Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МИКРОГРАВИМЕТРИЧЕСКОГО ИММУНОСЕНСОРА

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии и может быть использовано в производстве иммуносенсоров (биосенсоров) для выявления возбудителей инфекционных заболеваний.

Функция микрогравиметрического иммуносенсора основана на способности кварцевых резонаторов изменять частотные характеристики в зависимости от незначительной массы вещества, фиксирующегося на поверхности кварцевой пластины и электродов. Микрогравиметрические иммуносенсоры позволяют осуществлять прямую регистрацию биохимических взаимодействий без дополнительного введения меток (флуоресцентных, ферментных и др.), что выгодно отличает их от аналогичных устройств. Уникальной особенностью иммуносенсоров является сочетание высокой чувствительности, обеспечиваемой использованием в качестве физического преобразователя пьезокварцевого резонатора, и селективности, определяемой природой применяемых рецепторных молекул [2].

Известен способ получения биосенсоров, включающий физическую сорбцию биослоя с использованием химических реагентов, способствующую защите функциональной активности белков на длительное время [8].

Недостатком данного способа является низкая чувствительность биослоя за счет снижения количества активных центров антител, при использовании жестко действующих химических реагентов.

Известен способ получения иммуносенсоров путем физической сорбции липополисахаридов, выделенных из бактерий Yersinia enterocolitica на поверхности пьезокварцевого резонатора [4]. Применение предлагаемого способа позволяет выявлять антитела с помощью пьезокварцевого сенсора, обеспечивая высокую чувствительность определения.

Недостатком данного способа является длительность получения биорецепторного слоя сенсора (2-3 часа) и низкая стойкость формируемого покрытия в результате физической сорбции, что сказывается на воспроизводимости результатов и сроке службы сенсора.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ детекции макромолекул биосенсорным устройством, включающий предварительную активацию парами альдегидов поверхности пьезокварцевого резонатора в условиях вакуума в УВЧ-поле с последующей иммобилизацией антител [5].

Недостаток этого способа - использование альдегида в качестве активирующего реагента, способного гидролизоваться в водной среде в процессе иммобилизации с иммуноглобулинами, что приводит к снижению стабильности сенсора и эффективности его иммобилизации. Кроме того, использование альдегидов может приводить к неспецифической реакции.

Цель изобретения - создание микрогравиметрических иммуносенсоров для индикации возбудителей особо опасных инфекций (чумы, туляремии, бруцеллеза) с учетом требований сохранения стабильности, чувствительности, специфичности.

К настоящему времени наиболее изучены методы иммобилизации белковых молекул (физическая адсорбция, ковалентная иммобилизация рецепторных молекул). Недостатками метода физической сорбции кварцевых резонаторов является низкая стойкость иммобилизованных антител, что сказывается на сроке годности сенсора.

Для обеспечения стабильности иммобилизованных кварцевых резонаторов необходимо повысить концентрацию поверхностных реакционно-функциональных групп, которая достигается при ковалентной иммобилизации. При этом происходит более прочное закрепление биослоя (рецепторных молекул - иммуноглобулинов, антител) на кварцевой пластине и электроде сенсора, что снижает потери рецепторных молекул при длительном контакте с жидкостью, обеспечивает более высокую воспроизводимость аналитического сигнала, способствует сохранению функциональной активности белковых рецепторных молекул на длительное время.

Технический результат изобретения достигается тем, что в качестве сенсора используются кварцевые резонаторы с никелевыми электродами РК-12 и диаметром кварцевой пластины 8 мм (ЗАО «ЭТНА» Москва), а для активирования поверхности кварцевой пластины и электродов - плазменное напыление низкомолекулярного полиэтиленимина (ПЭИ) [-CH₂CH₂NR-], где R=H или боковая цепь; молекулярная масса меньше 10000 дальтон (Да); плотность 1,05 г/см³). ПЭИ - это полимер с повторяющимися структурными элементами аминогруппы и двумя углеродными алифатическими спейсерами CH₂CH₂ [3]. Плазменное напыление ПЭИ на поверхности кварцевой пластины проводили в сконструированной нами установке [6].

Особенности низкотемпературной вакуумной полимеризации ПЭИ в плазме тлеющего разряда наиболее объективно отражены в монографии X. Ясуда [7]. На стр.122, абз. 5 и 116, абз. 1 отмечено, что «большое число последовательных и параллельных реакций в плазме приводит, соответственно, к образованию ансамбля активных частиц», а «свободные радикалы в полимерах, полученных в плазме, могут присоединять молекулы кислорода или воды, образуя гидроксильные и карбонильные группы». В обзоре A. Mateescu et al. [9] на стр.46 в отношении процессов полимеризации в плазме приведены характеристики полимеризации в плазме, согласующиеся с основными положениями монографии X. Ясуда [7]: «Plasma polymerization processes induce crosslinking besides polymerization, even in the absence of a crosslinker molecule due to the strong ionization conditions and molecular fragmentation».

Основные характеристики полимеризации ПЭИ в плазме заключаются в образовании за счет ультрафиолетового спектра плазмы высокой плотности свободных радикалов, фиксирующихся на неорганических поверхностях и способных образовывать ковалентную связь с иммуноглобулинами за счет пептидных связей [1]. В результате плазменного напыления ПЭИ на поверхности кварцевой пластины и электродов КР образуется наноструктурное равномерное покрытие с доступными реакционно-функциональными группами для ковалентной связи с иммуноглобулинами, имеющей высокую механическую прочность и химическую стабильность.

При конструировании микрогравиметрических иммуносенсоров измеряли параметры исходных кварцевых резонаторов, затем активировали поверхности кварцевых пластин с электродами ПЭИ путем его плазменного напыления в вакуумной установке при давлении 0,48 паскаля (Па) и воздействием УВЧ-полем мощностью 30 Вт (Вт=Дж/секунда (с)), варьировали длительностью обработки в плазме: 10, 20 и 40 с и, таким образом, изменяли величину удельной суммарной энергии потока плазмы от 24 до 96 Вт/см².

Активацию неорганической поверхности пластины кварцевого резонатора осуществляли с помощью нами сконструированной установки - «Установка для ионного напыления» [6]. Работа установки в условиях вакуума (0,48-0,96 Па), действия УВЧ-поля мощностью 30 Вт и поступления паров ПЭИ обеспечивала получение низкотемпературной газоразрядной плазмы с формированием между кварцевыми цилиндрическими стенками камеры светящегося потока плазмы диаметром около 40 мм и длиной ~87 мм (82-92 мм) (сечение ~12,5 см², объем ~100 см³), в центральной части которого располагали обрабатываемую кварцевую пластину с электродами, площадь поверхности которой составляла 1,0 см² с экспозицией в течение 10 с. При этом за 10 с, исходя из мощности УВЧ-поля - 30 Вт, размеров потока плазмы (12,5 см² ×8,7 см ~100 см³), величины площади поверхности кварцевой пластины, равной 1,0 см² и несложных расчетов удельная суммарная энергия плазменной активации кварцевой пластины составляет 24,0 Вт/см² (что эквивалентно 3 значениям солнечной постоянной). Из вышеуказанного источника [7] следует отсутствие необходимости предварительной модификации полимеров, используемых для плазменной полимеризации на поверхностях. По данным этого источника (С.16, абз. 2): «В случае полимеризации в плазме осаждение полимера на подложку в меньшей степени зависит от ее природы и с одинаковым успехом может быть осуществлено на поверхности стекла, органического полимера и металла».

Последующую ковалентную иммобилизацию IgG проводили в 1,0 мл раствора иммуноглобулинов (0,125 мг/мл) в течение 10 мин. Контроль каждой серии растворов IgG осуществляли методом постановки традиционного иммуноферментного анализа (ИФА) с суспензиями гомо- и гетерологичных штаммов и учетом результатов с помощью фотометра Multiskan («Flow», Финляндия) при длине волны 492 нм в планшетах из оптически прозрачного полистирола производства («Flow Laboratories», США).

Для ковалентной иммобилизации чумных, туляремийных или бруцеллезных иммуноглобулинов на поверхности кварцевой пластины и электродов варьировали концентрациями их растворов (0,063, 0,125 и 0,3 мг/мл) и длительностью экспозиции (5, 10 и 15 мин). При этом объемная концентрация активных центров макромолекул (IgG) при расчете по величине атомной единицы массы (а. е. м.), соответственно указанным концентрациям в объеме, равном 1 см³, составила 0,45×10¹⁵, 0,9×10¹⁵ и 2,2×10¹⁵ спин/см³. Однако результаты экспериментов и расчетов поверхностной плотности активных центров показали преимущества выбранной авторами концентрации IgG, равной 0,125 мг/мл (т.е. молекул IgG было кратно в избытке, по сравнению с количеством реакционно-функциональных групп).

Не связавшиеся иммуноглобулины удаляли с поверхностей кварцевых пластин с электродами путем промывания дистиллированной водой в течение 2 мин с последующим высушиванием КР в потоке воздуха в течение 2-3 мин при температуре 35-40°C. Тестировали пятикратные разведения обеззараженных культур вакцинных штаммов Yersinia pestis EV, Francisella tularensis ЖТВ, Brucella abortus 19-BA (от 1×10² до 1×10⁹ м.к./мл), где последние специфически связывались с иммобилизованными на поверхности пластины и электрода резонатора молекулами иммуноглобулинов с образованием иммунокомплекса. Несвязавшиеся клетки возбудителей чумы, туляремии или бруцеллеза удаляли с пластин и электродов кварцевых резонаторов (КР) путем промывания дистиллированной водой, от остатков которой затем избавлялись просушиванием КР в потоке воздуха в течение 2-3 мин при температуре 35-40°C. Результаты анализа измеряли на установке «CPNA-330» (ЗАО «ЭТНА» Москва) в течение 2 мин. Положительным считали сдвиг частот в сторону уменьшения на 200 Гц и более.

В результате экспериментов установлено, что параметрами получения микрогравиметрических иммуносенсоров, необходимыми для их качественной работы, являются: активирование поверхности кварцевых пластин с электродами путем плазменного напыления ПЭИ в течение 10 сек с удельной и суммарной энергией потока плазмы 24 Вт/см² в установке для ионного напыления; иммобилизация на кварцевых пластинах с электродами иммуноглобулинов из раствора с концентрацией белка 0,125 мг/мл в течение 10 мин; отмывка от несвязавшихся иммуноглобулинов дистиллированной водой в течение 2 мин; высушивание остатков воды в течение 2-3 мин в потоке воздуха при температуре 35-40°C.

Чувствительность иммуносенсоров составила 1×10³-1×10⁴ м.к./мл. Сохранение специфической активности иммуносенсоров отмечено в течение 3 мес (срок наблюдения). При контроле специфичности отсутствовали перекрестные реакции с гетерологичными штаммами.

Полученные результаты, позволяют сделать заключение, что разработанная технология создания микрогравиметрических иммуносенсоров для детекции возбудителей особо опасных инфекций (чума, туляремия, бруцеллез) обеспечивает выполнение анализа, отвечающего требованиям по показателям чувствительности, специфичности, времени анализа.

Возможность практического применения изобретения иллюстрируется примерами его конкретного выполнения с использованием совокупности заявляемых признаков.

Пример 1. Получение микрогравиметрического иммуносенсора для индикации чумного микроба.

Предварительно проводили измерение частоты кварцевого резонатора, активировали кварцевую пластину с электродами путем плазменного напыления полиэтиленимина в течение 10 с в вакуумной установке при УВЧ-поля мощностью 30 Вт при удельном суммарном расходе энергии потока плазмы 24 Вт/см², контролировали частоту резонатора, иммобилизировали на поверхности кварцевой пластины и электродах в 1,0 мл раствора чумных иммуноглобулинов с концентрацией 0,125 мг/мл в течение 10 мин, промывали дистиллированной водой в течение 2 мин, высушивали остатки воды в течение 2-3 мин в потоке воздуха при температуре 35-40°C, инкубировали со взвесью чумного микроба в концентрациях от 1×10² м.к./мл до 1×10⁹ м.к./мл в течение 10 мин, промывали и высушивали КР аналогично вышеописанному, измеряли частоту. В качестве отрицательного контроля использовали 0,01 М раствор фосфатно-солевого буфера (ФСБ). По уменьшению частоты биосенсора после инкубации с возбудителем чумы, на 200 и более Гц, судили о наличии патогена. В результате установлено, что чувствительность метода составила 1×10³ м.к./мл (22%) и 1×10⁴ м.к./мл (78%).

Пример 2. Получение микрогравиметрического иммуносенсора для индикации туляремийного микроба.

Получали аналогично примеру 1, только вместо чумных иммуноглобулинов использовали туляремийные иммуноглобулины. Чувствительность метода с гомологичными штаммами составила 1×10³ м.к./мл (12%) и 1×10⁴ м.к./мл (88%).

Пример 3. Получение микрогравиметрического биосенсора для индикации бруцеллезного микроба

Получали аналогично примеру 1, только вместо чумных иммуноглобулинов использовали бруцеллезные иммуноглобулины. Чувствительность метода с гомологичными штаммами составила 1×10³ м.к./мл (10%) и 1×10⁴ м.к./мл (90%).

Используемая литература

1. Бохински Р. Современные воззрения в биохимии / Пер. с англ. Е.Ю. Крынецкого и Н.Ф. Крынецкой. - М.: Мир, 1987. - 544 с., С.67.

2. Ермолаева Т.П., Калмыкова Е.П., Шашканова О.Ю. Пьезокварцевые биосенсоры для анализа объектов окружающей среды, пищевых продуктов и для клинической диагностики // Российский химический журнал (ЖРХО им. Д.И. Менделеева). - 2008. - Т. III. - №2. - С.17-29.

3. Полиэтиленимин. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p3143?lang=en…

4. Патент РФ №2287585. Опубл. 20.11.2006. Бюл. №32.

5. Патент РФ №2148259. Опубл. 27.04.2000. Бюл. №12.

6. Свидетельство на полезную модель РФ №2464. Опубл. 16.07.1996. Бюл. №7.

7. Ясуда X. Полимеризация в плазме / X. Ясуда; Пер. с англ. А.Б. Гильман, А.А. Калачева; Под ред. В.К. Потапова. - М.: Мир, 1988. - 376 с.

8. Carter R.M., Jacobs M.B., Lubrano G.J., Guilbault G.G. Piezoelectric Detection of Ricin and Affinity-Purified Goat Anti-ricin Antibody // Anal. Lett. - 1995. - V.28. - P.1379-1386.

9. Mateescu A., Wang Y., Dostaiek J., and Jonas U. Thin Hydrogel Films for Optical Biosensor Applications // Membranes 2012, 2, 40-69; doi:10.3390/membranes2010040; Membranes; ISSN 2077-0375 www.mdpi. com/journal/membranes/.