качественную очистку препаратов от несвязавшегося красителя - флуоресцеинизотиоцианата (ФИТЦ) и сорбцию гетерологичных антител.

Известен способ получения иммуноглобулинов флуоресцирующих, включающий получение сыворотки, иммуноглобулинов, конъюгацию с ФИТЦ, очистку от несвязавшегося флуорохрома [1].

Недостатком способа является отсутствие 100% специфичности иммуноглобулинов флуоресцирующих диагностических в связи с применением хроматографической очистки препарата только от несвязавшегося ФИТЦ без освобождения от гетерологичных антител.

Известен способ получения иммуноглобулинов флуоресцирующих, включающий получение антител, конъюгацию с ФИТЦ, очистку от несвязавшегося флуорохрома диализом. При использовании данной методики, при получении флуоресцирующих препаратов на основе поликлональных антител, отмечена неспецифическая реакция при взаимодействии с клетками V. cholerae O22. В процессе адсорбции сыворотки клетками V. cholerae O22 не удалось полностью избавиться от гетерологичных антител [2].

Недостатком способа является отсутствие 100% специфичности диагностических иммуноглобулинов флуоресцирующих в связи с применением диализа для очистки препарата от несвязавшегося ФИТЦ без качественного освобождения от гетерологичных антител.

Известен способ получения флуоресцирующего сальмонеллезного препарата, включающий инактивацию сальмонелл формалином, очистку хлороформом, центрифугирование и конъюгирование с ФИТЦ, отмывку от непрореагировавшего красителя путем многократного центрифугирования [3].

Недостатком способа является длительность очистки препарата от несвязавшегося ФИТЦ путем многократного центрифугирования.

Известен способ сорбции иммунной сыворотки крови, включающий иммуносорбцию неспецифических антител водорастворимыми гетерологичными антигенами, иммобилизованными на твердофазном носителе, в качестве которого используют модифицированный алюмосиликат с магнитными свойствами [4].

Недостатком способа является применение сорбента, выполняющего одну функцию - сорбцию гетерологичных антител без очистки от несвязавшегося ФИТЦ.

Цель изобретения - создание бифункционального аффинного сорбента для хроматографической очистки иммуноглобулинов флуоресцирующих от несвязавшегося ФИТЦ и гетерологичных антител.

Известны различные методы очистки иммуноглобулинов флуоресцирующих от несвязавшегося флуорохрома (чаще всего используют метод гельфильтрации с сефадексом G-50 [5] и от гетерологичных антител (применяют корпускулярные антигены или сорбенты с иммобилизованными водорастворимыми гетерологичными антигенами)). Но их применение имеет ряд недостатков. Сефадкс G-50 - дорогостоящий реактив импортного производства. Сорбция корпускулярными антигенами существенно понижает специфические титры антител. Используемые полиакриламидные сорбенты с иммобилизованными водорастворимыми антигенами из гетерологичных штаммов включают в своем составе высокотоксичные дорогостоящие импортные реактивы.

Технический результат изобретения достигается тем, что в качестве бифункционального аффинного сорбента для очистки иммуноглобулинов флуоресцирующих используется модифицированный неосмектин (смектит диоктаэдрический) с иммобилизованными гетерологичными антигенами. Аффинный сорбент обладает бифункциональными свойствами, позволяя провести качественную очистку препаратов от несвязавшегося низкомолекулярного вещества - ФИТЦ и сорбцию гетерологичных антител с сохранением активности иммуноглобулинов флуоресцирующих.

Неосмектин - тонкий, мелкодисперсный порошок для приготовления суспензии (Производитель: ЗАО «Фармпроект», г. Санкт-Петербург). Мощный адсорбент нового поколения, обладающий улучшенными сорбционными свойствами. Эффективно адсорбирует бактерии, вирусы. Состав его представлен соединениями, основными из которых является окись алюминия, окись магния и двуокись кремния, имеет дискоидно-кристаллическую структуру, поэтому обладает выраженным селективным адсорбирующим действием, характеризуется незначительным эффектом набухания.

Первоначально апробацию сорбента проводили на растворе ФИТЦ без иммуноглобулинов, используя неосмектин, а для сравнения - сефадекс G-50 (традиционно применяемый при хроматографической очистке). Сефадекс имеет ряд достоинств, но низкая степень пористости не позволяет использовать его при аффинной хроматографии. Сефадекс можно использовать для очистки от низкомолекулярного красителя, но нельзя применять для иммобилизации белковых лигандов, т.е. получения аффинных сорбентов.

Процент сорбции свободного ФИТЦ на сорбентах определяли следующим образом: сорбенты отмывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ), рН 9,5 до отсутствия спектра поглощения при длине волны 495 нм (максимальный спектр поглощения для ФИТЦ), и к 0,4 г сорбентов добавляли по 0,5 мг/мл раствора ФИТЦ. Через 1 ч процент сорбции ФИТЦ на сефадексе и неосмектине составил (80±1)%.

Для придания сорбенту - неосмектину биоспецифических свойств (получение аффинного сорбента) на его поверхность иммобилизовали водорастворимые антигены, полученные из биомасс гетерологичных штаммов микроорганизмов. Для этого сорбенты отмывали ФСБ, рН 7,2 до отсутствия спектра поглощения при длине волны 280 нм (максимальный спектр поглощения для белка). К 0,4 г сорбента вносили 2,5 мл комплексного водорастворимого бруцеллезного антигена с концентрацией белка 0,5; 1,5; 2,5 и 3,5 мг/мл, полученного из биомасс штаммов В. abortus 544, В. abortus 19 - ВА, В. abortus 345, дающих перекрестную реакцию с иммуноглобулинами туляремийными. Иммобилизацию антигена с матрицей вели при температуре (22±4)°C в течение 1; 2; 4; 18 ч. В результате исследований установлено, что концентрация белка 1,5 мг/мл в объеме 2,5 мл является оптимальной для полного насыщения сорбента антигеном в течение 2 ч.

В результате отработки всех параметров получен бифункциональный аффинный сорбент, пористая структура которого и селективные свойства эффективны для очистки иммуноглобулинов флуоресцирующих от несвязавшегося красителя и гетерологичных антител.

Технология получения бифункционального аффинного сорбента состояла из нескольких этапов: отмывка сорбента до нулевой экстинции на спектрофотометре; иммобилизация с гетерологичными антигенами; отмывка сорбента от несвязавшихся антигенов; очистка иммуноглобулинов флуоресцирующих от свободного ФИТЦ и гетерологичных антител; оценка полноты очистки препарата от несвязавшегося красителя; контроль иммунологических показателей препарата.

Иммуноглобулины флуоресцирующие диагностические освобождали от несвязавшегося флуорохрома традиционным методом хроматографии на колонке с сефадексом G-50 и с помощью разработанного аффинного сорбента, добавляя к нему (после центрифугирования при 6000 g в течение 10 мин) иммуноглобулины флуоресцирующие. Для их очистки в объеме 5 мл путем гельфильтрации необходимо 20 г сефадекса G-50, упакованного в хроматографическую колонку, а разработанного аффинного сорбента - 2,0 г.

Для очистки иммуноглобулинов флуоресцирующих туляремийных от несвязавшегося красителя и гетерологичных антител их вносили в объеме 5 мл во флакон со взвесью разработанного аффинного сорбента (2,0 г) с рН 9,5, взвесь инкубировали 1 ч при температуре (22+4)°C и центрифугировали при 6000 g в течение 10 мин. Надосадочная жидкость представляла собой очищенные иммуноглобулины флуоресцирующие туляремийные диагностические.

Оценку результатов активности и специфичности иммуноглобулинов флуоресцирующих определяли на фиксированных мазках гомологичных и гетерологичных штаммов прямым методом окраски препаратов в РИФ, предварительно проверив активность иммуноглобулинов до сорбции и метки ФИТЦ в реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) (табл. 1).

Микроскопию препаратов проводили в люминесцентном микроскопе серии "Люмам", используя соответствующие фильтры согласно инструкции по эксплуатации прибора. В результате экспериментов получены высокоактивные, специфичные иммунофлуоресцирующие препараты. Проанализировано 3 серии иммуноглобулинов флуоресцирующих туляремийных с концентрацией белка 9-10 мг/мл и молярным соотношением Мф/Мб (нагрузка красителя на белок) от 5,8 до 11,0. Специфическая активность всех приготовленных серий характеризовалась красящим титром, равным разведению 1:64 - 1:128 при исследовании мазков гомологичных возбудителей, рабочее разведение препаратов - 1:32 - 1:64. Наблюдалось яркое свечение гомологичных штаммов и отсутствие свечения гетерологичных штаммов, окрашенных рабочим разведением иммуноглобулинов флуоресцирующих.

Полноту очистки препарата от несвязавшегося флуорохрома определяли методом восходящей хроматографии на бумаге [7]. На хроматографической бумаге обнаруживалось одно ярко флуоресцирующее пятно на месте нанесения препарата, что свидетельствовало о полной очистке иммуноглобулинов флуоресцирующих от ФИТЦ.

Для сравнения проведена очистка иммуноглобулинов флуоресцирующих туляремийных от несвязавшегося флуорохрома по традиционной методике, используя колонку хроматографическую с сефадексом G-50 и от гетерологичных антител, используя полиакриламидный сорбент с фиксированным комплексным бруцеллезным водорастворимым антигеном.

При сравнительном изучении в РИФ активности и специфичности иммуноглобулинов флуоресцирующих туляремийных диагностических, полученных традиционным и модифицированным методами, установлена сопоставимость полученных результатов, а с учетом снижения временных, трудовых и материальных затрат - превосходство предложенного одномоментного метода очистки иммуноглобулинов флуоресцирующих от несвязавшегося красителя и гетерологичных антител становится очевидным (стоимость сефадекса G-50 в 25-30 раз выше стоимости неосмектина).

Бифункциональность свойств сорбентов позволяла выполнять две задачи. Первая - освобождение иммуноглобулинов флуоресцирующих от несвязавшегося красителя - ФИТЦ - в результате физической сорбции последнего на сорбенте. Вторая - очистка иммуноглобулинов флуоресцирующих от гетерологичных антител за счет аффинных взаимодействий последних, входящих в состав иммуноглобулинов и соответствующих антигенов, фиксированных на сорбенте. Отработанная при этом методика может быть использована как основа для получения высокоактивных, специфических иммуноглобулинов флуоресцирующих диагностических при выявлении возбудителей различных инфекций.

Возможность практического применения заявляемого способа иллюстрируется примерами его конкретного выполнения с использованием совокупности заявляемых признаков.

Пример 1. Получение бифункционального аффинного сорбента для очистки иммуноглобулинов флуоресцирующих лептоспирозных от несвязавшегося красителя и гетерологичных антител, контроль в РИФ.

При контроле специфичности иммуноглобулинов лептоспирозных установлено, что наблюдается перекрестная реакция с L. biflexa серогруппы Semaranga, серовар patoc I. Для придания сорбенту - неосмектину биоспецифических свойств (получение аффинного сорбента) на его поверхность иммобилизовали водорастворимый антиген, полученный из биомассы L. biflexa серогруппы Semaranga, серовар patoc I. Для этого сорбент отмывали ФСБ, рН 7,2 и к 0,4 г сорбента вносили 2,5 мл водорастворимого антигена с концентрацией белка 1,5 мг/мл, инкубировали 2 ч, отмывали от несвязавшегося антигена.

Для очистки иммуноглобулинов флуоресцирующих лептоспирозных от несвязавшегося красителя и гетерологичных антител их вносили в объеме 5 мл во флакон с разработанным аффинным сорбентом (2,0 г) с рН 9,5, инкубировали 1 ч при температуре (22+4)°C и центрифугировали при 6000 g в течение 10 мин. Надосадочная жидкость представляла собой очищенные иммуноглобулины флуоресцирующие диагностические лептоспирозные. Далее исследовали иммунологические показатели готовых препаратов (активность, специфичность) в РИФ (табл. 2).

Проанализировано 3 серии иммуноглобулинов флуоресцирующих лептоспирозных с концентрацией белка 10-11 мг/мл и молярным соотношением Мф/Мб от 6,5 до 11,5. Специфическая активность всех приготовленных серий характеризовалась красящим титром, равным 1:32 - 1:64 при исследовании мазков гомологичных возбудителей, рабочее разведение препаратов - 1:16 - 1:32.

Для изучения специфичности испытываемых серий иммуноглобулинов флуоресцирующих в опыт были взяты штаммы культур гетерологичных микроорганизмов: L. biflexa patoc I, L. biflexa Doberdo RPE, Listeria monocytogenes 1-7 серотип, Y. pseudotuberculosis I-II серовар, E.coli 0-10, F. tularensis Miura, B. abortus 19 ВА. В результате констатировано отсутствие специфической иммунофлуоресценции у всех гетерологичных микроорганизмов, взятых в опыт и окрашенных рабочим разведением иммуноглобулинов флуоресцирующих лептоспирозных.

Пример 2. Получение бифункционального аффинного сорбента для очистки иммуноглобулинов флуоресцирующих бруцеллезных от несвязавшегося красителя и гетерологичных антител, контроль в РИФ.

При контроле специфичности иммуноглобулинов бруцеллезных установлено, что наблюдаются перекрестные реакции с F. tularensis Schu и F. tularensis 890 Аз. Для придания сорбенту - неосмектину биоспецифических свойств (получение аффинного сорбента) на его поверхность иммобилизовали водорастворимые антигены, полученные из биомасс вышеназванных штаммов. Для этого сорбент отмывали ФСБ, рН 7,2 и к 0,4 г сорбента вносили 2,5 мл водорастворимого антигена с концентрацией белка 1,5 мг/мл, инкубировали 2 ч, отмывали от несвязавшегося антигена.

Для очистки иммуноглобулинов флуоресцирующих бруцеллезных от несвязавшегося красителя и гетерологичных антител их вносили в объеме 5 мл во флакон со взвесью разработанного аффинного сорбента (2,0 г) с рН 9,5, взвесь инкубировали 1 ч при температуре (22+4)°C и центрифугировали при 6000 g в течение 5-10 мин. Надосадочная жидкость представляла собой очищенные иммуноглобулины флуоресцирующие бруцеллезные диагностические. Далее исследовали специфическую активность готовых препаратов в РИФ (табл. 3).

Специфическая активность всех приготовленных серий характеризовалась красящим титром, равным 1:64 - 1:128 при исследовании мазков гомологичных возбудителей, рабочее разведение препаратов - 1:32- 1:64.

Для изучения специфичности испытываемых серий иммуноглобулинов флуоресцирующих в опыт были взяты штаммы культур гетерологичных микроорганизмов: Y. pseudotuberculosis серовар 1, 2; Y. enterocolitica 64,178; E.coli 0-10, 0-11; F. tularensis Miura; F. tularensis 890 Аз; F. tularensis Schu; F. tularensis 15 НИИЭГ; F. tularensis 503/840. В результате констатировано отсутствие специфической иммунофлуоресценции у всех гетерологичных микроорганизмов, взятых в опыт и окрашенных рабочим разведением иммуноглобулинов флуоресцирующих туляремийных.

Источники информации

1. Патент РФ №2429484. Дондурей Е.А., Осидак Л.В., Потапенко Л.Б., Голованова А.К., Милькинт К.К., Суховецкая В.Ф., Сироткин А.К. Способ экспресс-диагностики ротавирусной инфекции в материалах из верхних дыхательных путей, иммуноглобулин флуоресцирующий сухой для его осуществления. Опубликован 20.09.2011 г. Бюл. №26.

2. Кретенчук О.Ф., Алексеева Л.П., Маркина О.В. Оптимизация условий получения диагностических флюоресцирующих моноклональных иммуноглобулинов для идентификации холерных вибрионов O1 и O139-серогрупп // Клиническая лабораторная диагностика. - 2012. - Вып. №12 - С. 32-34.

3. Патент РФ №2175558. Пантюхина А.Н., Кротова М.Л. Способ получения сухого флуоресцирующего сальмонеллезного диагностикума. Опубликован 10.11.2001 г. Бюл. №31.

4. Патент РФ №2200324. Афанасьев Е.Н., Ефременко В.И., Тюменцева И.С., Жданова Е.В. Способ сорбции иммунной сыворотки крови. Опубликован 10.03.2003 г. Бюл. №7.

5. Ибрагимов А.Н., Бикмуллин А.Г., Сатаева Д.А., Лопухов Л.В., Зайнуллин Л.И., Алимова Ф.К. Хроматографические методы очистки белков. Учебно-методическое пособие. - Казань: ФГАОУВПОКФУ, 2013. - 48 с.

6. Носков Ф.С. Очистка конъюгатов от непрореагировавшего флюорохрома // Иммунологическая диагностика вирусных инфекций / Под ред. Т.В. Перадзе, П. Халонена. - М., 1985. - С. 254.

7. Шторц X. Иммунофлюоресценция: Иммунологические методы. - М.: Медицина, 1987. - С. 128-148.