Результат интеллектуальной деятельности: ОПТИМИЗИРОВАННЫЙ ГЕН, КОДИРУЮЩИЙ РЕКОМБИНАНТНЫЙ БЕЛОК ИПФIII

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к получению генетических конструкций, содержащих оптимизированную нуклеотидную последовательность, которая кодирует рекомбинантный белок ИПФIII.

Вирусный гепатит С (ВГС) является основной причиной хронических болезней печени, таких как цирроз и гепатоклеточная карцинома. ВГС является одной из основных проблем мирового здравоохранения, около 3% населения планеты страдают хроническим ВГС. В настоящее время терапия ВГС основана на использовании интерферонов I типа, в первую очередь интерферонов альфа 2а и 2b. Однако эффективность лечения не достигает 55%, при применении высоких доз интерферонов альфа часто проявляются побочные действия, что приводит к снижению качества жизни больных и служит причиной вынужденного прерывания курса лечения.

Одним из методов улучшения терапии ВГС может быть использование других вариантов молекул интерферонов альфа, обладающих повышенной антивирусной активностью.

Интерфероны (ИФН) представляют собой группу высокогомологичных белков, продуцирующихся различными типами клеток в ответ на вирусную инфекцию. Все ИФН одинаково эффективно взаимодействуют со своим специфическим рецептором, что запускает каскад реакций, приводящих в итоге к активации большого количества интерферон-чувствительных генов, опосредующих специфические биологические свойства ИФН. Хотя все ИФН имеют различные антивирусные свойства, только ИФН-альфа 2а/b исторически используются для анти-ВГС терапии. Исследования последних лет выявили типы ИФН, менее токсичные, чем ИФН-альфа, в частности ИФН-лямбда. Причем ИФН-лямбда имеет очень высокий анти-ВГС профиль активности.

Природный ген, кодирующий ИФН-лямбда человека, не приспособлен для эффективной экспрессии в Е. coli. Это связано с наличием редко встречающихся в Е. coli кодонов AGG и AGA для аргинина, а также с наличием последовательностей, гомологичных регуляторным участкам генов Е. coli, что приводит к прерыванию трансляции либо инициации трансляции с внутренних участков гена (SD-сайты). Совокупность этих причин приводит к низкой эффективности экспрессии (не более 5%), что не позволяет разработать коммерчески выгодную технологию получения препаратов на основе ИФН-лямбда.

Наличие неоптимальных для Е. coli кодонов характерно для всех генов, кодирующих интерфероны. Для преодоления этой проблемы используются оптимизированные гены, кодирующие целевые белки. В патенте RU №2354703 описана оптимизированная последовательность гена, кодирующая IL-21 (прототип). Кодоны аминокислот использованы исходя из частоты встречаемости, так, для серина использован кодон AGC, причем даже для стартовой аминокислоты. Опыт заявителя свидетельствует, что для серина нужно брать кодоны ТСТ (как правило) или ТСС. Первые десять кодонов чрезвычайно важны для эффективной экспрессии и заявитель предлагает иной нуклеотидный состав стартового участка.

Однако для лечения ВГС препараты интерферонов вводятся парентерально. В связи с коротким периодом полувыведения интерфероны необходимо вводить каждый второй день при высоких дозах. Высокие дозы вызывают многочисленные побочные эффекты и приводят к образованию аутоантител. Эти антитела снижают эффективность, а то и заставляют прерывать курс лечения. Общий процент схода при ИФН-терапии ВГС чрезвычайно высок. Необходимо было разработать методы, увеличивающие время жизни интерферона в цитоплазме. Это достижимо путем увеличения физического объема (гидродинамического радиуса) для замедления процессов фильтрации из плазмы крови сквозь поры почечных канальцев. Укрупнение молекулы возможно путем создания нуклеотидных последовательностей, кодирующих интерферон и молекулу-стабилизатор. Такими молекулами могут быть долгоживущие белки крови человека или искусственные полипептидные молекулы, как правило, состоящие из заряженных аминокислот и остатков серина с глицином.

Поэтому задачей изобретения было разработка рекомбинантного белка интерферона лямбда для терапии ВГС, что позволит преодолеть недостатки существующих препаратов интерферонов альфа.

Заявителем разработана и получена нуклеиновая кислота, кодирующая рекомбинантный белок интерферон лямбда, представленный SEQ ID NO: 2, и характеризующаяся нуклеотидной последовательностью с SEQ ID NO: 1. А также Клетка Е. coli BL-30-L для продукции рекомбинантного белка интерферона лямбда с SEQ ID NO: 2, полученная путем трансформации клеток E. coli BL(DE3) плазмидой рЕТ30а, содержащей нуклеиновую кислоту по п. 1.

Нуклеотидная последовательность клонирована в плазмиду рЕТ30а, в результате получена рекомбинантная плазмида p30-L. Рекомбинантной плазмидой p30-L были трансформированы клетки Е. coli штамма BL21(DE3), получен стабильный штамм-продуцент Е. coli BL-30-L.

Технический результат заявленного изобретения заключается в том, полученная генетическая конструкция - нуклеиновая кислота, представленная SEQ ID NO: 1, позволяет эффективно синтезировать в клетках E. coli рекомбинантный белок интерферон лямбда с SEQ ID NO: 2, обладающий противовирусной активностью, в количестве более 30% от суммарного клеточного белка.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Электрофорез клонов E. coli BL21(DE3), трансформированных плазмидой р30-L после индукции. Стрелкой отмечен целевой продукт - рекомбинантный лямбда человека. Трек 1 - соответствует штамму-продуценту BL-30-L.

Фиг. 2. Хроматографический профиль прохождения рекомбинантного белка лямбда через SP-Sepharose. Мажорный пик соответствует выходу рекомбинантного белка лямбда.

Фиг. 3. Хроматографический профиль элюции рекомбинантного белка лямбда с аналитической колонки Kromasil 300-5С18.

Фиг. 4. Электрофорез клеточных лизатов, проведенных ферментаций. Треки 1 - стандарты молекулярных весов, треки 2-9 соответствуют ферментациям 1-8. Стрелкой отмечено положение рекомбинантного белка интерферона лямбда в геле.

ИЗОБРЕТЕНИЕ ИЛЛЮСТРИРУЮТ ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1. ОПТИМИЗАЦИЯ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

Кодоны нуклеотидной последовательности, кодирующей рекомбинантный белок лямбда, были оптимизированы для экспрессии в клетках Е. coli путем замены на кодоны, часто встречаемые в геноме Е. coli K12. Частота использования кодонов в геноме Е. coli взята из: Y Nakamura, K Wada, Y Wada, Н Doi, S Kanaya, T Gojobori, and T Ikemura. Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases. Nucleic Acids Res. 1996 Jan 1; 24(1): 214-215.

Дополнительно часть кодонов CTG, кодирующих лейцин, была заменены на кодоны ТТА или TTG, все кодоны AGC, кодирующие серин, были заменены на кодоны ТСТ или ТСС. Замены были введены для того, чтобы ликвидировать внутренние SD-сайты. Разработанная оптимизированная нуклеотидная последовательность представлена SEQ ID NO: 1.

ПРИМЕР 2. ПОЛУЧЕНИЕ ПЛАЗМИДЫ P30-L

Оптимизированную нуклеотидную последовательность, кодирующую рекомбинантный белок лямбда, гидролизовали ферментами рестрикции NdeI и HindIII. Коммерческую плазмиду рЕТ30а также гидролизовали ферментами рестрикции NdeI и HindIII. Продукты гидролиза разделяли с помощью электрофореза в 1%-ном агарозе, продукты выделяли из геля, объединяли и лигировали с помощью Т4 ДНК-лигазы. Лигазной смесью трансформировали клетки XL-1, высевали на чашку Петри и инкубировали 16 часов при 37 С. Выросшие клоны анализировали на присутствие целевой плазмиды методом ПЦР. Клоны, содержащие рекомбинантную плазмиду, выращивали, из полученной биомассы выделяли целевой продукт - плазмиду р30-L.

ПРИМЕР 3. ПОЛУЧЕНИЕ ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА

Плазмидой р30-L трансформировали клетки Е. coli штамма BL21(DE3), высевали на чашку Петри и инкубировали 16 часов при 37°С. Выросшие клоны анализировали на экспрессию целевого белка методом электрофореза в ПААГ. Клоны, экспрессирующие наибольшее количество белка (Фиг. 1), были отобраны как штамм-продуцент BL-30-L. Клетки штаммов-продуцентов выращивали и хранили при -70°С.

ПРИМЕР 4. ВЫДЕЛЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА

Клетки штамма-продуцента пересевали в культуральную колбу с 200 мл LB, содержащим 25 мг/мл канамицина. Культура выращивалась на шейкере при 280 об/мин при температуре 37°С до достижения оптической плотности значения OD585=0,8E. Индукция экспрессии белка проводилась добавлением IPTG до концентрации 1 mM. Культура дополнительно культивировалась 4 часа, далее клетки осаждались центрифугированием при 5000 g. Осадок клеток лизировали в 8М мочевине и обрабатывали на ультразвуковом дезинтеграторе. Лизат клеток центрифугировали при 20000 g 2 часа. Супернатант фильтровали через колонку с Q-Sepharose. Фракцию, не связавшуюся с данным сорбентом, хроматографировали на SP-Sepharose в градиенте NaCl (стартовый буфер: 20 mM TrisHCl рН 6.8, 20 mM NaCl, итоговый буфер 20 mM TrisHCl рН 6.8, 400 mM NaCl). Хроматографический профиль представлен на Фиг. 2. Фракции, содержащие целевой продукт, объединяли и диализовали в 10 mM уксусную кислоту. Чистоту продукта анализировали методом ВЭЖХ (Фиг. 3). Биологическая активность выделенного рекомбинантного белка интерферона лямбда в системе MDBK/VSV составила 2,1*10⁹ Ед/мкмоль. Последовательность рекомбинантного белка интерферона лямбда представлена SEQ ID NO: 2.

ПРИМЕР 5. Анализ наличия рекомбинантного белка интерферона лямбда в культурах клеток

По итогам измеряли оптическую плотность культуральной среды и массу бактериальных клеток после центрифугирования. Полученные результаты отражены в таблице 1.

Наличие и количество рекомбинантного белка интерферона лямбда определяли методом электрофореза в ПААГ. На рисунке 13 представлены гели после проведенного электрофореза всех ферментаций. Наносились клетки, находящиеся в 10 мкл культуры. На фиг. 4 видна однородность белкового спектра во всех ферментациях, кроме ферментации №4 (трек №5). Биомасса данной ферментации не использовалась для дальнейших работ. Биомассы ферментаций 1-3 и 5-8 (треки 2-4 и 6-9) были объединены. Согласно оценке общего количества рекомбинантного белка интерферона лямбда можно сделать заключение, что его масса (до начала хроматографической очистки и рефолдинга) составляет 2,23 г (9% по массе от высушенной биомассы согласно данным электрофореза). Получают рекомбинантный белок не менее 95%-ной электрофоретической чистоты. Эффективность экспрессии рекомбинантного белка с SEQ ID NO: 2 составила более 30%.

ПРИМЕР 6. Методика оценки противовирусной активности рекомбинантного белка интерферона лямбда

Оценка противовирусной активности рекомбинантного белка интерферона лямбда осуществлялась с использованием вируса везикулярного стоматита (VSV) штамм indiana. VSV является представителем семейства Rhabdoviridae рода Vesiculovirus и имеет РНК геном отрицательной полярности размером 11 т.п.н., который кодирует пять структурных белков: нуклеокапсида (N), фосфопротеина (Р), матриксный белок (М), гликопротеин (G) и большой полимеразный белок (L). Существуют два серотипа VSV Нью-Джерси (VSV-NJ) и Индиана (VSV-I). Имеются некоторые клинические различия между серотипами; Нью-Джерси в целом производит более тяжелые клинические изменения и имеет более короткий инкубационный период. Поэтому VSV-I является удобной и безопасной моделью для изучения противовирусных свойств различных препаратов.

Для оценки противовирусных свойств полученного рекомбинантного белка клетки линии MDBK (клетки эмбриональной почки быка) засевались в 96-луночный планшет в количестве 1×104 кл/лун в 100 мкл полной среды ДМЕМ (Gibco) с последующим инкубированием при 37°С в 5% CO₂ атмосфере до образования монослоя (примерно 1 сут). Полная среда ДМЕМ была заменена на 100 мкл поддерживающей среды ДМЕМ, содержащей исследуемые препараты в различных концентрациях (восемь двоичных разведений).

В качестве положительного контроля использовали восемь двоичных разведений коммерческого IFN-I (с 1:1×105 по 1:128×10⁵) и коммерческого препарата IL-29 человека (R&D). В качестве отрицательного контроля использовали соответствующие концентрации сывороточного альбумина человека (HSA), а также поддерживающую среду ДМЕМ без добавления каких-либо препаратов. Далее клетки с исследуемыми препаратами и контрольными образцами инкубировались при 37°С в 5% CO₂ атмосфере в течение 1 сут. Затем в каждую лунку было добавлено 100 ЛД50 вируса VSV с последующим инкубированием при 37°С в 5% CO₂ атмосфере в течение 1 сут до появления цитопатического эффекта. Цитопатическое действие VSV оценивалось с помощью световой микроскопии.

Протективное действие препаратов оценивалось в сравнении с контрольными образцами: IFN-I, IL-29, которые обладают доказанными противовирусными эффектами. Противовирусная активность препаратов (ЕС50) выражалась как концентрация препарата, обеспечивающая 50%-ный протективный эффект и рассчитывалась по формуле Спирмена-Кербера:

где ЕС50 - концентрация препарата, оказывающая 50%-ный противовирусный эффект;

Dmax - двоичный логарифм разведения, выше которого произошла 100%-ная защита;

d - двоичный логарифм шага разведения (1 в случае двоичного титрования);

n - количество лунок на каждую дозу препарата (4);

p - количество лунок, давших защиту в Dmax и в последующих разведениях.

Противовирусная активность препаратов рекомбинантного белка интерферона лямбда

Первоначально был проведен скрининг 73 полученных образцов и с использованием модели MDBK/VSV была рассчитана протективная концентрация ЕС50. Как оказалось, 19 из 73 препаратов обладали выраженной противовирусной активностью (отмечено серым цветом в таблице 2). Значения ЕС50 для рекомбинантного белка интерферона лямбда варьировали от 1,5 до менее чем 0,4 нг/мл, что значительно больше, чем коммерческий препарат сравнения IL-29.

После проведения первичного скрининга 73 полученных образцов из 19 активных вариантов для более детального изучения было отобрано 14. Были проведены дополнительные эксперименты и рассчитана ЕС50 для каждого из вариантов (таблица 3). Для большинства препаратов, за исключением «7-4», значения ЕС50 находились в пределах ≈ 500 пг/мл, в то время как для препарата сравнения IL-29 ЕС50=66,5 нг/мл. Таким образом, можно заключить, что полученный рекомбинантный белок лямбда с SEQ ID NO: 2 на модели MDBK/VSV по своей противовирусной активности не уступает аналогичным коммерческим препаратам сравнения.

--->

Перечень последовательностей

<110> ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России

<120> «ОПТИМИЗИРОВАННЫЙ ГЕН, КОДИРУЮЩИЙ РЕКОМБИНАНТНЫЙ БЕЛОК ИПФIII»

<160> NUMBER OF SEQ ID NOS: 2

<210> SEQ ID NO 1

<211> 1126

<212> DNA

<213> artificial

<400> SEQUENCE 1:

CATATGTGTGATCTGCCGCAGACCCATTCTCTGGGTAACCGTCGTGCACTGATCCTCTTGGCTCAGAT GCGCGTAAAACAAATTGAATCTAAAACTAAATTCCAAGAAGCATTAGATGCTGCAGGTGATAAACTGG TGGTTGTGGATTTCTCTGCAACCTGGTGCGGTCCGTGCAAGATGATCAAACCGTTCTTTCACTCTGCA TCTGAGAAATACTCCAACGTGATCTTCCTGGAAGATGTTGACGATTGCCAGGATGTTGCATCTGAGTG CGAAGTGAAATGCATGCCGACCTTCCAGTTCTTCAAGAAAGGTCAGAAAGTTGGCGAGTTCTCTGGTG CTAACAAAGAGAAGCTGGAAGCGACCATCAACGAACTGGTTGGTGGTTCTGGCGGTTCCAAAGGTGGC GGTTCCGGTGGTGGTAAATCTAAAGGCGGTGGCAGCGGTGGCTTGAAACTCCTGAAGTCCAAAGGTAG CTCTGGCGGCAGCGGTAAAGGTTCCGGCAAAGGTTCCAAAGGTGGTGGTTCCCACCACCACCATCACC ACGGTAGCGGCGGCTCTGGTTCCGGTAGCGGATCCCCAGTTCCGACTTCTAAACCGACTACCACTGGC AAAGGCTGCCACATCGGTCGTTTCAAATCTCTGTCTCCACAAGAACTGGCATCTTTCAAGAAAGCTCG TGATGCACTGGAAGAGTCTCTGAAACTGAAAAACTGGTCTTGTTCCTCTCCAGTGTTCCCAGGCAACT GGGATCTGCGTCTCTTGCAGGTTCGTGAACGTCCGGTGGCACTGGAAGCTGAGTTGGCACTGACTCTC AAAGTGCTGGAGGCTGCAGCTGGTCCAGCACTGGAAGATGTGCTCGATCAGCCGCTGCATACTCTGCA CCATATCCTGTCTCAGCTCCAAGCTTGCATCCAGCCGCAACCAACTGCAGGTCCACGTCCGCGCGGTC GTCTGCACCATTGGTTGCATCGTCTGCAGGAAGCTCCGAAGAAAGAGTCTGCAGGCTGCTTGGAAGCA TCTGTGACCTTCAACCTGTTTCGTCTGCTGACTCGTGATCTCAAATACGTGGCAGATGGTAACCTGTG CTTGCGCACCTCTACTCATCCAGAGTCTACTTAAGCTT

<210> SEQ ID NO 2

<211> 372

<212> AA (amino acid)

<213> artificial

<400> SEQUENCE 2:

MCDLPQTHSLGNRRALILLAQMRVKQIESKTKFQEALDAAGDKLVVVDFSATWCGPCKMIKPFFHSAS EKYSNVIFLEDVDDCQDVASECEVKCMPTFQFFKKGQKVGEFSGANKEKLEATINELVGGSGGSKGGG SGGGKSKGGGSGGLKLLKSKGSSGGSGKGSGKGSKGGGSHHHHHHGSGGSGSGSGSPVPTSKPTTTGK GCHIGRFKSLSPQELASFKKARDALEESLKLKNWSCSSPVFPGNWDLRLLQVRERPVALEAELALTLK VLEAAAGPALEDVLDQPLHTLHHILSQLQACIQPQPTAGPRPRGRLHHWLHRLQEAPKKESAGCLEAS VTFNLFRLLTRDLKYVADGNLCLRTSTHPEST

<---